Name: design and synthesis of a reconfigurable dna accordion rack
Uploaded: 2018-08-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Design and Synthesis of a Reconfigurable DNA Accordion Rack at JoVE.com

Diese Forschung wurde teilweise durch das Global Research Center Entwicklungsprogramm durch die National Research Foundation von Korea(NRF) gefördert durch das Ministerium für Wissenschaft und IKT (MSIT) (2015K1A4A3047345) und Nano· unterstützt. Material Technology Development Program durch die National Research Foundation von Korea (NRF) gefördert durch das Ministerium für Wissenschaft und IKT (MSIT) (2012M3A7A9671610). Das Institute of Engineering Research an der Seoul National University zur Verfügung gestellt Forschungseinrichtungen für diese Arbeit. Autoren erkennen Dankbarkeit gegenüber Tae-Young Yoon (Biological Sciences, Seoul National University) bezüglich der Fluoreszenz-Spektroskopie für die Bund-Analyse.

1. Aufbau der 6 von 6 DNA-Akkordeon-Rack mit CaDNAno14
<ol><li>Herunterladen und installieren CaDNAno 2.0 Software14 um ein DNA-Akkordeon-Rack zu entwerfen (CaDNAno 2.5 ist auch verfügbar auf https://github.com/cadnano/cadnano2.5). Öffnen Sie CaDNAno14 , und klicken Sie auf das Quadrat-Werkzeug fügen Sie ein neues Bauteil mit einem quadratischen Gitter.</li>
	<li>Nummer jeder Strahl des Racks, Akkordeon und zeichnen Sie auf der linken Gitter des CaDNAno14 (Abbildung 2).</li>
	<li>Klicken Sie auf das Bleistiftwerkzeug und ziehen Sie jeden Strahl auf die richtige Bearbeitungsfeld auf der CaDNAno14. Pause strahlt jede 32 bp, die für Fugen zwischen benachbarten Balken ist. Legen Sie Grundnahrungsmittel Frequenzweichen in der gleichen Position wie die Gelenke. Verwenden Sie das Tool einfügen und das Buntstift-Werkzeug in CaDNAno14 zusätzliche einsträngige Frequenzweichen haben Gelenke lassen.</li>
	<li>Klicken Sie auf das Bleistift-Werkzeug und verbinden Sie die Gelenke zu. Jeder Strahl hat sieben Gelenke.</li>
	<li>Gerüst Frequenzweichen um die einzelne Schleife die Gerüste zusammenführen, mithilfe der zuvor gemeldete Gerüst routing Algorithmus11zu generieren. Lassen Sie sich nicht die minimale bindende Domäne zwischen Gerüst und Grundnahrungsmittel Stränge werden weniger als 8 bp (Abbildung 3).</li>
	<li>Platzieren Sie die Gerüste, die nicht verwendet werden in der Baugruppe an den Scheitelpunkten auf gegenüberliegenden Seiten des Akkordeon Racks, gelegen, wie in Abbildung 3dargestellt.</li>
	<li>Klicken Sie auf das Werkzeug zu brechen. Brechen die Stränge wo Grundnahrungsmittel Stränge kreisförmige oder länger als 60 sind bp.</li>
	<li>Die DNA-Stränge Sperre zu entwerfen.<ol>
<li>Klicken Sie auf das Werkzeug zu brechen. Pause 8 bp ein Grundnahrungsmittel DNA-Region ein klebrigem Teil zu löschen 8 bp ein Grundnahrungsmittel DNA-Region. In der 6 x 6-Akkordeon-Rack gibt es 18 klebrigen Teile (Abbildung 1).</li>
		<li>Platzieren Sie Sequenzen, die umgekehrte sind an beiden Enden der Sperre Stränge komplementär zu den klebrigen Teile zu und verbinden sie durch eine Überbrückung Region, bestehend aus Poly T Stränge der gewünschten Länge (Abbildung 1 b).</li>
		<li>Für die Neukonfiguration hinzufügen 8 bp Brückenkopf Sequenzen am Ende des DNA sperrt für Strang Verschiebung. Die Brückenkopf-Sequenz verwendet, ist in Tabelle 2.</li>
		<li>Bereiten Sie Poly A Stränge, die komplementär zu der Überbrückung Region rückgängig zu machen sind.</li>
		<li>Design-Stränge, die komplementär zu der DNA-Schlösser für die Neukonfiguration Experiment rückgängig zu machen sind.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Klicken Sie auf die Sequenz-Werkzeug und klicken Sie auf Gerüst DNA. Wählen Sie das Gerüst als standard M13mp18. Klicken Sie auf das Export-Tool und speichern Sie die Sequenz im Csv-Format (Tabelle 1).</li>
</ol>(2) die Struktur mit dem OxDNA zu simulieren.
<ol><li>Downloaden Sie und installieren Sie der OxDNA16,17. Die neuesten Quellcode ist verfügbar auf https://sourceforge.net/projects/oxdna/files/.</li>
	<li>Stellen Sie Start Konfigurations-Dateien aus der CaDNAno-14 -Datei mit Python-Skript "cadnano_interface.py", die in der OxDNA16,-17 -Paket bereitgestellt wird. Die Nutzung ist wie folgt: 'Python cadnano_interface.py cadnano_file.json sq'. Jetzt werden die Topologie und Konfigurationsdatei generiert. Hinweis: Die topologiedatei enthält wie viele Stränge und Nukleotide sind in der Struktur und Informationen über Rückgrat-Backbone Verbindungen zwischen Nukleotiden. Die Konfigurationsdatei enthält allgemeine Informationen wie Zeitschritt, Energie und Boxgröße. Orientierungsinformationen wie Position Vektor, Rückgrat-Base Vektor, Normalenvektor, Velocity und Winkelgeschwindigkeit der Nukleotide ist auch enthalten (Abbildung 4).</li>
	<li>Ändern Sie die Informationen in der Topologie und Konfiguration-Datei vom CaDNAno14 zu machen, die echte strukturelle Informationen des Akkordeon Racks zu reflektieren. Alle Balken sind parallel angeordnet, wenn die Topologie und Konfiguration-Dateien von CaDNAno14 visualisiert werden. Allerdings ist das Akkordeon Rack eine Gitterstruktur, so dass der Abstand zwischen verklebten Nukleotide sind weit für Simulation (Abbildung 5).<ol>
<li>Drehen Sie und verschieben Sie jeder Strahl auf die gewünschte Gitterstruktur. Die neun Spalten auf der linken Seite in der Konfigurationsdatei sind der Position Vektor, Rückgrat-Base Vektor und Normalenvektor (Abbildung 4). Um einen Lichtstrahl zu drehen, drehen Sie alle Stellung, Rückgrat-Base und normalen Vektoren mit rotatorischen Transformation. Dann bewegen Sie einen Strahl durch Veränderung des Position Vektors um es zu finden, wie in Abbildung 5dargestellt.</li>
		<li>Entspannen Sie die Struktur mit dem Skript in das OxDNA-Paket zur Verfügung gestellt (siehe Beispiel in $oxDNA/Beispiele/RELAX_INITIAL_CONFIGURATION für weitere Informationen).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Molekulardynamik-Simulation für 10 Millionen Schritte mithilfe der entspannten Konfigurationsdatei ausgeführt. Die Nutzung ist wie folgt: '. / OxDNA < Eingabe >' speichern Daten alle 5000 oder 10000 Schritte.</li>
	<li>Visualisierung Hinweis: Die Strukturen wurden mit Cogli visualisiert.<ol>
<li>Downloaden Sie und installieren Sie die neueste Version von Cogli (https://sourceforge.net/projects/cogli1/).</li>
		<li>Führen Sie die Cogli mit der Topologie und Konfiguration Dateien aus der OxDNA-Simulation. Die Nutzung ist wie folgt: '. / cogli1 -t < topologiedatei >< Konfigurations-Datei > ".</li>
		<li>Verstecken Sie die Box mit der Taste b.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(3) Synthese der Struktur
Hinweis: Die Synthese-Methode wird von der vorherigen Protokoll15,18angepasst.
<ol><li>Erwerben Sie die gestalteten DNA-Klammern bei einem Oligonukleotid-Anbieter.</li>
