1. PMN Isolation aus menschlichem Blut Verwenden Sie ca. 24 ml menschliches Blut mit EDTA oder Heparin (10 U / ml) als Antikoagulans. <ol><li> Add 6 ml Histopaque 1119 bis ein 15 ml Falcon-Röhrchen und sorgfältig Schicht von 5 bis 7 ml Vollblut an der Spitze. </li><li> Zentrifuge für 20 Minuten bei 800 xg ohne Bremse. </li><li> Absaugen und entsorgen gelblich und klar oberste Schicht und Transfer untere rötliche Phase mit Granulozyten in frischen Falcon-Röhrchen. </li><li> Wash-Zellen durch Auffüllen Falcon-Röhrchen mit PBS und Zentrifuge für 10 Minuten bei 300 x g. </li><li> In der Zwischenzeit bereiten eine 100% ige Percoll-Lösung durch Mischen 18 ml Percoll mit 2 ml 10x PBS. Mit 1x PBS vorzubereiten 4 ml Lösungen von 85%, 80%, 75%, 70% und 65% Percoll. </li><li> Bereiten Sie 2 Falcon Röhrchen mit einem Percoll-Gradienten durch die Schichtung von 2 ml jeder Prozentpunkt auf der jeweils anderen in absteigender Reihenfolge. </li><li> Nach der Zentrifugation den Überstand, kombinieren Pellets und resuspendieren sedimentierten Zellen in 4 ml PBS. </li><li> Sorgfältig Layer 2 ml der Resuspension auf jede der Steigungen. </li><li> Zentrifuge für 20 Minuten bei 800 xg ohne Bremse. </li><li> Nach der Zentrifugation zu entfernen oberste Schicht und die meisten der 65%-Schicht mit PBMCs und sammeln weißen verbleibenden Interphase bis 85%-Schicht in neue Falcon-Röhrchen. </li><li> Wash-Zellen durch Auffüllen der Falcon-Röhrchen mit PBS und Zentrifuge für 10 Minuten bei 300 x g. </li><li> Entfernen Überstand und resuspendieren sedimentierten Zellen (in der Regel&gt; 95% sind PMN) in 2 ml PBS. </li><li> Zählen von Zellen mit einer Zählkammer. </li></ol> 2. Aktivieren PMNs <ol><li> Bereiten Sie eine 24-well Zellkulturplatte, indem eine sterile 13 mm runden Deckglas (# 1,5) in jedes Well </li><li> Seed 2 x 10 5 Zellen in 500μl RPMI (mit 2% humanem Serum Albumin) pro Well und Inkubation für 1 Stunde in CO 2-Inkubator bei 37 ° C. </li><li> In der Zwischenzeit bereiten 600 nM PMA-Lösung in RPMI und fügen die Zellen 100 &amp;mgr; pro Vertiefung. Inkubieren von 15 min bis 4 h in CO 2-Inkubator bei 37 ° C. </li><li> Fix-Zellen in 4% (Endkonzentration) Paraformaldehyd in PBS gelöst. </li></ol> PMA dient als positive Kontrolle und ist bis heute die stärkste Agent NET zu induzieren. Alternativ können auch andere Reize oder die Co-Kultivierung mit Krankheitserregern für NET Induktion verwendet werden. Der jeweilige Status der NET-Bildung kann überprüft während der Zeit natürlich verläuft, wenn zusätzliche parallele Proben vorbereitet werden. Wenn ein Nicht-Permeationsmittel DNA-Farbstoff wie Sytox Green (Invitrogen), die nicht fixierten Zellen aufgenommen wird, werden nur extrazelluläre DNA nachgewiesen werden. Seit der Gründung von neuen NETs ist irgendwie in der Gegenwart von Sytox beeinträchtigt, für jeden Zeitpunkt eine parallele Probe verwendet werden. 3. NET-Erkennung durch Immunomarkierung NETs sind sehr zerbrechlich, auch nach der Fixierung und müssen mit großer Vorsicht behandelt werden, sonst wird die Mehrheit bei der Vorbereitung zu verlieren. <ol><li> Entfernen Sie vorsichtig Glasdeckgläschen mit anhaftenden Zellen aus 24-well Platte, indem Sie ihn bis an den Rand mit einer gebogenen Nadel und nutzen sie mit einer feinen Pinzette. Legen Sie das Deckglas umgekehrt auf einen Tropfen PBS. Dies kann auf einer Parafilm Blatt für ein Reagenzglas stand durchgeführt werden. Wash wie dieses 3-mal für 5 min. </li><li> Inkubieren Deckgläser auf die gleiche Weise in einem Rückgang von 0,5% Triton X-100 für 1 min bei RT Zellen permeabilisieren zu. Wash 3 mal in PBS für 1 min. </li><li> Bereiten Sie eine feuchte Kammer mit Parafilm und einem feuchten Tuch. Legen Sie das Deckgläschen kopfüber auf einen Tropfen Blockierungspuffer (5% Esel-Serum) und Inkubation für 30 min bei 37 ° C. </li><li> Verdünnen Primärantikörper, zB ms anti Histon und rb anti Neutrophile Elastase, in