Diese Methode kann zur Herstellung biomolekülaktivierter Oberflächen eingesetzt werden, die in Bereichen wie Arzneimittelabgabe, biologisches Zielnachweis und Biotrennung Anwendung finden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Poly-PFPA-Bürsten mit Auminen hochreaktiv sind und die Immobilisierung von Antikörpern durch Inkubation in Pufferlösung für einige Stunden erreicht wird. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Proteinreinigung durch Immunreinigung, da der immobilisierte Antikörper erfolgreich mit Zielantigenen binden kann.
Obwohl diese Methode für die Antikörpermobilisierung und Proteinreinigung demonstriert wird, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, die eine biomolekulare Mobilisierung erfordern. Zur Behandlung von Siliziumdioxidperlen mit APTES erhalten Sie zunächst Siliziumdioxidpartikel in Form einer wässrigen Suspension mit einem Volumen von 5 %. Kombinieren Sie 0,8 Milliliter Siliziumdioxidsuspension mit 40 Milligramm APTES und acht Milliliter Methanol in einer 20-Milliliter-Szintillationsdurchstechflasche mit Rührstange.
Lassen Sie die Reaktion bei Raumtemperatur für fünf Stunden mit kräftigem Rühren ablaufen. Nach fünf Stunden die Lösung auf ein konisches Rohr übertragen. Um die funktionalisierten Silicondioxidperlen aptES zu isolieren, zentrieren Sie die Lösung fünf Minuten lang bei 10.000 G.
Entfernen Sie dann den Überstand. Waschen Sie nun die Perlen, indem Sie sie in drei Milliliter frisches Methanol röten. Schütteln Sie das Rohr von Hand zum Mischen, aber wenn nötig, verbessern Sie die Dispersion durch Beschallung in einem Wasserbad für ein paar Sekunden.
Zentrifugieren Sie wie zuvor, und wiederholen Sie den Waschschritt noch einmal. Kombinieren Sie die Methanol-Waschsilikondioxidperlen mit drei Millilitern Dimethylsulfoxid oder DMSO. Schütteln Sie die Mischung von Hand, oder bei Bedarf für ein paar Sekunden beschallen, bis die Perlen vollständig im DMSO verteilt sind.
Entfernen Sie nach der Zentrifugation zuvor den Überstand. Wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt ein letztes Mal, um einen vollständigen Lösungsmittelaustausch von Methanol zu DMSO zu gewährleisten. Um die Poly-PFPA-Lösung vorzubereiten, lösen Sie 20 Milligramm Poly-PFPA in zwei Milliliter DMSO in einer 20-Milliliter-Szintillationsdurchstechflasche auf.
Um PEG-Lösung vorzubereiten, lösen Sie Amin funktionalisierte PEG in einem Milliliter DMSO. Übertragen Sie nun die PEG-Lösung auf die Poly-PFPA-Lösung. Reagieren Sie bei Raumtemperatur für eine Stunde mit kräftigem Rühren.
Übertragen Sie einen Milliliter der in DMSO aufgehängten APES-funktionalisierten Siliciumdioxidperlen in die PEG-substituierte Poly-PFPA-Lösung. Lassen Sie die Veredelung zwischen Poly-PFPA und APTES funktionalisierten Siliziumdioxidperlen bei Raumtemperatur für eine Stunde mit kräftigem Rühren ablaufen. Dann isolieren Sie die Perlen durch Zentrifugation bei 10.000 G für fünf Minuten, gefolgt von der Entfernung des Überstandes.
Waschen Sie die Perlen, indem Sie drei Milliliter DMSO hinzufügen, und mischen Sie sie von Hand oder mit ein paar Sekunden Beschallung. Zentrifugieren Sie die Perlen wie bisher. Und entfernen Sie den Überstand, bevor Sie die DMSO-Wäsche zweimal wiederholen.
Waschen Sie die Perlen zweimal mehr mit drei Milliliter dreifach destilliertem Wasser. Dann von Hand oder mit ein paar Sekunden Beschallung mischen. Zentrifugieren Sie die Perlen wie bisher und entfernen Sie den Überstand.
Zum Schluss trocknen Sie die Perlen bei 40 Grad Celsius über Nacht im Vakuumofen. Fügen Sie fünf Milligramm Poly-PFPA-veredelte Siliziumdioxidperlen zu einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr hinzu. Waschen Sie die Perlen, indem Sie 800 Mikroliter PBS hinzufügen, und mischen Sie gut durch Wirbeln.
