Der korrespondierende Autor wurde von Morris Animal Foundation (D15CA-907) finanziert. Die Studie wurde unterstützt durch Mittel aus der University of California, Davis, Zentrum für Pferdegesundheit und Center for Companion Animal Health (2016-24-F). Die Autoren möchten Geena Ng für ihre Unterstützung bei der Figuren und Nghi Nguyen für ihre Hilfe mit dem Video zu erkennen.

Alle hier beschriebene Methoden wurden durch die institutionelle Animal Care and Use Committee an der University of California, Davis genehmigt (Protokoll Nummer: 18338).
1. Blutentnahme
<ol><li>Ziehen Sie 10 mL Blut aus entweder der cephalic oder Vena Ader mit einer Nadel 21 G durch Spritze absaugen.</li>
	<li>Um übermäßige Schubspannung zu vermeiden, entfernen Sie die Nadel von der Spritze vor der Übertragung von Blut in Tube(n) mit Natrium Heparin (75 USP). Die Rohre invertieren sanft ein paar Mal um ausreichende Vermischung von Antigerinnungsmittel und Blut zu gewährleisten. Fragen Sie nach belegen Klumpen oder Erythrozyten Aggregate, bevor Sie die Proben auf Eis legen.</li>
</ol>(2) Neutrophilen Isolation
<ol><li>Verdünnen Sie Anticoagulated Blut mit ein gleiches Volumen an eiskaltem Dubecco Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DPBS) (pH 7.4, ohne zweiwertigen kationen). Übertragen Sie 8 mL verdünnte Blut in ein 50 mL Polypropylen konischem Rohr mit 25 mL 3 % Dextran (von Leuconostoc spp. in 0,9 % Natriumchlorid-Lösung aufgelöst). Legen Sie das Rohr aufrecht bei Raumtemperatur für 30 min, Aggregation und Sedimentation der Erythrozyten zu ermöglichen.</li>
	<li>Sorgfältig Schicht 5 mL Leukozyten-Rich Plasma (Abbildung 1) auf der Oberseite 5 mL Dichte Gradienten Medien in einem 14 mL Polypropylen Rundboden Röhrchen. Achten Sie darauf, dass Sie nicht die 2 Lösungen11mischen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Rohre bei 400 X g mit Beschleunigung/Verzögerung (A/D) Wert 0 (keine Bremse) für 30 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Mit einer 5 mL serologische pipettieren Sammeln der Granulozyten Zellschicht durch Umgehung der Plasma und peripheren mononukleären Zellen (PBMC) Schichten (Abbildung 1). Verwenden Sie eine neue pipettieren jedes Mal um Kontamination zu minimieren.</li>
	<li>Platz 4 bis 6 mL von der Polymorphnuclear (PMN) Zellschicht in ein 50 mL Polypropylen konischem Rohr. Da eine kleine Menge der Erythrozyten Aggregate zusammen mit dem PMN-Layer abgesaugt werden kann, verwenden Sie eine 1 mL serologische pipettieren, entfernen Sie vorsichtig die Erythrozyten-Aggregate, die an der Unterseite des Rohres ausgeglichen werden.</li>
	<li>Lösen Sie die verbleibenden Erythrozyten mit 20 mL kalte Reinstwasser. Invertieren Sie sanft das Rohr mehrmals für 30 bis 60 s angemessene Lyse bevor Sie hinzufügen ein gleiches Volumen an eiskaltem 1,8 % Natriumchlorid-Lösung zu gewährleisten.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie bei 112 X g für 10 min bei 4 ° C, A/D auf 0 gesetzt.</li>
	<li>Wiederholen Sie den Erythrozyten Lyse Schritt, wenn dieser Pellet rot angezeigt wird. Verwerfen des Überstands vorsichtig mit einer serologischen pipettieren und sanft Aufschwemmen das Pellet in 100 µL des DPBS (5 mM Traubenzucker, 0,9 mM MgCl2, 1,9 mM CaCl2 und 1 % Rinderserumalbumin, pH 7,3). Kombinieren Sie alle resuspendierte Zellen zu und auf Eis.</li>