	<li>Passen Sie die Konzentration von diesen DNA-Klammern zu 100 μM mit Nuklease-freies Wasser.<ol>
<li>Bündeln Sie jeder DNA-Strang, die eine "free State" Struktur in eine Röhre bildet und passen Sie die Konzentration auf 2 μM für jeden Strang.</li>
		<li>Pool DNS Sperre Stränge durch Länge und Anzahl der Sperre Orte in Röhren und passen Sie die Konzentration auf 2 μM für jeden Strang. 18, 9 und 4 Sperre Websites dienen. Fügen Sie Poly-A-Stränge, die zu überbrückenden Region bei der gleichen Konzentration sind.</li>
		<li>Pool-Stränge, die komplementär zu der DNA umzukehren sind Sperren Stränge durch Länge in Röhren und passen Sie die Konzentration auf 2 μM für jeden Strang.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie MgCl2 Lösung von 300 nM durch Mischen von 70 μL der Nuklease-freies Wasser und 30 μl 1 μM MgCl2 Lösung. Bereiten Sie eine 5 x Tris-EDTA-Lösung durch Mischen von 95 μL der Nuklease-freies Wasser und 5 μL der 100 X-Tris-EDTA-Lösung.</li>
	<li>Fügen Sie 2 μL Heftklammer DNA, 1,1 μl MgCl2 Lösung, 2 μl Tris-EDTA-Lösung, 7,6 μl der Nuklease-freies Wasser und 7,3 μL Gerüst DNA von denen die Konzentration beträgt 110 nM 20 μL des gemischten Materials zu machen. Setzen Sie die Endkonzentration des Gerüstes DNA auf 40 nM, Heften DNA zu 200 nM, MgCl2 bis 16 mM und Tris-EDTA-Lösung 0,5 X.</li>
	<li>Erhitzen Sie schnell gemischte Vorratslösung in einem Thermocycler bis 80 ° C und kühlen bis 60 ° C mit einer Rate von 4 min pro ° C und kühlen von 60 ° C bis 4 ° C mit einer Rate von 40 min pro ° C.</li>
</ol>4. Reinigung der Struktur
Hinweis: Die Proben aller Strukturen wurden vor der Analyse gereinigt. In diesem Abschnitt beschreiben wir das Protokoll der PEG Reinigung, vom früheren Literatur19angepasst ist. Die Probe kann auch durch Gelelektrophorese gereinigt werden, wie im vorherigen Literatur15,18beschrieben.
<ol><li>5 M NaCl und 100 X Tris-EDTA vorzubereiten.</li>
	<li>Bereiten Sie Niederschlag-Puffer durch das Mischen von 150 μL der PEG 8000, 500 μL 100 x Tris-EDTA und 101 μL 5 M NaCl und 249 μL der Nuklease-freies Wasser.</li>
	<li>Bereiten Sie Ziel-Puffer durch das Mischen von 5,5 μl 300 nM MgCl2 Lösung von Abschnitt 3.3, 10 μl 5 X Tris-EDTA-Lösung von Abschnitt 3.3 und 84,5 μL der Nuklease-freies Wasser.</li>
	<li>Mix 20 μL der synthetisierten Struktur aus Abschnitt 3 und 20 μL des Niederschlag-Puffer von Abschnitt 4.2. Dann drehen Sie den gemischten bestand bei 16000 X g bei 4 ° c Entfernen des Überstands und Pellet in den Zielpuffer aus Abschnitt 4.3 auflösen.</li>
</ol>(5) Neukonfiguration des Akkordeon Racks von einem "freien Staat" zu "Gesperrten Zustand"
<ol><li>Die Struktur ohne DNA-Schlösser für die Konfiguration-Experiment zu synthetisieren.</li>
	<li>Bereiten Sie DNS-Sperre Stränge aus Abschnitt 3.</li>
	<li>Fügen Sie 2 μL der DNA-Stränge der Sperre der gewünschten Länge in 20 μL der synthetisierten Struktur. Die DNA-Sperre Stränge Konzentration ist fünfmal höher als die Struktur.</li>
	<li>Inkubation der Probe für 0, 10, 25, 50 oder 100 Minuten zu sehen, wie schnell Neukonfiguration auftritt.<ol>
<li>Für die Inkubation von 100 Minuten 30 Minuten Probe bei 50 ° C inkubieren und bis zu 25 ° C mit einer Rate von 0,33 ° C/min langsam abkühlen.</li>
		<li>Für die 50-minütige Inkubation Inkubation der Probe bei 50 ° C für 15 Minuten und bis zu 25 ° C mit einer Rate von 0,66 ° C/min langsam abkühlen.</li>
		<li>Für die 25 minütige Inkubation 7,5 Minuten Probe bei 50 ° C inkubieren und bis zu 25 ° C mit einer Rate von 1,32 ° C/min langsam abkühlen.</li>
		<li>Für die 10 Minuten Inkubation 3 Minuten Probe bei 50 ° C inkubieren und bis zu 25 ° C mit einer Rate von 3,3 ° C/min langsam abkühlen.</li>
		<li>Für die 0-minütige Inkubation speichern Sie Muster 4 ° C rechts nachdem Schleusen DNA-Stränge hinzugefügt werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Direkt nach dem anbringen Schritt rasch Abkühlen der Probe auf 4 ° C zu verhindern, dass unerwünschte Denaturierung.</li>
</ol>6. Umgestaltung des Akkordeon Racks aus "Gesperrten Zustand" zu einem "freien Staat"
<ol><li>Die Struktur mit DNA-Schlössern der gewünschten Länge für die Konfiguration-Experiment zu synthetisieren.</li>
	<li>Umgekehrte komplementäre Stränge aus Abschnitt 3 vorbereiten.</li>
	<li>Fügen Sie 2 μL der Stränge, die komplementär zu der Sperre Stränge der gewünschten Länge in 20 μL der synthetisierten Struktur rückgängig zu machen sind. Die DNA-Sperre Stränge Konzentration ist fünfmal höher als die Struktur.</li>
	<li>Inkubation der Probe für 0, 12, 60, 120, 240 Minuten zu sehen, wie schnell Neukonfiguration auftritt.<ol>
<li>Für die 12, 60, 120, 240 Minuten Inkubation, rasch die Probe auf 40 ° C erhitzen und langsam abkühlen auf 20 ° C für die Zeit, die für jede. Direkt nach dem Trennen Schritt rasch Abkühlen der Probe auf 4 ° C zu verhindern, dass unerwünschte Denaturierung.</li>
		<li>Für die 0-minütige Inkubation speichern Sie Muster 4 ° C rechts nach rückwärts komplementäre Stränge hinzugefügt werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(7) TEM Imaging
Hinweis: TEM-imaging-Protokoll wurde von früheren Literatur18,20angepasst.
<ol><li>Bereiten Sie 1,25 M NaOH-Lösung durch Mischen von 87,5 μL der Nuklease-freies Wasser und 12,5 μl 10 M NaOH Lösung vor.</li>
	<li>50 μL der 2 %-Uranyl-Formiat-Lösung 1 μl 1,25 M NaOH-Lösung hinzufügen.</li>
	<li>Vortex: die Lösung für 3 Minuten und Zentrifuge bei max. Drehzahl für 3 Minuten. Kaution 3 μL der gereinigten Probe in der Glut entladen TEM Startaufstellung für 3 Minuten und schnell auswaschen mit Filterpapier.</li>
	<li>7 μL bereit Uranyl Formiat Lösung für 30 Sekunden zu hinterlegen und schnell auswaschen mit Filterpapier.</li>
	<li>Messen Sie die Länge und den Winkel der Akkordeon-Struktur durch TEM abgebildet.</li>
</ol>(8) Bund-Analyse
<ol><li>Verwenden Sie Atto 550 und Atto 647N Farbstoff, wofür die Förster-Entfernung 6,5 beträgt nm. Ersetzen Sie Grundnahrungsmittel 58 und Grundnahrungsmittel 117 in Tabelle 1 mit Gewebekulturen gekennzeichneten Adern. Dann synthetisieren Sie die Struktur mit Gewebekulturen gekennzeichneten Adern durch die in Abschnitt 3 beschriebenen Methode.</li>
	<li>Die Konzentration der gereinigten Probe zu messen.</li>
	<li>Normalisieren Sie die Probe 10 nM und Last 50 μL, 384 Mikroplatten gut.</li>
	<li>Begeistern Sie die Probe mit Donor und Akzeptor Farbstoffe bei 550 nm und messen die Fluoreszenz-Spektrum von 570 nm bis 800 nm mit einem Fluorometer.</li>
	<li>Die Fluoreszenz-Spektrum der Spender nur Probe auf die gleiche Weise zu messen.</li>
	<li>Begeistern die Farbstoffe der Probe bei 650 nm und die Fluoreszenz-Spektrum und Messen von 670 nm bis 800 nm. Dies ist zur Messung der Konzentration der Akzeptor.</li>
