Este método pode ser usado para preparar superfícies ativadas por biomoléculas, que têm aplicações em áreas como entrega de medicamentos, detecção de alvos biológicos e bio separação. A principal vantagem dessa técnica é que os pincéis poly PFPA são altamente reativos com aminas, e a imobilização de anticorpos é alcançada pela incubação em solução tampão por algumas horas. As implicações desta técnica se estendem para a purificação da proteína através da imunopurificação, já que o anticorpo imobilizado pode se ligar com os antígenos alvo.
Embora este método seja demonstrado para mobilização de anticorpos e purificação de proteínas, ele também pode ser aplicado a outros sistemas que requerem mobilização biomolecular. Para tratar contas de dióxido de silício com APTES, primeiro obtenha partículas de dióxido de silício na forma de uma suspensão aquosa de volume de peso de 5%. Combine 0,8 mililitros de suspensão de dióxido de silício com 40 miligramas de APTES, e oito mililitros de metanol em um frasco de cintilação de 20 mililitros equipado com uma barra de mexida.
Deixe a reação prosseguir à temperatura ambiente por cinco horas com agitação vigorosa. Depois de cinco horas, transfira a solução para um tubo cônico. Para isolar as contas de dióxido de silicone funcionalizadas APTES, centrifugar a solução a 10.000 G durante cinco minutos.
Em seguida, remova o supernaspe. Agora lave as contas repaginando-as em três mililitros de metanol fresco. Aperte o tubo à mão para misturar, mas, se necessário, melhore a dispersão por sônica em um banho de água por alguns segundos.
Centrifugar como antes, e repetir o passo de lavagem mais uma vez. Combine as contas de dióxido de silicone de lavagem de metanol com três mililitros de sulfóxido de dimetil, ou DMSO. Agite a mistura à mão, ou se necessário, sonicar por alguns segundos até que as contas estejam totalmente dispersas no DMSO.
Após a centrifugação antes, remova o sobrenante. Repita a etapa de centrifugação um tempo final para garantir a troca completa de solventes do metanol para o DMSO. Para preparar a solução poly PFPA, dissolva 20 miligramas de pfpa de poli em dois mililitros de DMSO em um frasco de cintilação de 20 mililitros.
Para preparar a solução PEG, dissolva peg funcionalizado de amina em um mililitro de DMSO. Agora transfira a solução PEG para a solução poly PFPA. Reaja à temperatura ambiente por uma hora com agitação vigorosa.
Transfira um mililitro das contas de dióxido de silício funcionalizadas APTES suspensas em DMSO para a solução DE POLI PFPA substituída pelo PEG. Permita que o enxerto entre as contas de dióxido de silício funcionalizante poly PFPA e APTES prossiga à temperatura ambiente por uma hora com agitação vigorosa. Em seguida, isole as contas por centrifugação a 10.000 G por cinco minutos, seguido pela remoção do supernasce.
Lave as contas adicionando três mililitros de DMSO, e misture à mão ou com alguns segundos de sônica. Centrifugar as contas como antes. E remova o supernatante antes de repetir a lavagem do DMSO duas vezes.
Lave as contas mais duas vezes com três mililitros de água tripla destilada. Em seguida, misture à mão ou com alguns segundos de sônicação. Centrifugar as contas como antes e remover o supernatante.
Por fim, seque as contas a 40 graus celsius em um forno a vácuo durante a noite. Adicione cinco miligramas de contas de dióxido de silício enxertadas de poli PFPA a um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Lave as contas adicionando 800 microliters de PBS, e misture bem com vórtices.
Centrifugar as contas a 10.000 G em temperatura ambiente por um minuto. Retire o supernatante e repita o passo de lavagem três vezes. Agora adicione 350 microliters de PBS fresco, 50 microliters de 0,1% PBST e 6,67 microgramas do anticorpo.
Incubar aproximadamente 20 horas em uma rotadora a quatro graus celsius. No dia seguinte, lave as contas e a centrífuga a 400 G e 4 graus celsius por um minuto. Em seguida, remova o supernascer e adicione cuidadosamente 400 microliters de tampão de lise.
Levemente resuspenque as contas pipetting para cima e para baixo cinco vezes. Repita esta etapa de lavagem três vezes. Após a lavagem final, remova o máximo possível do supernante.
Prepare células e tampão de lise conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, resuspenja a pelota celular com 400 microliters do tampão de lise. Sonicar as células usando um ultra sonicator.
Após a sônicação, vórtice brevemente. Em seguida, centrifugar o lysate a 20.000 G a quatro graus celsius por 10 minutos. Transfira o supernatante para um novo tubo de centrífuga de 1,5 mililitro.
Para realizar a imunoprecipitação, transfira 300 microlitadores de lisato celular para contas de dióxido de silício enxertadas poli PFPA previamente preparadas. Retenha 30 microlitadores do liseto celular como a amostra de entrada em um novo tubo de microcentrifuagem. Incubar a mistura de contas de lise por três horas em um rotador a quatro graus celsius.
Após a incubação, centrifugar a mistura a 400 G a quatro graus celsius por um minuto. Remova o supernatante e adicione cuidadosamente 400 microliters de tampão de lavagem. Levemente resuspenque as contas pipetting para cima e para baixo cerca de cinco vezes.
Depois de três lavagens, remova o máximo possível do supernante. Adicione 30 microliters de corante de carregamento SDS 2x às contas e à amostra de entrada. Em seguida, aqueça-os por 10 minutos a 95 graus celsius.
Após o aquecimento, analise a amostra usando manchas ocidentais ou armazene a amostra a menos 20 graus celsius. As contas de sílica funcionalizada são examinadas por espectroscopia fotoeletrrona de raios-X, ou XPS, para determinar a composição da superfície. Os dados do Representante XPS são mostrados aqui.
Após o tratamento APTES, o pico de nitrogênio 1s associado à zona do grupo de amina APTES é detectado. Após o tratamento de poli PFPA, o pico de flúor 1s associado às unidades pfp no polímero é detectado. RNA de quinase proteica ativado, ou enriquecimento PKR através da imunoprecipitação é realizado, e a amostra de proteína aludida é analisada usando mancha ocidental.
Como esperado, contas imobilizadas sem anticorpos, ou uma mixtura de anticorpos não específica não mostram recuperação de PKR. As contas incubadas com anti-PKR podem enriquecer com sucesso o PKR, como indicado pela presença de uma banda PKR e pela ausência de banda GAPDH. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que, ao comparar sistemas, os experimentos ip, bem como a análise subsequente de manchas ocidentais devem ser feitos simultaneamente.
Após seu desenvolvimento, essa técnica pode ser utilizada para a imobilização de diferentes substratos biomoleculares ou materiais. Além disso, este método tem o benefício adicional de sintonizar apenas a propriedade de superfície a ser adaptada para atender à necessidade de cada aplicativo.