	<li>Führen Sie einer Zellzahl mit einer automatisierten Zelle-Analyzer und überprüfen Sie die Anzahl die durch eine Hemocytometer. Bei Bedarf konzentrieren Sie PMNs auf einen Objektträger mit einer Cytocentrifuge (1.000 u/min, 5 min) und bestimmen Sie den Anteil der Neutrophilen durch zählen der Anzahl der Neutrophilen aus der Gesamtzahl der Zellen zu.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Lebensfähigkeit der Neutrophilen durch einen Trypan blau Ausschluss Test wie beschrieben durch Strober Et al. 12 erfolgreiche Isolierung sollte eine Tragfähigkeit von 95 zu 100 % Ausbeute und Neutrophilen sollte mehr als 95 %.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Konzentration von Neutrophilen Granulozyten durch Multiplikation der gesamten Zellenzahl mit die prozentuale Rentabilität und Prozent Neutrophilen. Erfolgreiche Isolierung sollte eine Konzentration von Neutrophilen von 1,5 6 x 106/mL nachgeben.</li>
	<li>Verdünnen Sie Neutrophile, eine Endkonzentration von 1 x 106/mL mit DPBS mit 0,9 mM MgCl2, 5 mM Traubenzucker, 1,9 mM CaCl2und 1 % Rinderserumalbumin mit pH 7.3 angepasst.</li>
</ol>(3) Fluoreszenz Mikroskopie der Live Neutrophilen
<ol><li>Platz 200 bis 400 μl der Neutrophilen (1 x 106/mL) in jede Vertiefung eine Poly-L-Lysin beschichtet Kultur 12-Well-Platte. Neutrophile, auf den Boden der Näpfchen zu halten, indem die Zellen bei 37 ° C für 30 min Inkubation zu ermöglichen.</li>
	<li>Beschriften Sie Nukleinsäuren mit 1 μM eines zwei Nukleinsäure-Farbstoffe, die in den Zellen mit intakten Membranen Flecken und die Flecken in Zellen mit durchlässigen Membranen (siehe Tabelle der Materialien), für 10 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Aktivieren von Neutrophilen mit 100 μg/mL Lipopolysaccharid (LPS) (E. Coli O55. (B5), 100 nM Phorbol Myristate-12 13-Acetat (PMA) als Positivkontrolle oder gleichwertigem Umfang des DPBS als Negativkontrolle für 180 min bei 37 ° C.</li>
	<li>Abrufen von Bildern mit der GFP (Anregung: 470/22 nm, Emission: 525/50 nm) und Texas Red-Kanäle (Anregung: 585/29 nm, Emission: 628/32 nm) auf ein Fluoreszenz-Mikroskopie bei 40 X Vergrößerung zu den folgenden Zeitpunkten: 30, 90, 120 oder 180 Minuten.</li>
</ol>4. Netto-Quantifizierung und Erkennung von NET-Komponenten mit Immunfluoreszenz
<ol><li>Legen Sie vorsichtig 18 mm Durchmesser Poly-D-Lysin beschichtet Deckel rutscht in die Vertiefungen einer Kultur 12-Well-Platte. Beschriften Sie die Brunnen entsprechend.</li>
	<li>Samen 100 bis 200 μL der Neutrophilen (1 x 106/mL) direkt auf den Deckgläsern isoliert und Neutrophilen zur Einhaltung des Deckel rutscht durch Inkubation der Zellen bei 37 ° C für 30 min ermöglichen.</li>
	<li>Neutrophilen zu aktivieren, wie in 3.3 beschrieben. Hemmen Sie NET Bildung von Neutrophilen mit 200 µΜ Vorbehandeln Cl-Amidine (15 min, 37 ° C) vor der Aktivierung wie oben beschrieben von Li Et Al. 13 stellen Sie sicher, dass die ordnungsgemäße Fahrzeugkontrolle (DMSO) in das Experiment enthalten ist.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig die Abdeckung rutscht mit feinen Pinzette. Schicht eine Paraffin-Film-Blatt über ein Reagenzglas stehen seichte Brunnen erstellen und geben Sie 2 bis 3 Tropfen 4 % PFA in jeweils gut10. Beschriften Sie die Brunnen entsprechend und legen Sie sanft das Deckel rutscht kopfüber auf die PFA-gefüllte Vertiefungen. Können Sie Zellen bei Raumtemperatur für 20 min behoben werden.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen 3 Mal in DPBS für 5 min, indem Sie sie aus einem Brunnen zum nächsten verschieben.</li>