	<li>Erhalten Sie die Standardabweichungen durch Wiederholung des gleichen Experiments mit drei Proben, die synthetisiert werden und separat gereinigt.</li>
	<li>Berechnung der FRET-Effizienz mit dem Verhältnis eine Methode wie beschrieben durch die Gleichung unten21. <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58364/58364eq1.jpg"> DA550: Akzeptor-Peak-Fluoreszenz-Intensität der Probe mit Donor und Akzeptor bei 550 nm Anregung. D-550: Fluoreszenz-Intensität an den Akzeptor Emissionsbereich der Spender nur Probe bei 550 nm Anregung. DA650: Akzeptor-Peak-Fluoreszenz-Intensität der Probe mit Donor und Akzeptor bei 650 nm Anregung.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Andersen, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+a+nanoscale+DNA+box+with+a+controllable+lid.">Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid.</a> Nature. 459 (7243), 73-76 (2009).</li><li>Cha, T. -. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+principles+of+DNA+enzyme+based+walkers:+Translocation+kinetics+and+photo-regulation.">Design principles of DNA enzyme based walkers: Translocation kinetics and photo-regulation.</a> Journal of the American Chemical Society. 137 (29), 9429-9437 (2015).</li><li>Gerling, T., Wagenbauer, K. F., Neuner, A. M., Dietz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+DNA+devices+and+assemblies+formed+by+shape-complementary,+non-base+pairing+3D+components.">Dynamic DNA devices and assemblies formed by shape-complementary, non-base pairing 3D components.</a> Science. 347 (6229), 1446-1452 (2015).</li><li>Pinheiro, A. V., Han, D., Shih, W. M., Yan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+opportunities+for+structural+DNA+nanotechnology.">Challenges and opportunities for structural DNA nanotechnology.</a> Nature nanotechnology. 6 (12), 763-772 (2011).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+speed+limit+of+toehold+exchange+with+a+cartwheeling+DNA+acrobat.">Exploring the speed limit of toehold exchange with a cartwheeling DNA acrobat.</a> Nature Nanotechnology. 1, (2018).</li><li>Krishnan, Y., Simmel, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+based+molecular+devices.">Nucleic acid based molecular devices.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50 (14), 3124-3156 (2011).</li><li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+tweezer-actuated+enzyme+nanoreactor.">A DNA tweezer-actuated enzyme nanoreactor.</a> Nature communications. 4, 2127 (2013).</li><li>Douglas, S. M., Bachelet, I., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+logic-gated+nanorobot+for+targeted+transport+of+molecular+payloads.">A logic-gated nanorobot for targeted transport of molecular payloads.</a> Science. 335 (6070), 831-834 (2012).</li><li>Kuzyk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconfigurable+3D+plasmonic+metamolecules.">Reconfigurable 3D plasmonic metamolecules.</a> Nature Materials. 13 (9), 862-866 (2014).</li><li>Zhou, C., Duan, X., Liu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+plasmonic+nanorod+that+walks+on+DNA+origami.">A plasmonic nanorod that walks on DNA origami.</a> Nature communications. 6, 8102 (2015).</li><li>Choi, Y., Choi, H., Lee, A. C., Lee, H., Kwon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Reconfigurable+DNA+Accordion+Rack.">A Reconfigurable DNA Accordion Rack.</a> Angewandte Chemie International Edition. 57 (11), 2811-2815 (2018).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+Mechanical+Properties+of+DNA+Origami+Tiles+and+Controlling+the+Kinetics+of+their+Folding+and+Unfolding+Reconfiguration.">Understanding the Mechanical Properties of DNA Origami Tiles and Controlling the Kinetics of their Folding and Unfolding Reconfiguration.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (19), 6995-7005 (2014).</li><li>Han, D., Pal, S., Liu, Y., Yan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+and+cutting+DNA+into+reconfigurable+topological+nanostructures.">Folding and cutting DNA into reconfigurable topological nanostructures.</a> Nature Nanotechnology. 5 (10), 712-717 (2010).</li><li>Douglas, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+prototyping+of+3D+DNA-origami+shapes+with+caDNAno.">Rapid prototyping of 3D DNA-origami shapes with caDNAno.</a> Nucleic Acids Research. 37 (15), 5001-5006 (2009).</li><li>Castro, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+to+scaffolded+DNA+origami.">A primer to scaffolded DNA origami.</a> Nature methods. 8 (3), 221-229 (2011).</li><li>Ouldridge, T. E., Louis, A. A., Doye, J. P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Nanotweezers+Studied+with+a+Coarse-Grained+Model+of+DNA.">DNA Nanotweezers Studied with a Coarse-Grained Model of DNA.</a> Physical Review Letters. 104 (17), 178101 (2010).</li><li>Snodin, B. E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Simulation+of+the+Self-Assembly+of+a+Small+DNA+Origami.">Direct Simulation of the Self-Assembly of a Small DNA Origami.</a> ACS Nano. 10 (2), 1724-1737 (2016).</li><li>Amir, Y., Abu-Horowitz, A., Bachelet, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+and+Characterization+of+a+Bio-responsive+Robot+from+DNA+Origami.">Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e51272 (2015).</li><li>Stahl, E., Martin, T. G., Praetorius, F., Dietz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facile+and+Scalable+Preparation+of+Pure+and+Dense+DNA+Origami+Solutions.">Facile and Scalable Preparation of Pure and Dense DNA Origami Solutions.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (47), 12735-12740 (2014).</li><li>Wei, B., Vhudzijena, M. K., Robaszewski, J., Yin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+Complex+Two-dimensional+Shapes+from+Single-stranded+DNA+Tiles.">Self-assembly of Complex Two-dimensional Shapes from Single-stranded DNA Tiles.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), e52486 (2015).</li><li>Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+resonance+energy+transfer+and+nucleic+acids.">Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids.</a> Methods in enzymology. 211, 353-388 (1992).</li><li>Kopperger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+self-assembled+nanoscale+robotic+arm+controlled+by+electric+fields.">A self-assembled nanoscale robotic arm controlled by electric fields.</a> Science. 359 (6373), 296-301 (2018).</li><li>Lauback, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+magnetic+actuation+of+DNA+nanodevices+via+modular+integration+with+stiff+micro-levers.">Real-time magnetic actuation of DNA nanodevices via modular integration with stiff micro-levers.</a> Nature Communications. 9 (1), 1446 (2018).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben

