Diese Methode ist wichtig, da kein anderes Protokoll es erlaubt, neu synthetisierte RNA in einer so kurzen Zeitskala zu analysieren und Puls-Chase-Experimente mit einem so kurzen Puls zu ermöglichen. Dieses Protokoll funktioniert gut mit Proteinmangel, wie dem Best AID 4U-Protokoll. Der Hauptvorteil ist, dass der Hintergrund niedrig ist.
Dies ermöglicht die kurzen Etikettierungszeiten, indem fast die gesamte nichtthiolierte RNA entfernt wird. Das geschriebene Protokoll beschreibt auch viele verschiedene Arten von Experimenten, die durchgeführt werden könnten und wie sie in diese Technik integriert werden können. Um dieses Verfahren zu beginnen, wachsen Hefe in YMM Medium auf eine OD 600 zwischen 0,6 und 0,8.
In einer Dunstabzugshaube ein Methanol, das 30 bis 50 % des vorgesehenen Probenvolumens entspricht, einem 50-Milliliter-Rohr hinzufügen. Schließen Sie die Rohre fest, beschriften Sie sie und legen Sie sie auf Trockeneis, um sie abzukühlen. Als nächstes zwei Milliliter-Rohre für die langfristige Lagerung der Proben beschriften und zum Abkühlen auf Eis legen.
Zirkonia-Perlen zu den beiden Milliliter-Röhren hinzufügen. Mindestens einen Milliliter Wasser pro Probe auf Eis abkühlen lassen. Wenn eine S.pombe Spitze der Kultur hinzugefügt werden soll, legen Sie ein Aliquot von thiolierten S.pombe Zellen auf Eis zum Tauen.
Wirbel das aufgetaut aliquot und fügen Sie es der Kultur. Dann 4tU in die Kultur zu einer Konzentration von 10 Mikromolar hinzufügen und kräftig mischen. Thio-Label für eine Zeitzwischen 15 Sekunden und fünf Minuten.
Nehmen Sie in regelmäßigen Abständen Muster der Kultur bis zum Ende des Zeitkurses. Jede Probe in einen der vorbereiteten Zentrifugenröhrchen geben, die Methanol enthalten. Versiegeln Sie jedes Rohr, schütteln Sie gründlich zu mischen, und legen Sie auf Trockeneis.
Sobald alle Proben genommen sind, legen Sie sie alle auf Eis. Stellen Sie sicher, dass keine der Proben eingefroren ist. Wenn irgendwelche eingefroren haben, wärmen Sie sie sanft in der Hand, während Sie ständig invertieren.
Zentrifugieren Sie die Zellen bei 3 000 mal g und bei vier Grad Celsius für zwei Minuten, um die Zellen zu pellet. Gießen Sie die Flüssigkeit ab und setzen Sie das Pellet in mindestens einem Milliliter eiskaltem Wasser wieder auf, indem Sie kräftig nach oben und unten pfeifen. Übertragen Sie die Suspension auf das vorbereitete Schraubverschlussrohr und legen Sie das Rohr auf Eis.
Zentrifugieren Sie die Proben kurz mit einer Geschwindigkeit von mehr als 13.000 mal g, um die Zellen neu zu pellet. Legen Sie sie dann wieder auf Eis und entfernen Sie die Flüssigkeit. Fügen Sie zunächst 400 Mikroliter AE-Puffer, 40 Mikroliter SDS und 800 Mikroliter Phenol bei einem niedrigen pH-Wert hinzu.
Resuspend durch Wirbeln für 10 Sekunden. Dann lysieren Sie die Zellen in einem Homogenisator für drei zwei Minuten Bursts bei der niedrigsten Leistungseinstellung. Lassen Sie die Proben zwischen homogenisierungsimpulsen zwei Minuten auf Eis.
Legen Sie die lysierten Zellen für fünf Minuten auf Trockeneis, bis sie sich verfestigt. Als nächstes verwenden Sie eine Mikrozentrifuge, um die Zellen mit einer Geschwindigkeit von mehr als 13.000 mal g für fünf Minuten bei Raumtemperatur zu drehen. Führen Sie danach die Phenolchloroformextraktion und die Chloroformextraktion wie im Textprotokoll beschrieben durch.
Fügen Sie zwischen 1/3 bis 1/2 des Volumens von 10 Mollithiumchlorid und mischen, um die RNA zu fällen. Zentrifuge mit einer Geschwindigkeit über 13.000 mal g für fünf Minuten. Entfernen Sie die Flüssigkeit, und drehen Sie die Probe kurz neu, um die Dregs zu entfernen.