	<li>Wenn Immunolabelling kurz nach der Neutrophilen Aktivierung und Fixierung durchgeführt werden kann, ermöglichen Sie Deckel rutscht luftgetrocknet, indem der Deckel rutscht nach oben auf ein Stück Papier Extinktion zu sein. Deckel rutscht kann bis zur weiteren Analyse bis zu 1 Woche aufgedeckt in einer beschrifteten 12-Well-Kultur-Platte bei 4 ° C aufbewahrt. Waschen Sie die Zellen 3 Mal in DPBS für 1 min mit der gleichen Technik wie unter 4.4 bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.</li>
	<li>Um Zellen permeabilize, sanft lag das Deckglas auf den Kopf gestellt auf einen Rückgang von 1 % NP-40 für 1 min mit der Technik in 4.4 beschrieben. Waschen Sie 3 mal 1 min auf einer Wippe in DPBS.</li>
	<li>Nach dem Zufallsprinzip eine Reihe weisen Sie jede Probe zu und verwenden Sie eine Diamant-Markierung, um den Deckgläsern entsprechend zu kennzeichnen.</li>
	<li>Bereiten und Label individuelle Petrischalen mit Paraffin Film ausgekleidet und legen 100 bis 200 μL der 5 % ziegenserum auf den Film (blocking-Puffer). Legen Sie die Deckgläsern kopfüber auf den blockierenden Puffer. Legen Sie auf einer Wippe und 1 h bei 37 ° c inkubieren</li>
	<li>Waschen Sie 3 Mal für 5 min auf einer Wippe in DPBS.</li>
	<li>Verdünnen Sie den primären Antikörper (1: 400 Kaninchen polyklonale Anti-citrullinierte Histon H3 (citH3) in 5 % ziegenserum). Inkubieren Sie Zellen in beschrifteten Petrischalen mit Paraffin Film ausgekleidet. Legen Sie jedes Deckglas kopfüber auf 50 bis 100 μL der verdünnten Antikörper-Lösung. Legen Sie auf einer Wippe und 1 h bei 37° c inkubieren</li>
	<li>Waschen Sie 3 Mal für 5 min auf einer Wippe in DPBS.</li>
	<li>Verdünnte Sekundärantikörpers konjugiert zu einem Fluorophore (1: 200) in 5 % ziegenserum. Inkubieren Sie Zellen in beschrifteten Petrischalen mit Paraffin Film ausgekleidet. Legen Sie jedes Deckglas kopfüber auf 50 bis 100 μL der verdünnten Antikörper-Lösung. Legen Sie auf einer Wippe und inkubieren Sie 1 h bei 37 ° C im Dunkeln.</li>
	<li>Waschen Sie 3 Mal in DPBS für 5 min auf einer Wippe in die Dunkelheit.</li>
	<li>Für die gleichzeitige Erkennung von Myeloperoxidase (MPO) die folgenden Schritte für eine modifizierte Doppel Immunolabeling Protokoll wie von Li Et Al. beschrieben 13
</li>
	<li>Inkubieren Sie Zellen in beschrifteten Petrischalen mit Paraffin Film ausgekleidet. Legen Sie jedes Deckglas kopfüber auf 100 bis 200 μl 10 % Kaninchen Serum unter sanftes Schaukeln (Übernachtung, 4 ° C, im Dunkeln).</li>
	<li>Waschen Sie 3 Mal in DPBS für 5 min auf einer Wippe in die Dunkelheit.</li>
	<li>Inkubieren Sie Zellen in 50 μg/mL unconjugated Ziege Anti-Kaninchen-Fab für 2 h bei Raumtemperatur auf einem Rocker im Dunkeln Fragmente.</li>
	<li>Waschen Sie 3 Mal in DPBS für 5 min auf einer Wippe in die Dunkelheit.</li>
	<li>Verdünnen Sie Primärantikörper (1: 200 Kaninchen polyklonale Anti-Human MPO Antikörper) in 5 % ziegenserum. Inkubieren Sie Zellen in beschrifteten Petrischalen mit Paraffin Film ausgekleidet. Legen Sie jedes Deckglas kopfüber auf 50 bis 100 μL der verdünnten Antikörper-Lösung. Legen Sie auf einer Wippe und inkubieren Sie 1 h bei 37° C im Dunkeln.</li>
	<li>Verdünnen Sie Sekundärantikörpers konjugiert zu einem Fluorophor in 5 % ziegenserum und inkubieren Sie wie beschrieben in 4,8</li>
	<li>Waschen Sie 3 Mal in DPBS für 5 min auf einer Wippe in die Dunkelheit.</li>
	<li>Interferenz-Steuerelemente sollten bereit sein, durch den Ausschluss Inkubation mit beiden primären Antikörper in einem zweiten Schritt immun-Kennzeichnung.</li>
