Die biologische Stabilisierung von DNA-Nanostrukturen ist für zukünftige In-vivo-Anwendungen, wie z. B. die gezielte Medikamentenabgabe, von entscheidender Bedeutung. Jedoch, DNA wird im Körper durch verschiedene Enzyme abgebaut. Hier präsentieren wir eine Beschichtungstechnik, die DNA-Nanostrukturen vor enzymatischem Abbau schützt.
Die Hauptvorteile sind, dass unsere Beschichtung ungiftige Verbindungen umfasst, die bereits in lebenden Organismen verwendet werden und dass die Funktionalisierung der Oberfläche möglich bleibt. Diese Funktionalisierung ist wichtig, um molekulare Sensoren für die Zielerkennung und Schalter für die Freisetzung von Medikamentenladungen zu integrieren. Polykationenbeschichtungen erhöhen die zelluläre Aufnahme von verkapselten DNA-Origami-Strukturen deutlich, so dass diese Methode die Tür für Anwendungen von DNA-Origamis in Diagnostiken und Therapeutika öffnen kann.
Die zelluläre Aufnahme ist auch für potenzielle Genabgabeanwendungen der DNA-Nanotechnologie erforderlich. Ich denke, dass die Methode recht einfach ist und leicht zu meistern ist. Zu Beginn messen Sie die Konzentration der gereinigten DNA-Origami.
Verwenden Sie zwei Mikroliter TB-Puffer als Rohling, um das ultraviolette Spektralphotometer zu kalibrieren. Und dann messen SIE die DNA-Origami-Konzentration bei 260 Nanometern. Berechnen Sie dann die Phosphatmengen in der gereinigten DNA-Origami-Lösung unter Verwendung von Formel zwei, wie in Manuskript beschrieben.
Bereiten Sie 15 Mikroliter der DNA-Origami-Struktur vor, indem Sie ein Nanomol Phosphat mit TB-Puffer zur Verdünnung einschließen. Fügen Sie 13,2 Mikroliter zu TB zu 1,8 Mikroliter Chitosan hinzu. Und fügen Sie 15 Mikroliter der Chitosan-Lösung zu 15 Mikroliter der DNA-Origami hinzu, um ein DNA-Origami-Chitosan-Polyplex mit einem N/P-Verhältnis von acht zu entwickeln.
Bereiten Sie weiterhin Polyplexe verschiedener N/P-Verhältnisse vor, indem Sie Berechnungen verwenden, wie im Manuskript beschrieben. Bereiten Sie 80 Millimeter eines Rohres für 2%Agarose-Gel vor. Fügen Sie 352 Mikroliter 2,5 molares Magnesiumchlorid hinzu und färben Sie es dann mit 10 MikroliterN DNA-Gel-Färbung vor.
Gießen Sie die Gellösung in eine trockene Gelbox. Legen Sie einen Gelelektrophoresekamm ein und lassen Sie ihn bei Raumtemperatur 15 bis 30 Minuten erstarren. In der Zwischenzeit ergänzen Sie den Laufpuffer mit 11 Millimolar Magnesiumchlorid.
Mischen Sie 10 bis 20 Mikroliter jeder Probe mit 20% des 6X Ladepuffers. Laden Sie die Proben in die Agarose-Gelbrunnen, einschließlich einer nackten DNA-Origami als Kontrolle. Führen Sie das Gel bei 70 Volt bei Raumtemperatur für zweieinhalb bis drei Stunden.
Verwenden Sie dann einen UV-Scanner, um das Gel zu visualisieren. Um einen DNase I-Schutztest durchzuführen, fügen Sie vier Mikroliter jedes Polyplexs, verglichen mit unterschiedlichen N/P-Verhältnissen, 1,5 Mikroliter 10-Fach-DNase-I-Puffer, 8 Mikroliter TB und 1,5 Mikroliter DNase I zu einem separaten 2-Milliliter-PCR-Rohr hinzu. Dann inkubieren Sie das gleiche bei 37 Grad Celsius in einem Thermocycler für 24 Stunden.
Um DNase I zu verdauen, fügen Sie zwei Mikroliter von 20 Milligramm pro Milliliter Proteinase K hinzu und brüten für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius in einem Thermocycler. Dann, um die Kern-DNA-Nanostrukturen zu entwirren fügen 3,6 Mikroliter von 50 Milligramm pro Milliliter 40 Kilodaltons Dextran Sulfat. Verwenden Sie dann diese Proben und frische DNA-Origami als Kontrolle, um Agarose-Gel-Elektrophorese durchzuführen, wie zuvor beschrieben.