Dieses Protokoll stellt den gesamten Prozess aus Konstruktion, Simulation, Synthese und Analyse von der 2D DNA Akkordeon Grundregal. Das geänderte Design und Simulation Regeln sind beschrieben worden weil standard DNA Origami Design Rule anders, dass die DNA-Akkordeon-Rack zusätzliche Nukleotide an die Frequenzweichen für Flexibilität14,15hat. Aus diesem Grund erwarten wir, dass das Protokoll verschiedene Forschungen mit DNA-Akkordeon Regale beschleunigen kan...

Mechanische Systeme auf Basis von DNA Nanostrukturen oder DNA Nanomaschinen1,2,3,4,5 sind einzigartig, weil sie komplexe nanoskaligen Bewegung in 2D und 3D in den Nanometer zu produzieren Ångström Auflösung, nach verschiedenen biomolekularen Reize2,3,6. Durch Anbringen von funktionalen Materialien auf diese Strukturen und ihre Positionen zu kontrollieren, können diese Strukturen in verschiedenen Bereichen angewendet werden. Zum Beispiel wurden DNA-Nanomaschinen für eine molekulare Reaktor7, Drug-Delivery-8und Nanoplasmonic Systeme9,10vorgeschlagen.
Zuvor führten wir die rekonfigurierbare DNA-Akkordeon-Rack, die eine 2D oder 3D nanoskaligen Netzwerk Elemente11 (Abbildung 1A) manipulieren kann. Im Gegensatz zu anderen DNA-Nanomaschinen, die nur wenige Elemente steuern, kann die Plattform gemeinsam periodisch angeordneten 2D oder 3D Elemente in verschiedenen Stadien zu manipulieren. Wir erwarten, dass eine programmierbare chemische und biologische Reaktion-Netzwerk oder einem molekularen Computersystem aus unserem System gebaut werden kann durch die Erhöhung der Anzahl der steuerbaren Elemente. Das DNA-Akkordeon-Rack ist eine Struktur, in der das Netzwerk mehrere DNA-Balken mit Gelenken bestehend aus einzelsträngiger DNA (Abbildung 1 b) verbunden ist. Das Akkordeon Rack durch die DNA-Balken erzeugt wird durch die DNS-Sperren neu konfiguriert die hybridisieren auf den klebrigen Teil der Strahlen und ändern Sie den Winkel zwischen den Balken entsprechend der Länge der Brücke Teil der Schleusen (gesperrten Zustand). Darüber hinaus zeigt mehrstufigen Neukonfiguration durch das Hinzufügen von neuen Schleusen nach Bildung des Freistaates durch DNA-Sperren durch Brückenkopf-basierte Strang Verdrängung12,13abnehmen.
In diesem Protokoll beschreiben wir den Gesamtprozess für Design und die Synthese der rekonfigurierbare DNA-Akkordeon-Rack. Das Protokoll umfasst Konstruktion, Simulation, nass-Laborversuche und Analyse für die Synthese von DNA-Akkordeon Rack 6 mal 6 Maschen und eine Neukonfiguration von diesen. Die Struktur des Protokolls ist das Basismodell der bisherigen Forschung11 und 65 nm von 65 nm Größe, bestehend aus 14 Strahlen. In Bezug auf die Konstruktion und Simulation unterscheidet sich der konstruktive Aufbau des Akkordeon Racks von konventionellen DNA Origami14,15 (d. h. dicht gepackt). Daher wurden die Gestaltungsregel und molekulare Simulation von traditionellen Methoden modifiziert. Um zu demonstrieren, zeigen wir die Designtechnik mit der modifizierten Ansatz von CaDNAno14 und die Simulation des Akkordeon Racks mit zusätzliche Skripte OxDNA16,17 . Schließlich sind beide Protokolle der TEM und Bund für die Analyse der konfigurierten Akkordeon Rack Strukturen beschrieben.