	<li>Fleck DNA mit 300 nM 4', 6-Diamidion-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) für 5 min im Dunkeln bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Waschen Sie 3 Mal in DPBS für 1 min auf einer Wippe in die Dunkelheit.</li>
	<li>Geben Sie einen Tropfen (~ 50 μl) der antifade Eindeckmedium auf einen Objektträger. Klopfen Sie leicht den Rand das Deckglas auf einem Küchenpapier entfernen überschüssigen Puffer vor der Montage das Deckglas mit den Zellen auf den Kopf gestellt. Das Eindeckmittel sollte eine dünne Schicht zwischen dem Deckglas und der Objektträger bilden. Um Luftblasen zu entfernen, drücken Sie vorsichtig auf das Deckglas mit feinen Pinzette.</li>
	<li>Lassen Sie Proben im Dunkeln bei 4 ° c über Nacht heilen Das Eindeckmittel sollte für die mikroskopische Analyse mit Immersion Linsen verhärten. Proben in 4 ° C im Dunkeln aufbewahren.</li>
</ol>(5) Neutrophilen extrazelluläre Trap Quantifizierung
<ol><li>Blenden Sie die Ortbestimmung erwerben und analysieren die Mikroskop-Bilder zu den experimentellen Bedingungen.</li>
	<li>Mit dem Fluoreszenzmikroskop bei 40 X Vergrößerung, nehmen Sie 10 Bilder nach dem Zufallsprinzip aus verschiedenen Regionen von jedem Deckglas in einem Experiment unter den jeweiligen Kanälen. Stellen Sie sicher, dass die Belichtungszeit, Helligkeit und Kontrast der einzelnen Kanäle innerhalb der Aufnahme von Bildern konsistent gehalten werden.</li>
	<li>Analysieren Sie die Bilder mit verfügbaren Software wie ImageJ (NIH). Identifizieren Sie Netze basierend auf Co Lokalisierung von Blut, citH3 und MPO (Abb. 3A, B). Die Anzahl der Netze und Neutrophilen Granulozyten in 10 ZUFALLSFELDER für jede experimentelle Bedingung zu quantifizieren. Zahlen der Netze freigegeben als Verhältnis ausgedrückt werden kann (Anzahl der Netze: Gesamtzahl der Neutrophilen) für jede experimentelle Bedingung.</li>
	<li>Um die Behandlung Auswirkungen auf die intrazelluläre citH3 Ausdruck zu bewerten, zu zählen, die Zahl der Neutrophilen mit intrazellulären citH3 und Anzahl der Neutrophilen ohne intrazellulären citH3 in 10 ZUFALLSFELDER bei 40 X Vergrößerung unter den jeweiligen Kanälen ( Abbildung 3, rote Pfeile). Intrazelluläre citH3 Ausdruck kann als das Verhältnis der Zahl der Neutrophilen mit intrazellulären citH3 die Zahl der Neutrophilen ohne intrazelluläre citH3 ausgedrückt werden.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+and+immunity:+challenges+and+opportunities.">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beneficial+suicide:+why+neutrophils+die,+to+make+NETs.">Beneficial suicide: why neutrophils die, to make NETs.</a> Nature Reviews Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).</li><li>Kaplan, M. J., Radic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+Double-edged+swords+of+innate+immunity.">Neutrophil extracellular traps: Double-edged swords of innate immunity.</a> The Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).</li><li>Czaikoski, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Extracellular+Traps+Induce+Organ+Damage+during+Experimental+and+Clinical+Sepsis.">Neutrophil Extracellular Traps Induce Organ Damage during Experimental and Clinical Sepsis.</a> PLoS One. 11 (2), e0148142 (2016).</li><li>Dwivedi, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+utility+and+characterization+of+cell-free+DNA+in+patients+with+severe+sepsis.">Prognostic utility and characterization of cell-free DNA in patients with severe sepsis.