Dann waschen Sie das Pellet mit 300 bis 500 Mikroliter 70% Ethanol. Zentrifugieren Sie das gewaschene Pellet kurz, und entfernen Sie alle verbleibenden Ethanol. Lösen Sie das RNA-Pellet in 90 Mikroliter TE bei einem pH-Wert von 7,0 wieder auf, indem Sie beim Schütteln bei 65 Grad Celsius erhitzen.
Nach Prüfung auf vollständige RNA-Löslichkeit, übertragen Sie die Suspension auf eine 0,2 Milliliter-Röhre. Zunächst biotinylat durch Zugabe von 10 MikroliterHPDP-Biotinlösung in die RNA und gründlich mischen. Inkubieren Sie im Dunkeln bei 65 Grad Celsius für 15 bis 30 Minuten.
Als nächstes bereiten Sie eine kleine Harzvolumen, Größe Ausschluss Spalte, um die nicht inkorporierte Biotin auszuschließen. Entfernen Sie das untere Tag der Spalte, lösen Sie die Kappe, und legen Sie die Spalte in ein Zentrifugenrohr mit zwei Millilitern. Zentrifuge bei 1, 500 mal g für eine Minute, um den Puffer auszuspülen und den Durchfluss zu verwerfen.
Fügen Sie dann vorsichtig 0,3 Milliliter TE an den oberen Rand der Säule und drehen Sie wieder unter den gleichen Bedingungen. Übertragen Sie die gewaschene Säule in ein frisches 1,5-Milliliter-Rohr. Wenn die Beispielinkubation abgeschlossen ist, fügen Sie das Beispiel am oberen Rand der Spalte hinzu.
Zentrifuge bei 1,500 mal g für zwei Minuten, so dass die biotinylierte RNA-Probe am Boden der Röhre. Verwerfen Sie die Spalte. Und fügen Sie 1/3 bis 1/2 Volumen von 10 Mol Lithiumchlorid in das Rohr mit der Probe.
Mischen, um die RNA neu zu fällen. Lösen Sie zunächst die RNA in 200 Mikroliter DEPC-behandeltem Wasser wieder auf. Messen Sie die RNA-Konzentration und berechnen Sie Volumen für jede Probe, die für alle Proben die gleichen RNA-Mengen ergeben.
Fügen Sie diese Menge an RNA in ein frisches Rohr und fügen Sie DEPC-behandeltes Wasser wieder bis zu einem Gesamtvolumen von 200 Mikrolitern hinzu. Wenn eine Probe bei Raumtemperatur ist, fügen Sie 25 Mikroliter 10 x NaTM Puffer, 25 Mikroliter eines Molaren-Natriumphosphats und 2,5 Mikroliter 10%SDS hinzu. Mischen Sie gründlich, und Zentrifuge sanft bei etwa 100 mal g für weniger als 30 Sekunden.
Bereiten Sie zwei Milliliter Perlenpuffer für jede Probe mit einem x NaTM Puffer, 0,1 Mol-Natriumphosphat und 0,1%SDS vor. Fügen Sie 50 Mikroliter Streptavidin Perlen zu einem niedrigen Retention 1,5 Milliliter Rohr. Legen Sie das Rohr auf das Magnetgestell und warten Sie, bis sich die Perlen absetzen.
Entfernen Sie dann die Flüssigkeit durch Aspiration. Um die Perlen zu waschen, fügen Sie 200 Milliliter Perlenpuffer und Wirbel hinzu, bis das Perlenpellet vollständig resuspendiert ist. Zentrifugieren Sie das Rohr maximal fünf Sekunden lang bei ca. 100 mal g.
Legen Sie das Rohr in das magnetische Rack, damit die Perlen vom Magneten erfasst werden können. Entfernen Sie die Flüssigkeit durch Aspiration, wenn es eine kleine Anzahl von Proben gibt. Gießen Sie die Flüssigkeit ab und dann aspirieren, wenn es viele Proben gibt.
Block mit 200 Mikroliter Nadenpuffer, 10 Mikroliter Glykogen und 2,5 Mikroliter tRNA. Inkubieren Bei Raumtemperatur für 20 Minuten, während rotierende Ende über Ende mit moderater Geschwindigkeit. Danach entfernen Sie die Flüssigkeit und waschen Sie sie erneut, wie im Textprotokoll beschrieben.