Blocking-Puffer. </li><li> Transfer Deckgläser in der feuchten Kammer direkt aus Blockierungspuffer auf einen Rückgang des primären Antikörpers und Inkubation für 1 h bei 37 ° C. </li><li> 3 x je 5 min mit PBS. </li><li> Verdünnen Sekundärantikörper, zB dk anti ms Cy2 und dk anti rb Cy3, in Blocking-Puffer. </li><li> Transfer Deckgläser in die feuchte Kammer auf einen Rückgang des sekundären Antikörper und Inkubation für 1 h bei 37 ° C. </li><li> 3 x je 5 min mit PBS. Abhängig von Ihrer Fluoreszenzmikroskopie Optionen Fleck DNA für 5 min entweder mit Hoechst 33342 (1 pg / ml), die UV-Anregung oder mit Draq5 für weit roten Anregung benötigen und waschen zweimal mit dest. Wasser. </li><li> Setzen Sie einen 20 &amp;mgr; l Tropfen Mowiol auf einen Objektträger und montieren Deckgläser mit Zellen auf den Kopf. Die Zellen müssen zwischen dem Deckglas und dem Objektträger werden. Die Tropfen Mowiol bilden eine dünne Schicht von homogenen Dicke, wenn das Deckglas auf den Tropfen positioniert ist. Normalerweise ist es nicht erforderlich, um die Probe zu drücken. Wenn Sie nicht Immersionslinsen verwenden möchten, wird die Probe zur Inspektion bereit.Für mikroskopische Analyse mit Immersionslinsen, lassen Sie die Probe trocken für etwa 1 Stunde, bis die Mowiol am Rand der Probe erstarrt ist. </li></ol> 4. Vorbereitung NETs für Rasterelektronenmikroskopie (SEM) <ol><li> Beitrag fix Zellen auf der Glasdeckgläschen in 24-Well-Platte mit 2,5% Glutaraldehyd. </li><li> Entfernen Glasdeckgläschen enthält Zellen, die aus 24-well Platten und legte den Kopf auf einen Tropfen Wasser. Wash wie dieses 3-mal für 5 min. </li><li> Transfer Deckgläschen wieder in 24-well Zellkulturplatte mit 0,5% OsO4 und Inkubation für 30 min. </li><li> Entfernen Glasdeckgläschen enthält Zellen, die aus 24-well Platten und legte den Kopf auf einen Tropfen Wasser. Wash wie dieses 3-mal für 5 min. </li><li> Transfer Deckgläschen wieder in 24-well Zellkulturplatte mit 1% Gerbsäure und Inkubation für 30 min. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 4,2 bis 4,4 </li><li> Entwässern durch die folgende Therapie (5min pro Stück): <ul><li> 30% Ethanol </li><li> 50% Ethanol </li><li> 70% Ethanol </li><li> 80% Ethanol </li><li> 90% Ethanol </li><li> 100% Ethanol </li><li> 100% Ethanol </li><li> 100% Ethanol </li></ul></li><li> Transfer Deckgläser in kritischen Punkt Trockner und trockenen Proben. </li><li> Coat Oberfläche der Probe mit 5 nm Platin / Kohlenstoff-Schicht mit Dünnschichtverdampfer </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Die Isolierung Methode ergibt in der Regel nicht stimulierten lebensfähig Neutrophilen mit einer Reinheit von mehr als 95%. Wenn zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Stimulation fixiert, zeigt die Immunfärbung Protokoll die Reihenfolge der morphologischen Veränderungen während NETosis Zelle Abflachung, Verlust der nuklearen Läppchen, Verlust von Granulat und Kern Integrität, die eine zunehmende Überschneidung der Kernenergie (dh Histon) und körnig (dh führt Neutrophile Elastase) Färbung. Dieses Protokoll kann als Ausgangspunkt, um die spezifischen Interaktionen von Pathogenen mit neutrophilen Granulozyten zu analysieren dienen. Diese Wechselwirkung kann in größerem Detail mit der Vorbereitung Protokoll für Scanning Electron Microscopy seziert werden. NET Fluorescence Beispiel der stimulierten Neutrophilen für NET-Komponenten (blau = DNA, rot = Histon, grün = Neutrophile Elastase) gefärbt. Die Bilder zeigen neben den NET-Lokalisierung, die nukleäre Lokalisation von DNA und Histonen und das körnige Muster für Neutrophile Elastase. SEM PMA-Stimulation Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme zeigt nicht stimuliert und PMA-stimulierten neutrophilen Granulozyten. Nach Stimulation, glätten die Neutrophilen aus und produzieren NETs. SEM NETs und Shigella Höhere Auflösung REM-Aufnahme von Shigella Bakterien in NETs gefangen.