<table><tbody><tr><td>M13mp18 Single-stranded DNA</td><td>NEB</td><td>N4040s</td><td></td></tr><tr><td>1M MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Solution</td><td>Biosesang</td><td>M2001</td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA buffer</td><td>Biosesang</td><td>T2142</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-Free Water</td><td>Qiagen</td><td>129114</td><td></td></tr><tr><td>5M Sodium Chloride solution</td><td>Biosesang</td><td>s2007</td><td></td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1546605</td><td></td></tr><tr><td>10N NaOH</td><td>Biosesang</td><td>S2038</td><td></td></tr><tr><td>Uranyl formate</td><td>Thomas Science</td><td>C993L42</td><td></td></tr><tr><td>Thermal cycler C1000</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodropic 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEM (LIBRA 120)&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorometer Enspire 2300</td><td>Perkin-Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Labogene</td><td>LZ-1580</td><td></td></tr></tbody></table>

design and synthesis of a reconfigurable dna accordion rack

DNA-Nanostruktur-basierte mechanische Systeme oder DNA Nanomaschinen, die komplexe nanoskaligen Bewegung in 2D und 3D in den Nanometer Ångström Auflösung zu produzieren, zeigen großes Potenzial in verschiedenen Bereichen der Nanotechnologie wie die molekulare Reaktoren, Drug-Delivery, und Nanoplasmonic Systeme. Rekonfigurierbare DNA Akkordeon Rack, die gemeinsam eine 2D oder 3D nanoskaligen Netzwerk Elemente, in mehreren Stufen in Reaktion auf die DNA-Eingaben ändern können, wird beschrieben. Die Plattform hat Potenzial, die Anzahl der Elemente zu erhöhen, die DNA Nanomaschinen maßstabsgetreu ein Netzwerk mit mehreren Stufen der Neukonfiguration von ein paar Elemente kontrollieren kann.
In diesem Protokoll beschreiben wir den gesamten experimentellen Prozess der rekonfigurierbare DNA-Akkordeon-Rack 6 mal 6 Maschen. Das Protokoll enthält ein Berechnungsvorgang Regel und Simulation der Strukturen und eine nass-Laborversuch für Synthese und Neukonfiguration. Darüber hinaus ist die Analyse der Struktur mit TEM (Transmissions-Elektronenmikroskopie) und FRET (Fluoreszenz Resonanz Energietransfer) im Protokoll enthalten. Die neuartige Konstruktion und Simulation Methoden fallen in diesem Protokoll unterstützen Forscher, die DNA-Akkordeon-Rack für weitere Anwendungen zu verwenden.