Verbrauchen Sie das Band, das geladenen Proben aus dem Gel entspricht. Um die DNA-Origami zu extrahieren, verwenden Sie eine Squeeze Freeze Extraktionssäule und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers und setzen Sie mit der negativen Fleckentransmission Selektronenmikroskopie-Bildgebung fort, wie im Manuskript beschrieben. Mischen Sie 6,5 Mikroliter gereinigten 36 Nanomolar HRP-NR mit 6,5 Mikroliter Polykationen in unterschiedlichen Konzentrationen.
Um einen Polyplex bei N/P-Verhältnissen von eins, zwei, vier, zehn und 20 zu erstellen, bereiten Sie eine leere Gruppe vor, indem Sie 6,5 Mikroliter destilliertes Wasser mit 6,5 Mikroliter Polykationen verschiedener Konzentrationen mischen, die den N/P-Verhältnissen von eins, zwei, vier, 10 und 20 entsprechen. Dann fügen Sie 12,5 Mikroliter von jeder dieser vorbereiteten Lösungen zu einem separaten Brunnen einer 96 Brunnenplatte. Dann fügen Sie 72,5 Mikroliter HEPES Puffer zu jedem Brunnen und mischen.
Fügen Sie 10 Mikroliter 15 Millimolar ABTS und dann 5 Mikroliter eines 12 Millimolaren Wasserstoffperoxids zu jedem Brunnen hinzu und mischen Sie sie durch Pipettieren nach oben und unten. Verwenden Sie schließlich einen Multimode-Plattenleser, um die Absorption mit 421 Nanometern über vier Stunden zu messen. Nach der Analyse von Polyplexen mit einem Gel-Retardierungs-Assay gab es eine Verschiebung in der nackten Nanostruktur hin zur Kathode, wahrscheinlich aufgrund der Gegengewichtung der negativen Ladung von Phosphatgruppen nach Bindung an die Polykationen und der Größenzunahme des Komplexes.
Wenn eine zusätzliche Menge an Polyanionen, wie Dextransulfat, hinzugefügt wurde, wurde die Polyplexbildung umgekehrt. Dextransulfat mit höherem Molekulargewicht erwies sich im Vergleich zu einem niedrigeren Molekulargewicht als effizienter. Nach der Analyse der Polyplexe mittels negativer Fleckentransmissionselektronenmikroskopie zeigten Mikrographen nackte DNA-Origami-Nanostrukturen, lineare Polyethylenimin-Polyplexe nach der Entkapselung, Chitosan-Polyplexe, Bilder von nackten und geschützten DNA-Origami, die Magnesiumabbau, enzymatischem Abbau und Serumverdauung ausgesetzt waren.
In Gegenwart von DNase I wurden nach zwei Stunden nackte Nanostrukturen vollständig verdaut, während die linearen Polyethylenimin-Polyplexe von Chitosan-verkapselten DNA-Origami in Gegenwart von 10 Einheiten pro Milliliter DNase I.Linear Polyethylenimin-Polyplexe die DNA-Nanostrukturen effizienter als Chitosan schützen. Wenn das N/P-Verhältnis des Polyplex erhöht wird, war die DNA-Verdauung geringer. Nach der Beschichtung des Enzyms oder nach stärker funktionalisierten DNA-Origami mit linearen Polyethylenimin-Polyplexen und Chitosan bei Variante N/P-Verhältnissen wurde keine nennenswerte Störung der enzymatischen Aktivität beobachtet.
Auf der anderen Seite veränderte sich die Kinetik des HRP-Enzyms dramatisch nach der Bindung an die DNA-Origami. Es ist wichtig, mit gut gereinigten DNA-Origami-Strukturen zu beginnen. Es gibt einen stabileren Strang, der auch an Polykationen binden kann.
Sie sind schwer von den DNA-Origami-Polyplexen zu trennen. Unsere Beschichtungsmoleküle werden auch in Gentherapieanwendungen eingesetzt. Das bedeutet, dass die DNA-Nanostrukturen in Zukunft verwendet werden können, um das Genom lebender Organismen zu verändern.
Für Agarose-Gel-Färbung werden in der Regel Moleküle verwendet, die die DNA zwischenstehen und potenziell erbgutverändernd sind. Bitte befolgen Sie die Sicherheitshinweise Ihres Labors, wenn Sie DNA färben.