<ol>
	<li>Brinkmann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303, 1532-1535 .</li><li>Urban, C. F., Reichard, U., Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+capture+and+kill+Candida+albicans+yeast+and+hyphal+forms.">Neutrophil extracellular traps capture and kill Candida albicans yeast and hyphal forms.</a> Cell Microbiol. 8, 668-676 (2006).</li><li>M, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leishmania+amazonensis+promastigotes+induce+and+are+killed+by+neutrophil+extracellular+traps.">Leishmania amazonensis promastigotes induce and are killed by neutrophil extracellular traps.</a> PNAS. 106, 6748-6753 (2009).</li><li>Buchanan, J. T., Simpson, A. J., Aziz, R. K., Liu, G. Y., Kristian, S. A., Kotb, M., Feramisco, J., Nizet, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNase+expression+allows+the+pathogen+group+A+Streptococcus+to+escape+killing+in+neutrophil+extracellular+traps.">DNase expression allows the pathogen group A Streptococcus to escape killing in neutrophil extracellular traps.</a> Curr Biol. 14, 396-400 (2006).</li><li>Fuchs, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps.">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176, 231-241 (2007).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beneficial+suicide:+why+neutrophils+die+to+make+NETs.">Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs.</a> Nat Rev Microbiol. 5, 577-582 (2007).</li><li>Aga, E., Katschinski, D. M., van Zandbergen, G., Laufs, H., Hansen, B., Muller, K., Solbach, W., Laskay, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+the+spontaneous+apoptosis+of+neutrophil+granulocytes+by+the+intracellular+parasite+Leishmania+major.">Inhibition of the spontaneous apoptosis of neutrophil granulocytes by the intracellular parasite Leishmania major.</a> J Immunol. , 169-898 (2002).</li></ol>

