Wir entwickelten einen Test mit hohem Durchsatz, um neutrophile extrazelluläre Fallen oder NETs zu messen. NETs sind immunogene DNA-Strukturen, die durch Neutrophile exponiert werden. NETs können Mikroorganismen fangen und abtöten und sind daher ein wichtiger Anti-Infektiöse-Mechanismus, aber sie spielen auch eine pathogene Rolle bei Autoimmunerkrankungen.
Mit dieser Technik werden NETs durch dreidimensionale Immunfluoreszenz-Konfokalmikroskopie quantifiziert, was zu einer hochempfindlichen und hochdurchsatzhohen Methode zur Untersuchung der NETZbildung und des Abbaus führt. Diese Technik ermöglicht es uns, die NET-Bildung von Patienten mit Autoimmunerkrankungen zu quantifizieren. Ex vivo NET Bildung von Patienten mit ANCA-assoziierter Vaskulitis oder systemischer Lupus Erythematose konnte mit diesem Test überwacht werden.
Darüber hinaus könnten potenzielle Therapeutika, die auf die NET-Bildung abzielen, mit diesem Assay in vitro getestet werden. Neutrophile Isolation könnte ein Kampf für Menschen sein, die noch nie diese Technik durchgeführt haben. Um dieses Verfahren zu beginnen, erhalten Sie 20 Milliliter peripheres Blut von einem gesunden Spender in zwei 10-Milliliter EDTA-codierten Röhren.
Übertragen Sie 10 Milliliter Blut in einer sterilen 50-Milliliter-Röhre und PBS auf ein Gesamtvolumen von 32,5 Millilitern. Mit einem 10-Milliliter Pipetten- und Pipettenregler nehmen Sie 14 Milliliter Dichtegradient auf. Legen Sie die Pipette auf die Unterseite des 50-Milliliter-Rohrs.
Nehmen Sie dann den Pipettenregler von der Pipette, sodass der Dichtegradient durch die Schwerkraft herausfließen kann, bis das Maximum durch Kapillareffekt erreicht wird. Legen Sie einen Daumen auf die Pipette, um zu verhindern, dass der verbleibende Dichtegradient austritt, und entfernen Sie dann die Pipette aus dem Rohr. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 912 mal g bei Raumtemperatur für 20 Minuten ohne Beschleunigung oder Bremse.
Entfernen Sie vorsichtig zuerst den weißen Ring, der die peripheren mononukleären Blutzellen enthält, gefolgt vom PBS-verdünnten Plasma. Entfernen Sie schließlich die Dichtegradientenschicht so weit wie möglich. Als nächstes holen Sie eine Flasche kaltes steriles destilliertes Wasser und einen Kolben mit 10x konzentrierten PBS aus einem Kühlschrank.
Schnell arbeiten, 36 Milliliter Wasser direkt auf das Pellet geben und einmal sorgfältig mischen. Nach 20 Sekunden von Anfang an gezählt, fügen Sie vier Milliliter 10x PBS, um eine isotonische Lösung zu machen. Und wieder, mischen Sie einmal sorgfältig.
Zentrifugieren Sie das Rohr bei 739 mal g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand, achten Sie darauf, äußerst vorsichtig zu sein, da das Pellet nicht fest ist, und wiederholen Sie schnell den Prozess der Zugabe des kalten sterilen destillierten Wassers und konzentrierten PBS, wie zuvor beschrieben. Zentrifuge bei 328 mal g und vier Grad Celsius für fünf Minuten.
Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und hängen Sie das Pellet in fünf Milliliter PBS wieder auf. Zählen Sie die Neutrophilen und halten Sie sie auf Eis. Machen Sie zunächst eine neutrophile Suspension mit etwa 10 bis 20 Millionen Neutrophilen in zwei Milliliter PBS in einer 15-Milliliter-Röhre.
Mischen Sie in einer anderen 15-Milliliter-Röhre zwei Milliliter PBS mit vier Mikrolitern zweimikromolaren roten Fluoreszenzzell-Linkern. Fügen Sie die rote fluoreszierende Zelllinkerlösung vorsichtig in die Neutrophilensuspension ein und mischen Sie sie sorgfältig. Wickeln Sie das Rohr in Aluminiumfolie, um die Mischung vor Licht zu schützen, und brüten Sie für genau 25 Minuten bei 37 Grad Celsius, um die Neutrophilen mit dem roten fluoreszierenden Zelllinker zu kennzeichnen.
Aktivieren Sie die Etikettierung, indem Sie RPMI 1640 Medium mit 10% wärmeinaktiviertem FCS bei Raumtemperatur auf ein Endvolumen von 15 Millilitern eintragen und einmal sorgfältig mischen. Wenn sich danach ein Pellet gebildet hat, setzen Sie die Mischung vorsichtig wieder auf. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 328 mal g bei Raumtemperatur für fünf Minuten.
Bevor Sie den Überstand entfernen, stellen Sie sicher, dass sich ein Pellet gebildet hat. Danach das Pellet in fünf Milliliter rot-freiem RPMI 1640 Medium mit 2%FCS bei Raumtemperatur wieder aufhängen. Dann zählen Sie die Neutrophilen.
