この方法は、薬物送達、生物学的標的検出、および生体分離などの分野での用途を有する生体分子活性化表面を調製するために使用することができる。この技術の主な利点は、ポリPFPAブラシがアミンと反応性が高く、抗体の固定化が数時間のバッファー溶液中のインキュベーションによって達成される点である。この技術の意味は、固定化抗体が標的抗原と正常に結合することができるため、免疫精製を通じてタンパク質精製に向けて広がっています。
この方法は抗体の動員とタンパク質精製のために実証されるが、生体分子動員を必要とする他のシステムにも適用することができる。二酸化ケイ素ビーズをAPTESで処理するために、まず5%重量体積水性懸濁液の形で二酸化ケイ素粒子を得る。0.8ミリリットルの二酸化ケイ素懸濁液を40ミリグラムのAPTESと組み合わせ、8ミリリットルのメタノールを20ミリリットルのシンチレーションバイアルに組み合わせます。
激しい攪拌を行い、室温で5時間反応を進行させます。5時間後、溶液を円錐管に移します。APTESの機能性シリコーン二酸化ビーズを分離するために、溶液を10,000 Gで5分間遠心分離する。
その後、上清を取り除く。今、新鮮なメタノールの3ミリリットルでそれらをやりくりすることによってビーズを洗います。混合するために手でチューブを振るが、必要に応じて、数秒間水浴中の超音波処理によって分散を改善します。
前と同様に遠心分離機、洗浄工程をもう一度繰り返す。メタノール洗浄二酸化シリコーンビーズと3ミリリットルのジメチルスルホキシド(DMSO)を組み合わせます。混合物を手で振るか、必要に応じて、ビーズがDMSOに完全に分散するまで数秒間超音波処理します。
前に遠心分離に続いて、上清を取り除く。メタノールからDMSOへの完全な溶媒交換を確実にするために、最後の時間に遠心分離ステップを繰り返します。ポリPFPA溶液を調製するために、20ミリリットルのシンチレーションバイアルで2ミリリットルのDMSOにポリPFPAの20ミリグラムを溶解する。
PEG溶液を調製するために、アミン機能化PEGをDMSOの1ミリリットルに溶解する。次に、PEG 溶液をポリ PFPA 溶液に転送します。激しい攪拌で室温で1時間反応させます。
DMSOに懸濁したAPTESの機能性二酸化ケイ素ビーズをPEG置換ポリPFPA溶液に1ミリリットル移動します。ポリPFPAとAPTESの機能性二酸化ケイ素ビーズの間のグラフトを、激しい攪拌で室温で1時間進めます。その後、10,000Gで10,000Gで遠心分離してビーズを5分間分離し、続いて上清を除去する。
DMSOの3ミリリットルを加えてビーズを洗い、手で、または数秒の超音波処理で混ぜます。以前のようにビーズを遠心分離します。そして、DMSO洗浄を2回繰り返す前に上清を取り除きます。
3ミリリットルの三重蒸留水でさらにビーズを洗います。その後、手で、または超音波処理の数秒でミックス。前のようにビーズを遠心分離し、上清を取り除きます。
最後に、一晩真空オーブンで40°Cでビーズを乾燥させます。1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブにポリPFPA接ぎ木二酸化ケイ素ビーズを5ミリグラム加えます。800マイクロリットルのPBSを加えてビーズを洗い、渦をよく混ぜます。
室温で10,000Gでビーズを1分間遠心する。上清を取り出し、洗浄工程を3回繰り返します。次に、新鮮なPBSの350マイクロリットル、0.1%PBSTの50マイクロリットル、および抗体の6.67マイクログラムを追加します。
摂氏4度で回転器に約20時間インキュベートします。翌日、ビーズと遠心分離機を400Gと摂氏4度で1分間洗います。その後、上清を取り除き、慎重に400マイクロリットルのライシスバッファーを追加します。
ビーズを上下に5回ピペットしてそっと再中断します。この洗浄を3回繰り返します。最後の洗浄後、できるだけ多くの上清を取り除きます。
テキストプロトコルに記載されているように、細胞およびリシスバッファーを準備します。次に、細胞ペレットを400マイクロリットルのリシスバッファーで再懸濁する。超超音波処理器を使用して細胞を超音波処理します。
超音波処理の後、簡単に渦。その後、摂氏4度で20,000Gのリセートを10分間遠心分離する。上清を新しい1.5ミリリットルの遠心管に移します。
免疫沈降を行うために、300マイクロリットルの細胞ライセートを、あらかじめ調製したポリPFPA移植二酸化ケイ素ビーズを固定化した抗体に移す。30マイクロリットルの細胞ライセートを入力サンプルとして新しいマイクロ遠心分離チューブに保持します。リゼートビーズ混合物を摂氏4度で回転器で3時間インキュベートします。
インキュベーションに続き、400Gで1分間摂氏4度で遠心分離する。上清を取り除き、400マイクロリットルの洗浄バッファーを慎重に加えます。ビーズを上下に約5回ピペットして静かに再中断します。
3回の打ち上がりの後、できるだけ多くの上清を取り除く。ビーズと入力サンプルに2x SDS負荷染料の30マイクロリットルを追加します。その後、摂氏95度で10分間加熱します。
加熱後、ウェスタンブロッティングを使用してサンプルを分析するか、マイナス20°Cで保存します。機能化されたシリカビーズをX線光電子分光法(XPS)で調べ、表面組成を決定する。代表的な XPS データをここに示します。
APTES処理後、アミン群領域APTESに関連する窒素1sピークが検出される。ポリPFPA処理の後、ポリマー上のPFP単位に関連するフッ素1sピークが検出される。タンパク質キナーゼRNA活性化、または免疫沈降によるPKR濃縮が行われ、ウェスタンブロッティングを用いて抽出したタンパク質サンプルを分析する。
予想通り、抗体を使用しないビーズ、または非特異的抗体混合法はPKR回復を示さない。アンチPKRでインキュベートされたビーズは、PKRバンドの存在とGAPDHバンドの不在によって示されるようにPKRをうまく濃縮することができます。この手順を試みる際には、システムを比較する際には、IP実験とそれに続くウェスタンブロッティング解析を同時に行う必要があることを覚えておくことが重要です。
その開発後、この技術は、異なる生体分子または材料基質の固定化に使用することができる。さらに、この方法には、各アプリケーションのニーズに合わせて調整されるサーフェスプロパティのみを調整するという追加の利点があります。