Die zur Verfügung gestellten Protokoll ermöglicht die Trennung von nicht stimulierten Neutrophilen auf erhebliche Reinheit, die Induktion von NET Bildung und die Analyse der morphologischen Veränderungen während NETosis. Beim Umgang mit den Proben mit Sorgfalt, dh rauen Wasch-Bedingungen, die in den Verlust des größten Teils der lose NETs Ergebnis zu vermeiden, kann die Menge des NET-Bildung unter verschiedenen Bedingungen Stimulation (Dauer, Stimulus) verglichen werden. Neutrophilen / Pathogen-Interaktionen, Folge von Reizen, Zusammenspiel mit anderen Immunzellen: In dieser Hinsicht kann das mitgelieferte Protokolle als Ausgangspunkt, um Methoden zu etablieren, um anspruchsvollere Szenarien analysieren dienen.

neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them

Neutrophile Granulozyten sind die häufigsten Gruppe von Leukozyten in das periphere Blut. Als professionelle Phagozyten, sie zu verschlingen Bakterien und töten sie intrazellulär, wenn ihre antimikrobielle Granula verschmelzen mit dem Phagosom. Wir fanden, dass Neutrophile eine zusätzliche Möglichkeit der Abtötung von Mikroorganismen haben: bei Aktivierung, geben sie Granulat Proteine ​​und Chromatin, die zusammen extrazelluläre Fasern binden Krankheitserreger. Diese neuartigen Strukturen oder Neutrophil Extracellular Traps (NETs), degradieren Virulenzfaktoren und töten Bakterien 1, 2 und Pilze Parasiten 3. Die strukturelle Rückgrat der NETs ist die DNA, und sie sind schnell abgebaut in Gegenwart von DNasen. So sind Bakterien exprimiert DNasen virulenter 4. Mit korrelative Mikroskopie kombiniert TEM, SEM, Immunfluoreszenz und Live Cell Imaging Verfahren konnten wir zeigen, dass nach Stimulation, die Kerne der Neutrophilen ihre Form verlieren und die EU-und Heterochromatin zu homogenisieren. Später zerfallen die Kernhülle und das Granulat Membranen ermöglicht das Mischen von NET-Komponenten. Schließlich werden die NETs als die Zellmembran Pausen freigegeben. Das Zelltod-Programm (NETosis) unterscheidet sich von Apoptose und Nekrose und hängt von der Generation von reaktiven Sauerstoffspezies durch NADPH-Oxidase-5. Neutrophile extrazelluläre Fallen sind reichlich an den Standorten der akuten Entzündung. NETs scheint eine Form der angeborenen Immunantwort sein, dass zu binden Mikroorganismen, Verhütung ihrer Ausbreitung, und sorgen für eine hohe lokale Konzentration von antimikrobiellen Wirkstoffen zu Virulenzfaktoren erniedrigen und töten Krankheitserreger so dass Neutrophile auf ihre antimikrobielle Funktion auch über ihre Lebensdauer zu erfüllen. Es gibt zunehmend Hinweise, jedoch, dass die NETs auch in Krankheiten, die beteiligten reichen von Autoimmunsyndrome zu Unfruchtbarkeit 6. Wir beschreiben Methoden zur neutrophilen Granulozyten aus peripherem menschlichem Blut 7 zu isolieren und sie dazu anregen NETs zu bilden. Auch wir sind Protokolle, um die Netze in Licht-und Elektronenmikroskopie zu visualisieren.

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Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) sind ein wichtiger angeborenen Immunsystems Mechanismus auf pathogene Bakterien, Pilze und Parasiten zu kämpfen. Hier beschreiben wir Methoden, um neutrophilen Granulozyten aus menschlichem Blut zu isolieren und sie zu aktivieren, um NETs zu bilden. Wir präsentieren Vorbereitung Techniken, um NETs in Licht-und Elektronenmikroskopie zu visualisieren.

Neutrophil Extracellular Traps: So erzeugen und zu visualisieren

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

86.1K Aufrufe.  Max Planck Institute for Infection Biology. Neutrophil Extracellular Traps (NETs) sind ein wichtiger angeborenen Immunsystems Mechanismus auf pathogene Bakterien, Pilze und Parasiten zu kämpfen. Hier beschreiben wir Methoden, um neutrophilen Granulozyten aus menschlichem Blut zu isolieren und sie zu aktivieren, um NETs zu bilden. Wir präsentieren Vorbereitung Techniken, um NETs in Licht-und Elektronenmikroskopie zu visualisieren.