Setzen Sie die Perlen in der Probe wieder auf und inkubieren Sie bei Raumtemperatur 30 Minuten, während Sie sich drehen. Bereiten Sie während dieser Inkubation für jede Probe eine frische 1,5-Milliliter-Röhre zu. Fügen Sie 1/10 Volumen von drei Molaren-Natriumacetat bei pH 5,3 und 20 Mikrogramm Glykogen hinzu.
Zentrifuge bei ca. 100 mal g für drei Sekunden. Entfernen Sie die ungebundene RNA aus den Perlen und waschen Sie sie wie im Textprotokoll beschrieben. Um die RNA zu entlarven, fügen Sie den Perlen 50 Mikroliter frisch zubereitetes 0,7 Molaren-Beta-Mercaptoethanol hinzu.
Nach Wirbeln und Zentrifugieren die Gülle in das magnetische Rack legen. Die RNA-haltige Lösung in die vorbereiteten 1,5 Milliliter Zentrifugenröhren pipette. Elute noch einmal wie zuvor beschrieben.
Legen Sie die Probe dann wieder in das magnetische Rack, um Restperlen aus der eluierten RNA zu entfernen und die Flüssigkeit in ein frisches, niedrig bindendes 0,5-Milliliter-Zentrifugenrohr zu übertragen. Mischen Sie die Probe. Und dann fügen Sie 2,5 Volumen Ethanol, um nsRNA zu niederschlagen.
Nach dem Mischen und Inkubieren zentrieren Sie mit einer Geschwindigkeit von mindestens 13.000 mal g und bei vier Grad Celsius für 20 Minuten. Typische Erträge für snRNA, die mit diesem Protokoll wiederhergestellt werden, werden hier gezeigt. Beachten Sie, dass die RNA-Wiederherstellung zum Zeitpunkt Null ein sehr kleiner Teil davon ist, der sich aus längeren Zeitpunkten erholt hat, wobei nur 0,3 Mikrogramm RNA aus etwa 30 Milliarden Zellen zurückgewonnen werden.
Nach nur 30 Sekunden Etikettierung wird jedoch mehr als doppelt so viel RNA aus der gleichen Anzahl von Zellen gesammelt. In der Bioanalyse-Spur können unsere RNA-Vorläufer als EinSpitzen in der Nähe von 1 000 Nukleotiden und als Doublet von Peaks bei 1, 700 bis 1 800 Nukleotiden gesehen werden. Die Fülle dieser Zwischenprodukte nimmt zu, wenn die Thiolation anhält.
Die Thiolation wird dann mit Proben durchgeführt, die in 15-Sekunden-Intervallen ab Beginn der Thio-Etikettierung entnommen werden, und die Verarbeitung des ACT1-RNA-Transkripts wird überwacht. Wie man sieht, werden Pre-mRNA und Lariate auch nach nur 15 Sekunden Etikettierung erzeugt. Nach etwa 45 Sekunden bis zu einer Minute erreicht die Menge an Lariaten und Pre-mRNA das Gleichgewicht, wobei so viele dieser RNA-Arten durch Transkription erzeugt werden, wie durch Spleißen verarbeitet werden.
Die schwierigsten Schritte sind die, die die Perlen, Waschen und Blockieren. Achten Sie darauf, die Perlen nicht zu verlieren oder sie austrocknen zu lassen. Sobald Sie neu synthetisierte RNA gereinigt haben, können Sie jedes traditionelle RNA-Analyseverfahren verwenden.
Es wird empfohlen, die RNA auf einem Bioanalyzer oder ähnlichem auszuführen. Danach verwenden wir normalerweise QPCR und RNA-Seq, um die RNA zu analysieren. Diese Methode erwies sich als ideal für die Analyse der Kinetik der RNA-Verarbeitung.
Die gefährlichsten Schritte sind diejenigen, die Phenol und Chloroform in der RNA-Extraktion verwenden. Jedes Mal, wenn Sie diese Chemikalien in einem nicht versiegelten Behälter verwenden, tun Sie dies in einer Dunstabzugshaube und tragen Sie geeignete Schutzkleidung, einen Labormantel und Handschuhe. Achten Sie besonders darauf, dass sich im Gewinde des Schraubverschlussrohrs keine Zirkonia-Perlen befinden, da dies zu einem Leck führt.