Zentrifugieren Sie die Perlen bei 10.000 G bei Raumtemperatur für eine Minute. Entfernen Sie den Überstand, und wiederholen Sie den Waschschritt dreimal. Fügen Sie nun 350 Mikroliter frisches PBS, 50 Mikroliter 0,1% PBST und 6,67 Mikrogramm des Antikörpers hinzu.
Etwa 20 Stunden auf einem Rotator bei vier Grad Celsius inkubieren. Am nächsten Tag die Perlen und Zentrifuge bei 400 G und vier Grad Celsius für eine Minute waschen. Entfernen Sie dann den Überstand und fügen Sie vorsichtig 400 Mikroliter Lysepuffer hinzu.
Die Perlen vorsichtig wieder aussetzen, indem Sie fünfmal nach oben und unten pfeifen. Wiederholen Sie diesen Waschschritt dreimal. Nach der letzten Wäsche so viel vom Überstand wie möglich entfernen.
Bereiten Sie Zellen und Lysepuffer wie im Textprotokoll beschrieben vor. Dann das Zellpellet mit 400 Mikrolitern des Lysepuffers wieder aufhängen. Beschallen Sie die Zellen mit einem Ultraschallgerät.
Nach der Beschallung kurz Wirbel. Dann zentrifugieren Sie das Lysat bei 20.000 G bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Übertragen Sie den Überstand auf ein neues 1,5 Milliliter Zentrifugenrohr.
Um Immunpräzipitation durchzuführen, übertragen Sie 300 Mikroliter Zelllysat auf zuvor vorbereitete Antikörper immobilisierte Poly PFPA-veredelte Siliziumdioxidperlen. Bewahren Sie 30 Mikroliter der Zelle lysiert als Eingangsprobe in einem neuen Mikrozentrifugenrohr auf. Die Lysatperlenmischung drei Stunden lang auf einem Rotator bei vier Grad Celsius inkubieren.
Nach der Inkubation zentrieren Sie die Mischung bei 400 G bei vier Grad Celsius für eine Minute. Entfernen Sie den Überstand, und fügen Sie vorsichtig 400 Mikroliter Waschpuffer hinzu. Die Perlen vorsichtig wieder aussetzen, indem Sie etwa fünfmal nach oben und unten pfeifen.
Entfernen Sie nach drei Washes so viel vom Überstand wie möglich. Fügen Sie 30 Mikroliter 2x SDS-Ladefarbstoff zu den Perlen und zur Eingangsprobe hinzu. Dann erhitzen Sie sie für 10 Minuten bei 95 Grad Celsius.
Analysieren Sie die Probe nach dem Erhitzen mit Dem westlichen Blotting, oder lagern Sie die Probe bei minus 20 Grad Celsius. Die funktionalisierten Kieselsäureperlen werden mittels Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS) untersucht, um die Oberflächenzusammensetzung zu bestimmen. Repräsentative XPS-Daten werden hier angezeigt.
Nach der APTES-Behandlung wird der Stickstoff-1s-Peak, der mit der Amingruppenzone APTES verbunden ist, nachgewiesen. Nach der Poly-PFPA-Behandlung wird die fluor-1s-Spitze, die mit den PFP-Einheiten auf dem Polymer verbunden ist, nachgewiesen. Proteinkinase-RNA aktiviert, oder PKR-Anreicherung durch Immunpräzipitation durchgeführt, und die angespielte Proteinprobe wird mit Western Blotting analysiert.
Wie erwartet zeigen immobilisierte Perlen ohne Antikörper oder eine unspezifische Antikörpermischung keine PKR-Wiederherstellung. Die mit Anti-PKR bebrüteten Perlen können PKR erfolgreich bereichern, wie das Vorhandensein eines PKR-Bandes und das Fehlen eines GAPDH-Bandes zeigen. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass beim Vergleich von Systemen die IP-Experimente sowie die anschließende Western-Blotting-Analyse gleichzeitig durchgeführt werden sollten.
Nach seiner Entwicklung kann diese Technik zur Immobilisierung verschiedener biomolekularer oder materieller Substrateingesetzt eingesetzt werden. Darüber hinaus hat diese Methode den zusätzlichen Vorteil der Abstimmung Only Surface-Eigenschaft, die auf die Anforderungen jeder Anwendung zugeschnitten werden kann.