Serie: Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role in fighting infections, recent research has demonstrated that they may be involved in many other disease processes, including cancer progression. Isolating purified NETs is a crucial element to allow the study of these functions.
In this video, we demonstrate a simplified method of cell free NET isolation from human whole blood using readily available reagents. Isolated NETs can then be used for immunofluorescence staining, blotting or various functional assays. This enables an assessment of their biologic properties in the absence of the potential confounding effects of neutrophils themselves.
A density gradient separation technique is employed to isolate neutrophils from healthy donor whole blood. Isolated neutrophils are then stimulated by phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) to induce NETosis. Activated neutrophils are then discarded, and a cell-free NET stock is obtained.
We then demonstrate how isolated NETs can be used in an adhesion assay with A549 human lung cancer cells. The NET stock is used to coat the wells of a 96 well cell culture plate O/N, and after ensuring an adequate NET monolayer formation on the bottom of the wells, CFSE labeled A549 cells are added. Adherent cells are quantified using a Nikon TE300 fluorescent microscope. In some wells, 1000U DNAse1 is added 10 min before counting to degrade NETs

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

In the following protocol, we describe a very simple way to isolate Neutrophil Extracellular traps (NETs) from human whole blood using readily available reagents. We then demonstrate how the isolated NETs can be used in an in vitro adhesion assay with cancer cells.

Vereinfachte Menschen Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolierung und Handhabung

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of lipids. The function of lipids (e.g., in host-pathogen interactions or host entry) has been reported to play a crucial role in cellular processes. Here, we show a method to determine lipid composition, with a focus on the cholesterol level of primary blood-derived neutrophils, by HPTLC in comparison to high performance liquid chromatography (HPLC). The aim was to investigate the role of lipid/cholesterol alterations in the formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NET release is known as a host defense mechanism to prevent pathogens from spreading within the host. Therefore, blood-derived human neutrophils were treated with methyl-&#946;-cyclodextrin (M&#946;CD) to induce lipid alterations in the cells. Using HPTLC and HPLC, we have shown that M&#946;CD treatment of the cells leads to lipid alterations associated with a significant reduction in the cholesterol content of the cell. At the same time, M&#946;CD treatment of the neutrophils led to the formation of NETs, as shown by immunofluorescence microscopy. In summary, here we present a detailed method to study lipid alterations in neutrophils and the formation of NETs.

Lipids are known to play an important role in cellular functions. Here, we describe a method to determine the lipid composition of neutrophils, with emphasis on the cholesterol level, by using both HPTLC and HPLC to gain a better understanding of the underlying mechanisms of neutrophil extracellular trap formation.

Methoden Lipidveränderungen in Neutrophilen und die anschließende Bildung von Neutrophilen Extracellular Traps zu studieren

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal microscopy methods to visualize macrophage extracellular traps (METs). These extracellular traps are defined by the presence of extracellular chromatin with co-expression of other components such as granule proteases, citrullinated histones, and peptidyl arginase deiminase (PAD). The expression of METs is generally measured after exposure to a stimulus and compared to un-stimulated samples. Samples are also included for background and isotype control. Cells are analyzed using well-defined image analysis software. Confocal microscopy may be used to define the presence of METs both in vitro and in vivo in lung tissue.

Macrophage extracellular traps are a newly described entity. This article will concentrate on confocal microscopy methods and how they are visualized in vitro and in vivo from lung samples.

Visualisierung von Makrophagen extrazelluläre fallen mit der konfokalen Mikroskopie

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. Immunofluorescence microscopy and image-based quantification methods remain important tools to quantitate neutrophil extracellular trap formation. However, there are key limitations to the immunofluorescence-based methods that are currently available for quantifying NETs. Manual methods of image-based NET quantification are often subjective, prone to error and tedious for users, especially non-experienced users. Also, presently available software options for quantification are either semi-automatic or require training prior to operation. Here, we demonstrate the implementation of an automated immunofluorescence-based image quantification method to evaluate NET formation called NETQUANT. The software is easy to use and has a user-friendly graphical user interface (GUI). It considers biologically relevant parameters such as an increase in the surface area and DNA:NET marker protein ratio, and nuclear deformation to define NET formation. Furthermore, this tool is built as a freely available app, and allows for single-cell resolution quantification and analysis.

Here, we present a protocol for generating neutrophil extracellular traps (NETs) and operating NETQUANT, a fully automatic software option for quantification of NETs in immunofluorescence images.