Gestalteten 6 mal 6 DNA Akkordeon Rack wird von den OxDNA16,17 simuliert und die Ergebnisse sind in Abbildung 6dargestellt. Aus dem Simulationsergebnis bestätigte sich, dass die beabsichtigte Struktur ohne Verzerrung der Struktur gebildet wird.
Die TEM-Bilder in Abbildung 7 sind Bilder der konfigurierten Strukt...

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Design and Synthesis of a Reconfigurable DNA Accordion Rack

Wir beschreiben das ausführliche Protokoll für Konstruktion, Simulation, nass-Laborversuche und Analyse für eine rekonfigurierbare DNA Akkordeon Rack 6 mal 6 Maschen.

Design und Synthese eines rekonfigurierbaren DNA-Akkordeon-Racks

DNA nanostructure-based mechanical systems or DNA nanomachines, which produce complex nanoscale motion in 2D and 3D in the nanometer to &#229;ngstr&#246;m ...

design-and-synthesis-of-a-reconfigurable-dna-accordion-rack

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.0K Aufrufe.  Seoul National University. Wir beschreiben das ausführliche Protokoll für Konstruktion, Simulation, nass-Laborversuche und Analyse für eine rekonfigurierbare DNA Akkordeon Rack 6 mal 6 Maschen.

Serie: Design and Synthesis of a Reconfigurable DNA Accordion Rack

Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both stimuli and cargo can be tailored according to specific needs. Here we describe the DNA nanorobot fabrication protocol, with the use of the DNA origami technique. The procedure initiates by mixing short single-strand DNA staples into a stock mixture which is then added to a long, circular, single-strand DNA scaffold in presence of a folding buffer. A standard thermo cycler is programmed to gradually lower the mixing reaction temperature to facilitate the staples-to-scaffold annealing, which is the guiding force behind the folding of the nanorobot. Once the 60 hr folding reaction is complete, excess staples are discarded using a centrifugal filter, followed by visualization via agarose-gel electrophoresis (AGE). Finally, successful fabrication of the nanorobot is verified by transmission electron microscopy (TEM), with the use of uranyl-formate as negative stain.

DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM).

Falten und Charakterisierung eines Bio-responsive Robot von DNA-Origami

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both ...

Forschung

Chemie

Self-assembly of Complex Two-dimensional Shapes from Single-stranded DNA Tiles

Current methods in DNA nano-architecture have successfully engineered a variety of 2D and 3D structures using principles of self-assembly. In this article, we describe detailed protocols on how to fabricate sophisticated 2D shapes through the self-assembly of uniquely addressable single-stranded DNA tiles which act as molecular pixels on a molecular canvas. Each single-stranded tile (SST) is a 42-nucleotide DNA strand composed of four concatenated modular domains which bind to four neighbors during self-assembly. The molecular canvas is a rectangle structure self-assembled from SSTs. A prescribed complex 2D shape is formed by selecting the constituent molecular pixels (SSTs) from a 310-pixel molecular canvas and then subjecting the corresponding strands to one-pot annealing. Due to the modular nature of the SST approach we demonstrate the scalability, versatility and robustness of this method. Compared with alternative methods, the SST method enables a wider selection of information polymers and sequences through the use of de novo designed and synthesized short DNA strands.

DNA tiling is an effective approach to make programmable nanostructures. We describe the protocols to construct complex two-dimensional shapes by the self-assembly of single-stranded DNA tiles.

Die Selbstorganisation von Complex zweidimensionale Formen von Einzelstrang-DNA-Fliesen

Current methods in DNA nano-architecture have successfully engineered a variety of 2D and 3D structures using principles of self-assembly. In this ...

Designing a Bio-responsive Robot from DNA Origami

Nucleic acids are astonishingly versatile. In addition to their natural role as storage medium for biological information1, they can be utilized in parallel computing2,3 , recognize and bind molecular or cellular targets4,5 , catalyze chemical reactions6,7 , and generate calculated responses in a biological system8,9. Importantly, nucleic acids can be programmed to self-assemble into 2D and 3D structures10-12, enabling the integration of all these remarkable features in a single robot linking the sensing of biological cues to a preset response in order to exert a desired effect.
Creating shapes from nucleic acids was first proposed by Seeman13, and several variations on this theme have since been realized using various techniques11,12,14,15 . However, the most significant is perhaps the one proposed by Rothemund, termed scaffolded DNA origami16. In this technique, the folding of a long (&gt;7,000 bases) single-stranded DNA 'scaffold' is directed to a desired shape by hundreds of short complementary strands termed 'staples'. Folding is carried out by temperature annealing ramp. This technique was successfully demonstrated in the creation of a diverse array of 2D shapes with remarkable precision and robustness. DNA origami was later extended to 3D as well17,18 .
 
The current paper will focus on the caDNAno 2.0 software19 developed by Douglas and colleagues. caDNAno is a robust, user-friendly CAD tool enabling the design of 2D and 3D DNA origami shapes with versatile features. The design process relies on a systematic and accurate abstraction scheme for DNA structures, making it relatively straightforward and efficient.
In this paper we demonstrate the design of a DNA origami nanorobot that has been recently described20. This robot is 'robotic' in the sense that it links sensing to actuation, in order to perform a task. We explain how various sensing schemes can be integrated into the structure, and how this can be relayed to a desired effect. Finally we use Cando21 to simulate the mechanical properties of the designed shape. The concept we discuss can be adapted to multiple tasks and settings.

DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here, we describe how DNA origami can be utilized to design a robotic robot capable of sensing biological cues and responding by shape shifting, subsequently relayed to a desired effect.

Entwerfen einer Bio-responsive Robot von DNA Origami

Nucleic acids are astonishingly versatile. In addition to their natural role as storage medium for biological information1, they can be utilized in ...