</a> Critical Care. 16 (4), R151 (2012).</li><li>Mai, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+but+not+Early+Treatment+with+DNase+Reduces+Organ+Damage+and+Improves+Outcome+in+a+Murine+Model+of+Sepsis.">Delayed but not Early Treatment with DNase Reduces Organ Damage and Improves Outcome in a Murine Model of Sepsis.</a> Shock. 44 (2), 166-172 (2015).</li><li>Jeffery, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dogs+cast+NETs+too:+Canine+neutrophil+extracellular+traps+in+health+and+immune-mediated+hemolytic+anemia.">Dogs cast NETs too: Canine neutrophil extracellular traps in health and immune-mediated hemolytic anemia.</a> Veterinary Immunology and Immunopathology. 168 (3-4), 262-268 (2015).</li><li>Letendre, J. A., Goggs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+plasma+cell-free+DNA+concentrations+in+dogs+with+sepsis,+trauma,+and+neoplasia.">Measurement of plasma cell-free DNA concentrations in dogs with sepsis, trauma, and neoplasia.</a> Journal of Veterinary Emergency and Critical Care. 27 (3), 307-314 (2017).</li><li>Jeffery, U., Gray, R. D., LeVine, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Fluorescence+Assay+for+Quantification+of+Canine+Neutrophil+Extracellular+Trap+Release.">A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release.</a> J Vis Exp. (117), (2016).</li><li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+how+to+generate+and+visualize+them.">Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them.</a> Journal of Visualized Experiments. (36), (2010).</li><li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+isolation+protocol.">Neutrophil isolation protocol.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+Blue+Exclusion+Test+of+Cell+Viability.">Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111, (2015).</li><li>Li, R. H. L., Ng, G., Tablin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-induced+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+canine+neutrophils+is+dependent+on+histone+H3+citrullination+by+peptidylarginine+deiminase.">Lipopolysaccharide-induced neutrophil extracellular trap formation in canine neutrophils is dependent on histone H3 citrullination by peptidylarginine deiminase.</a> Veterinary Immunology and Immunopathology. 193, 29-37 (2017).</li><li>Masuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETosis+markers:+Quest+for+specific,+objective,+and+quantitative+markers.">NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers.</a> Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAD4+is+essential+for+antibacterial+innate+immunity+mediated+by+neutrophil+extracellular+traps.">PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).</li><li>Leshner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAD4+mediated+histone+hypercitrullination+induces+heterochromatin+decondensation+and+chromatin+unfolding+to+form+neutrophil+extracellular+trap-like+structures.">PAD4 mediated histone hypercitrullination induces heterochromatin decondensation and chromatin unfolding to form neutrophil extracellular trap-like structures.</a> Frontiers in Immunology. 3, 307 (2012).</li><li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+and+inactivators+of+protein+arginine+deiminase+4:+functional+and+structural+characterization.">Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization.</a> Biochemistry. 45 (39), 11727-11736 (2006).