Automatisierte bildbasierte Quantifizierung von neutrophilen extrazellulären Fallen mit NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. NETs have been demonstrated to serve as an important host defense mechanism that traps and kills microorganisms. On the other hand, they have been implicated in diverse systemic autoimmune diseases. NETs are immunogenic and toxic structures that contain a pool of relevant autoantigens including anti-neutrophil cytoplasmic antibodies (ANCA)-associated vasculitis (AAV) and systemic lupus erythematosus (SLE). Different forms of NETs can be induced depending on the stimulus. The amount of NETs can be quantified using different techniques including measuring DNA release in supernatants, measuring DNA-complexed with NET-molecules like myeloperoxidase (MPO) or neutrophil elastase (NE), measuring the presence of citrullinated histones by fluorescence microscopy, or flow cytometric detection of NET-components which all have different features regarding their specificity, sensitivity, objectivity, and quantity. Here is a protocol to quantify ex vivo NET formation in a highly-sensitive, high-throughput manner by using three-dimensional immunofluorescence confocal microscopy. This protocol can be applied to address various research questions about NET formation and degradation in health and disease.

This protocol describes a highly sensitive and high throughput neutrophil extracellular trap (NET) assay for the semi-automated quantification of ex vivo NET formation by immunofluorescence three-dimensional confocal microscopy. This protocol can be used to evaluate NET formation and degradation after different stimuli and can be used to study potential NET-targeted therapies.

Ein High-Throughput-Assay zu beurteilen und zu quantifizieren Neutrophilenzahl extrazelluläre Trap Bildung

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. ...

Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by neutrophils in response to systemic inflammation or pathogens. Although NETs have previously been shown to augment clot formation and inhibit fibrinolysis in humans and dogs, the role of NETs in cats with cardiogenic arterial thromboembolism (CATE), a life-threatening complication secondary to hypertrophic cardiomyopathy, is unknown. A standardized method to identify and quantify NETs in cardiogenic arterial thrombi in cats will advance our understanding of their pathological role in CATE. Here, we describe a technique to identify NETs in formaldehyde-fixed and paraffin-embedded thrombi within the aortic bifurcation, extracted during necropsy. Following deparaffinization with xylene, aortic sections underwent indirect heat-induced antigen retrieval. Sections were then blocked, permeabilized, and ex vivo NETs were identified by colocalization of cell-free DNA (cfDNA), citrullinated histone H3 (citH3), and neutrophil elastase (NE) using immunofluorescence microscopy. To optimize the immunodetection of NETs in thrombi, autofluorescence of tissue elements was limited by using an autofluorescence quenching process prior to microscopy. This technique could be a useful tool to study NETs and thrombosis in other species and offers new insights into the pathophysiology of this complex condition.

We describe a method to identify neutrophil extracellular traps (NETs) in formaldehyde-fixed and paraffin-embedded feline cardiogenic arterial thrombi using heat-induced antigen retrieval and a double immunolabeling protocol.

Identifizierung von Neutrophilen extrazellulären Fallen in Paraffin-Embedded Feline Arteriellen Thrombi mittels Immunfluoreszenzmikroskopie

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by ...

Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of neutrophil extracellular traps (NETs). This study analyzes the morphological and compositional changes in NETs induced by microbial and chemical stimuli using standardized in vitro methodologies for NET induction and characterization with human cells. The procedures described here allow the analysis of NET morphology (lytic or non-lytic) and composition (DNA-protein structures and enzymatic activity), and the effect of soluble factors or cellular contact on such characteristics. Additionally, the techniques described here could be modified to evaluate the effect of exogenous soluble factors or cellular contact on NET composition.
The applied techniques include the purification of polymorphonuclear cells from human peripheral blood using a double density gradient (1.079-1.098 g/mL), guaranteeing optimal purity and viability (&#8805; 95%) as demonstrated by Wright's staining, trypan blue exclusion, and flow cytometry, including FSC versus SSC analysis and 7AAD staining. NET formation is induced with microbial (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, and Candida albicans) and chemical (phorbol myristate acetate, HOCl) stimuli, and the NETs are characterized by DNA-DAPI staining, immunostaining for the antimicrobial peptide cathelicidin (LL37), and quantification of enzymatic activity (neutrophil elastase, cathepsin G, and myeloperoxidase). The images are acquired through fluorescence microscopy and analyzed with ImageJ.

Presented here is a protocol for the induction and analysis of in vitro neutrophil extracellular traps (NETs). Quantification of DNA, cathelicidin (LL37), and enzyme activity yielded data that show the variability in the composition and morphology of NETs induced by microbial and chemical stimuli under similar controlled conditions.