Biotechnik

DNA Curtains Shed Light on Complex Molecular Systems During Homologous Recombination

Homologous recombination (HR) is important for the repair of double-stranded DNA breaks (DSBs) and stalled replication forks in all organisms. Defects in HR are closely associated with a loss of genome integrity and oncogenic transformation in human cells. HR involves coordinated actions of a complex set of proteins, many of which remain poorly understood. The key aspect of the research described here is a technology called "DNA curtains", a technique which allows for the assembly of aligned DNA molecules on the surface of a microfluidic sample chamber. They can then be visualized by total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). DNA curtains was pioneered by our laboratory and allows for direct access to spatiotemporal information at millisecond time scales and nanometer scale resolution, which cannot be easily revealed through other methodologies. A major advantage of DNA curtains is that it simplifies the collection of statistically relevant data from single molecule experiments. This research continues to yield new insights into how cells regulate and preserve genome integrity.

DNA curtains present a novel method for visualizing hundreds or even thousands of DNA-binding proteins in real-time as they interact with DNA molecules aligned on the surface of a microfluidic sample chamber.

Homologous recombination (HR) is important for the repair of double-stranded DNA breaks (DSBs) and stalled replication forks in all organisms. Defects in ...

Genetik

Stable DNA Motifs, 1D and 2D Nanostructures Constructed from Small Circular DNA Molecules

This article presents a detailed protocol for synthesis of small circular DNA molecules, annealing of circular DNA motifs, and construction of 1D and 2D DNA nanostructures. Over decades, the rapid development of DNA nanotechnology is attributed to the use of linear DNAs as the source materials. For example, the DAO (double crossover, antiparallel, odd half-turns) tile is well-known as a building block for construction of 2D DNA lattices; the core structure of DAO is made from two linear single-stranded (ss) oligonucleotides, like two ropes making a right hand granny&#160;knot. Herein, a new type of DNA tiles called cDAO (coupled DAO) are built using a small circular ss-DNA of c64nt or c84nt (circular 64 or 84 nucleotides) as the scaffold strand and several linear ss-DNAs as the staple strands. Perfect 1D and 2D nanostructures are assembled from cDAO tiles: infinite nanowires, nanospirals, nanotubes, nanoribbons; and finite nano-rectangles. Detailed protocols are described: 1) preparation by T4 ligase and purification by denaturing PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) of small circular oligonucleotides, 2) annealing of stable circular tiles, followed by native PAGE analysis, 3) assembling of infinite 1D nanowires, nanorings, nanospirals, infinite 2D lattices of nanotubes and nanoribbons, and finite 2D nano-rectangles, followed by AFM (Atomic Force Microscopy) imaging. The method is simple, robust, and affordable for most labs.

This article presents a detailed protocol for T4 ligation and denaturing PAGE purification of small circular DNA molecules, annealing and native PAGE analysis of circular tiles, assembling and AFM imaging of 1D and 2D DNA nanostructures, as well as agarose gel electrophoresis and centrifugation purification of finite DNA nanostructures.

Stabile DNA-Motive, 1D und 2D Nanostrukturen aus kleinen kreisförmigen DNA-Moleküle gebaut

This article presents a detailed protocol for synthesis of small circular DNA molecules, annealing of circular DNA motifs, and construction of 1D and 2D ...

DNA Origami-Mediated Substrate Nanopatterning of Inorganic Structures for Sensing Applications

Structural DNA nanotechnology provides a viable route for building from the bottom-up using DNA as construction material. The most common DNA nanofabrication technique is called DNA origami, and it allows high-throughput synthesis of accurate and highly versatile structures with nanometer-level precision. Here, it is shown how the spatial information of DNA origami can be transferred to metallic nanostructures by combining the bottom-up DNA origami with the conventionally used top-down lithography approaches. This allows fabrication of billions of tiny nanostructures in one step onto selected substrates. The method is demonstrated using bowtie DNA origami to create metallic bowtie-shaped antenna structures on silicon nitride or sapphire substrates. The method relies on the selective growth of a silicon oxide layer on top of the origami deposition substrate, thus resulting in a patterning mask for following lithographic steps. These nanostructure-equipped surfaces can be further used as molecular sensors (e.g., surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS)) and in various other optical applications at the visible wavelength range owing to the small feature sizes (sub-10 nm). The technique can be extended to other materials through methodological modifications; therefore, the resulting optically active surfaces may find use in development of metamaterials and metasurfaces.

Here, we describe a protocol to create discrete and accurate inorganic nanostructures on substrates using DNA origami shapes as guiding templates. The method is demonstrated by creating plasmonic gold bowtie-shaped antennas on a transparent substrate (sapphire).

DNA Origami-vermittelte Substrat Nanomusterung von anorganischen Strukturen für Sensoranwendungen

Structural DNA nanotechnology provides a viable route for building from the bottom-up using DNA as construction material. The most common DNA ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; represented by &#34;devices&#34; created as combinations of individual genetic components. However, manual assembly of such large numbers of devices is time-intensive, error-prone, and costly. The increasing sophistication and scale of synthetic biology research necessitates an efficient, reproducible way to accommodate large-scale, complex, and high throughput device construction.
Here, a DNA assembly protocol using the Type-IIS restriction endonuclease based Modular Cloning (MoClo) technique is automated on two liquid-handling robotic platforms. Automated liquid-handling robots require careful, often times tedious optimization of pipetting parameters for liquids of different viscosities (e.g. enzymes, DNA, water, buffers), as well as explicit programming to ensure correct aspiration and dispensing of DNA parts and reagents. This makes manual script writing for complex assemblies just as problematic as manual DNA assembly, and necessitates a software tool that can automate script generation. To this end, we have developed a web-based software tool, http://mocloassembly.com, for generating combinatorial DNA device libraries from basic DNA parts uploaded as Genbank files. We provide access to the tool, and an export file from our liquid handler software which includes optimized liquid classes, labware parameters, and deck layout. All DNA parts used are available through Addgene, and their digital maps can be accessed via the Boston University BDC ICE Registry. Together, these elements provide a foundation for other organizations to automate modular cloning experiments and similar protocols.
The automated DNA assembly workflow presented here enables the repeatable, automated, high-throughput production of DNA devices, and reduces the risk of human error arising from repetitive manual pipetting. Sequencing data show the automated DNA assembly reactions generated from this workflow are ~95% correct and require as little as 4% as much hands-on time, compared to manual reaction preparation.