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Wir stellen Ihnen hier ein Protokoll, um die Änderungen in Kernen Konformation und Blut Release in lebenden Hunde Neutrophilen mit einer Zelle permeationsfähigen Färbung und eine Zelle impermeant Farbstoff zu beobachten. Der Hauptvorteil dieser Assay ist, dass es für Echtzeit-Erkennung von Netto Bildung durch hochauflösende Mikroskopie in live Neutrophilen ohne Fixierung der Zelle, daher bietet eine einfache und wertvolles Instrument für die Beobachtung von in-vitro- NET Bildung. Da dieser Test keine Antik...

Neutrophile sind kurzlebige Granulozyten verantwortlich für die anfängliche Verteidigung gegen eindringende Krankheitserreger. Neutrophile, an den Ort der Infektion, rekrutiert beseitigen Mikroorganismen durch Phagozytose, Degranulation und Generierung von reaktiven Sauerstoff-Spezies (ROS)-1. In Anwesenheit von Bakterien oder Endotoxine verziert neutrophile Release Neutrophilenzahl extrazelluläre fallen (Netze), bestehend aus extrazellulären Chromatin mit Histonen und granulare Proteine wie Elastase und Myeloperoxidase (MPO)2. Zwar Netze unverzichtbar antimikrobielle Eigenschaften, Erhöhung der experimentellen und klinischen Beweis schlägt vor, dass übereifrige NET Bildung bei Sepsis zu mehreren Organ Dysfunktion und Tod3,4, führen kann 5 , 6.
Da Netze eine ähnliche pathophysiologische Rolle bei Hunden spielen dürfen, können therapeutische Interventionen, die entweder verhindern oder verringern Netto Bildung als neue Behandlungsstrategien bei septischen Tieren dienen. Aus diesem Grund gibt es eine Notwendigkeit für eine zuverlässige Technik zu bewerten und zu quantifizieren, NETosis und NET-Komponenten bei Hunden. NET-Komponenten einschließlich zellfreie DNA (Blut) und Nukleosomen wurden zuvor im eckzahn Neutrophilen und Plasma von klinischen Hunde7,8,9bewertet. Mit Fluoreszenz-Assays, festgestellt Goggs und Letendre, dass septische Hunde höhere Niveaus von Blut als gesunde Hunde8 haben. Obwohl diese Techniken sehr objektiv und quantitative sind, ist Messung von Blut und Nukleosomen als Marker für NETosis unspezifisch, da sie von nekrotischen Zellen außer NETosing Neutrophilen abgeleitet werden können. Hier beschreiben wir eine Technik, die Fluoreszenz-Mikroskopie untersuchen die Verhalten von live NETosing Neutrophilen nutzt. Wir beschreiben auch ein modifiziertes Protokoll mit Doppel-Immunolabeling, um Netze und deren Komponenten wie MPO und citH3 in eckzahn neutrophile10subjektiv zu quantifizieren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dextran from Leuconostoc spp.</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>31392</td>
			<td>Molecular weight 450,000 &#8211; 650,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>17144002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1285801</td>
			<td>With divalent cations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14190136</td>
			<td>Without divalent cations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli O55:B5</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Orange Fluorescent Nucleic Acid Stain</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S11368</td>
			<td>5 mM in DMSO; stains in cells with permeable membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO Green 16 Fluorescent Nucleic Acid Stain</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S7578</td>