Morphologische und kompositorische Analyse von neutrophilen extrazellulären Fallen, die durch mikrobielle und chemische Reize induziert werden

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures composed of DNA with granule proteins, such as myeloperoxidase (MPO) and neutrophil elastase (NE), and cytoplasmic and cytoskeletal proteins. Although interest in NETs has increased recently, no sensitive, reliable assay method is available for measuring NETs in clinical settings. This article describes a modified sandwich enzyme-linked immunosorbent assay to quantitatively measure two components of circulating NETs, MPO-DNA and NE-DNA complexes, which are specific components of NETs and are released into the extracellular space as breakdown products of NETs. The assay uses specific monoclonal antibodies for MPO or NE as the capture antibodies and a DNA-specific detection antibody. MPO or NE binds to one site of the capture antibody during the initial incubation of samples containing MPO-DNA or NE-DNA complexes. This assay shows good linearity and high inter-assay and intra-assay precision. We used it in 16 patients with COVID-19 with accompanying acute respiratory distress syndrome and found that the plasma concentrations of MPO-DNA and NE-DNA were significantly higher than in the plasma obtained from healthy controls. This detection assay is a reliable, highly sensitive, and useful method for investigating the characteristics of NETs in human plasma and culture supernatants.

We present a protocol for a modified sandwich enzyme-linked immunosorbent assay technique to quantitatively measure two components of neutrophil extracellular trap remnants, myeloperoxidase conjugated-DNA and neutrophil elastase conjugated-DNA complexes,derived from activated neutrophils.

Quantifizierung von Myeloperoxidase-DNA- und neutrophilen Elastase-DNA-Komplexen aus extrazellulären Neutrophilenfallen unter Verwendung eines modifizierten Sandwich-ELISA

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

Färbung und Bildgebung zur Visualisierung extrazellulärer Fallen von Neutrophilen

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in autoimmune diseases and sterile inflammation. They are web-like structures composed of double-stranded DNA filaments, histones, and antimicrobial proteins. Once released, NETs can trap and kill extracellular pathogens in blood and tissue. Furthermore, NETs participate in homeostatic regulation by stimulating platelet adhesion and coagulation. However, the dysregulated production of NETs has also been associated with various diseases, including sepsis or autoimmune disorders, which makes them a promising target for therapeutic intervention. Apart from electron microscopy, visualizing NETs using immunofluorescence imaging is currently one of the only known methods to demonstrate NET interactions in tissue. Therefore, various staining methods to visualize NETs have been utilized. In the literature, different staining protocols are described, and we identified four key components showing high variability between protocols: (1) the types of antibodies used, (2) the usage of autofluorescence-reducing agents, (3) antigen retrieval methods, and (4) permeabilization. Therefore, in vitro immunofluorescence staining protocols were systemically adapted and improved in this work to make them applicable for different species (mouse, human) and tissues (skin, intestine, lung, liver, heart, spinal disc). After fixation and paraffin-embedding, 3 &#181;m thick sections were mounted onto slides. These samples were stained with primary antibodies for myeloperoxidase (MPO), citrullinated histone H3 (H3cit), and neutrophil elastase (NE) according to a modified staining protocol. The slides were stained with secondary antibodies and examined using a widefield fluorescence microscope. The results were analyzed according to an evaluation sheet, and differences were recorded semi-quantitatively.
Here, we present an optimized NET staining protocol suitable for different tissues. We used a novel primary antibody to stain for H3cit and reduced non-specific staining with an autofluorescence-reducing agent. Furthermore, we demonstrated that NET staining requires a constant high temperature and careful handling of samples.

Autor im Rampenlicht: Bildgebung extrazellulärer Neutrophilenfallen in Geweben von Mensch und Maus 

Neutrophil extracellular traps (NETs) are associated with various diseases, and immunofluorescence is often used for their visualization. However, there are various staining protocols, and, in many cases, only one type of tissue is examined. Here, we establish a generally applicable protocol for staining NETs in mouse and human tissue.

Immunfluoreszenz-Bildgebung von neutrophilen extrazellulären Fallen in menschlichen und Mausgeweben

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...