Machen Sie eine Zellsuspension mit einer Dichte von 420.000 Zellen pro Milliliter in phenolrot-freiem RPMI 1640 Medium, das 2%FCS enthält. Fügen Sie 37, 500 Neutrophile in 90 Mikroliterzujedert in jedem Brunnen einer schwarzen 96-Well,-Flachbodenplatte hinzu. Als nächstes fügen Sie 10 Mikroliter des gewählten Stimulus in Dreifache hinzu, um eine Konzentration von 10% in jedem Brunnen zu erreichen.
Fügen Sie immer eine negative Kontrolle in Dreifache. Inkubieren Sie im Dunkeln bei 37 Grad Celsius für die gewünschte Zeit, die von 30 Minuten bis zu zwei, vier oder sechs Stunden reicht. Bereiten Sie dann das Volumen des undurchlässigen DNA-Farbstoffs vor, der benötigt wird, um 25 Mikroliter fünfmikromolaren, undurchlässigen DNA-Farbstoffs hinzuzufügen, um eine endgültige Konzentration von einem Mikromolar in jedem Brunnen zu erreichen.
15 Minuten vor dem Ende der Inkubationszeit 25 Mikroliter fünfmikromolaren, undurchlässigen DNA-Farbstoffs zu jedem Brunnen hinzufügen. Setzen Sie die Inkubation für die letzten 15 Minuten bei 37 Grad Celsius im Dunkeln fort. Danach den Überstand sehr sorgfältig entfernen und bei Bedarf aufbewahren.
100 Mikroliter 4%Paraformaldehyd hinzufügen. Halten Sie die Platte im Dunkeln, und fahren Sie sofort mit dem nächsten Abschnitt fort. Wählen Sie nach dem Konfigurieren der Einstellungen z/H Z Series aus.
Wählen Sie 10 als Anzahl der Schritte aus. Wählen Sie drei Mikrometer als Schrittgröße aus. Laden Sie die Platte in das Immunfluoreszenz-Konfokalmikroskop.
Klicken Sie auf die Registerkarte Ausführen. Füllen Sie den Plattennamen und die Beschreibung aus, und wählen Sie den Lagerort aus. Wählen Sie die Brunnen aus, die erworben werden müssen.
Wählen Sie die Belichtungszeit für Texas Red und FITC aus. Klicken Sie dann auf Platte erwerben und starten Sie die Erfassung, die etwa eine Stunde pro Platte dauert. Wählen Sie danach Analysemakro aus.
Wählen Sie dann w1 aus, und wählen Sie den Schwellenwert aus. Wählen Sie als Nächstes den gewünschten Pixelwert aus. Und schließlich wählen Sie in einem zweiten Bild J-Fenster w2 aus, und wählen Sie den Schwellenwert mit dem gewünschten Pixelwert aus.
Wählen Sie ein Ziel für die Tabellenkalkulationsdatei aus, führen Sie die Analyse aus, und speichern Sie die Protokolldatei anschließend. Hier wird ein hochsensibler, allgemein anwendbarer Assay zur halbautomatischen Quantifizierung der neutrophilen extrazellulären Trapbildung zur Bewertung der Ex-vivo-Induktion von neutrophilen extrazellulären Fallen auf verschiedene Reize vorgestellt. Die NET-Bildung wird auf dreidimensionale Weise quantifiziert, indem gebeizte extrazelluläre DNA über 10 Z-Stacks quantifiziert wird, wobei der Abstand von drei Mikrometern an der Brennebene in jedem Brunnen beginnt.
Durch die Messung der kumulativen Fläche erhöht sich die Empfindlichkeit des Assays. Die Gesamtfläche der abgebildeten gefärbten Neutrophilen wird nur in der Brennebene in jedem Brunnen quantifiziert, was signifikant mit der gesamten Neutrophilenzahl in jedem Brunnen mit einem Pearson-Korrelationskoeffizienten von 0,99 korreliert. Das repräsentative Ergebnis der Quantifizierung der NET-Bildung bei Neutrophilen wird als kumulativer fleckiger extrazellulärer DNA-Bereich über 10 Z-Stacks pro abgebildetem Neutrophilen ausgedrückt.
Es werden dann Schnappschüsse aus dem Netto-Quantifizierungstest erstellt. Repräsentative Bilder von nicht stimulierten Neutrophilen und von NETs in AAV-stimulierten Neutrophilen werden hier mit den fluoreszierend markierten Neutrophilen in Rot und der gebeizten extrazellulären DNA in Grün gezeigt. Neutrophile sollten mit Vorsicht behandelt werden, und die PKH-Kennzeichnung sollte genau nach dem Protokoll durchgeführt werden.
Dieser Assay kann verwendet werden, um Morphologie, Kinetik und Zusammensetzung von NETs zu studieren. Diese Technik ist eine weitere Methode, die die Möglichkeit bietet, NETs bei Gesundheit und Krankheit zu studieren. Trypan blue, PKH und PFA sollten mit Handschuhen behandelt und nicht direkt eingeatmet werden.