Here, an automated workflow to perform modular DNA &#34;device&#34; assembly using a modular cloning DNA assembly method on liquid-handling robots is presented. The protocol uses an intuitive software tool for generating liquid handler picklists for combinatorial DNA device library generation, which we demonstrate using two liquid handling platforms.

Automatisierte Roboter Liquid Handling Versammlung Modular DNA-Geräte

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Simple, Affordable, and Modular Patterning of Cells using DNA

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells of the same or different type, micropatterning techniques have proved useful. DNA Programmed Assembly of Cells (DPAC) is a micropatterning technique that targets the adhesion of cells to a substrate or other cells using DNA hybridization. The most basic operations in DPAC begin with decorating cell membranes with lipid-modified oligonucleotides, then flowing them over a substrate that has been patterned with complementary DNA sequences. Cells adhere selectively to the substrate only where they find a complementary DNA sequence. Non-adherent cells are washed away, revealing a pattern of adherent cells. Additional operations include further rounds of cell-substrate or cell-cell adhesion, as well as transferring the patterns formed by DPAC to an embedding hydrogel for long-term culture. Previously, methods for patterning oligonucleotides on surfaces and decorating cells with DNA sequences required specialized equipment and custom DNA synthesis, respectively. We report an updated version of the protocol, utilizing an inexpensive benchtop photolithography setup and commercially available cholesterol modified oligonucleotides (CMOs) deployed using a modular format. CMO-labeled cells adhere with high efficiency to DNA-patterned substrates. This approach can be used to pattern multiple cell types at once with high precision and to create arrays of microtissues embedded within an extracellular matrix. Advantages of this method include its high resolution, ability to embed cells into a three-dimensional microenvironment without disrupting the micropattern, and flexibility in patterning any cell type.

Here we present a protocol to micropattern cells at single-cell resolution using DNA-programmed adhesion. This protocol uses a benchtop photolithography platform to create patterns of DNA oligonucleotides on a glass slide and then labels cell membranes with commercially available complementary oligonucleotides. Hybridization of the oligos results in programmed cell adhesion.

Einfache, erschwingliche und modulare Musterung von Zellen mit DNA

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells ...

DNA-Tethered RNA Polymerase for Programmable In vitro Transcription and Molecular Computation

DNA nanotechnology enables programmable self-assembly of nucleic acids into user-prescribed shapes and dynamics for diverse applications. This work demonstrates that concepts from DNA nanotechnology can be used to program the enzymatic activity of the phage-derived T7 RNA polymerase (RNAP) and build scalable synthetic gene regulatory networks. First, an oligonucleotide-tethered T7 RNAP is engineered via expression of an N-terminally SNAP-tagged RNAP and subsequent chemical coupling of the SNAP-tag with a benzylguanine (BG)-modified oligonucleotide. Next, nucleic-acid strand displacement is used to program polymerase transcription on-demand. In addition, auxiliary nucleic acid assemblies can be used as &#34;artificial transcription factors&#34; to regulate the interactions between the DNA-programmed T7 RNAP with its DNA templates. This in vitro transcription regulatory mechanism can implement a variety of circuit behaviors such as digital logic, feedback, cascading, and multiplexing. The composability of this gene regulatory architecture facilitates design abstraction, standardization, and scaling. These features will enable the rapid prototyping of in vitro&#160;genetic devices for applications such as bio-sensing, disease detection, and data storage.

We describe the engineering of a novel DNA-tethered T7 RNA polymerase to regulate in vitro transcription reactions. We discuss the steps for protein synthesis and characterization, validate proof-of-concept transcriptional regulation, and discuss its applications in molecular computing, diagnostics, and molecular information processing.

DNA-Tethered RNA Polymerase für programmierbare In-vitro-Transkription und molekulare Berechnung

DNA nanotechnology enables programmable self-assembly of nucleic acids into user-prescribed shapes and dynamics for diverse applications. This work ...

Plasmid-derived DNA Strand Displacement Gates for Implementing Chemical Reaction Networks

DNA nanotechnology requires large amounts of highly pure DNA as an engineering material. Plasmid DNA could meet this need since it is replicated with high fidelity, is readily amplified through bacterial culture and can be stored indefinitely in the form of bacterial glycerol stocks. However, the double-stranded nature of plasmid DNA has so far hindered its efficient use for construction of DNA nanostructures or devices that typically contain single-stranded or branched domains. In recent work, it was found that nicked double stranded DNA (ndsDNA) strand displacement gates could be sourced from plasmid DNA. The following is a protocol that details how these ndsDNA gates can be efficiently encoded in plasmids and can be derived from the plasmids through a small number of enzymatic processing steps. Also given is a protocol for testing ndsDNA gates using fluorescence kinetics measurements. NdsDNA gates can be used to implement arbitrary chemical reaction networks (CRNs) and thus provide a pathway towards the use of the CRN formalism as a prescriptive molecular programming language. To demonstrate this technology, a multi-step reaction cascade with catalytic kinetics is constructed. Further it is shown that plasmid-derived components perform better than identical components assembled from synthetic DNA.

This protocol describes a method for deriving DNA strand displacement gates from plasmids and testing them using fluorescence kinetics measurements. Gates can be modularly composed into multi-component systems to approximate the behavior of formal chemical reaction networks (CRN), demonstrating a new use for CRNs as a molecular programming language.

Plasmid stammende DNA-Strand Displacement Gatter zum Implementieren Chemical Reaction Networks

DNA nanotechnology requires large amounts of highly pure DNA as an engineering material. Plasmid DNA could meet this need since it is replicated with high ...