			<td>1 mM in DMSO; stains in cells with intact membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surface-Amps NP-40</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>28324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine coated coverslips</td>
			<td>neuVitro</td>
			<td>H-12-pdl</td>
			<td>12 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-citrullinated histone H3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab5103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unconjugated goat anti-rabbit Fab fragments</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-007-003</td>
			<td>Specificity: IgG (H+L)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti- Myeloperoxidase antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td>A0398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI)</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro canine neutrophil extracellular trap formation: dynamic and quantitative analysis by fluorescence microscopy

Als Reaktion auf eindringende Krankheitserreger loslassen Neutrophilen Neutrophilenzahl extrazelluläre fallen (Netze), die extrazelluläre Netzwerke von DNA mit Histonen und antimikrobielle Proteine verziert sind. Übermäßige Netto Bildung (NETosis) und citH3 Release bei Sepsis ist mit mehreren organdysfunktion und Mortalität bei Mäusen und Menschen, aber ihre Auswirkungen bei Hunden sind unbekannt. Hier beschreiben wir eine Technik, um Hunde Neutrophilen aus Vollblut zur Feststellung und Quantifizierung der NETosis zu isolieren. Leukozyten-reiche Plasma, erzeugt durch Dextran Sedimentation wird durch handelsübliche Dichte Gradienten Trennung Medien getrennt und Granulozyten gesammelt für Zell-Graf und Durchführbarkeit zu testen. Um Echtzeit-NETosis in live Neutrophilen beobachten, werden Zelle permeationsfähigen und Zelle impermeant fluoreszierenden Nukleinsäure Flecken Neutrophilen aktiviert durch Lipopolysaccharid (LPS) oder Phorbol Myristate-12 13-Acetat (PMA) hinzugefügt. Veränderungen in der nuklearen Morphologie und NET Bildung sind im Laufe der Zeit durch Fluoreszenzmikroskopie beobachtet. In-vitro- NETosis zeichnet sich weiter durch co-ns1 zellfreie DNA (Blut), Myeloperoxidase (MPO) und citrullinierte Histon H3 (citH3) mit einem modifizierten Doppel-Immunolabelling-Protokoll. Um Objektiv zu quantifizieren, NET Bildung und citH3 Ausdruck mit Fluoreszenz-Mikroskopie, Netze und citH3-positiven Zellen in einer verblindeten Weise mit verfügbaren Software quantifiziert. Diese Technik ist eine spezifischen Assay, der in-vitro- Kapazität der eckzahn Neutrophilen NETosis unterziehen zu bewerten.

Unter Verwendung dieses Protokolls live Cell Imaging, können Ermittler der nuklearen Morphologie, Plasmamembran Integrität und Anwesenheit von Blut im lebenden Neutrophilen beobachten. Ein Zelle impermeant nuklearen Farbstoff Flecken Kerne Säuren rot in Zellen mit beschädigten Zellmembranen. Eine weitere Zelle permeationsfähigen Farbstoff, Etiketten intrazellulären Nukleinsäuren in lebenden Zellen mit intakten Plasmamembranen. Alle intakt Neutrophils, unabhängig von ihrer Behandlu...

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In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

Wir beschreiben Methoden zum isolieren eckzahn Neutrophils aus Vollblut und NET Bildung in live Neutrophilen mit Fluoreszenz-Mikroskopie zu visualisieren. Protokolle, NET Bildung und citrullinierte Histon H3 zu quantifizieren sind auch beschrieben (citH3) Ausdruck mit Immunfluoreszenz-Mikroskopie.

In-vitro- Eckzahn Neutrophilenzahl extrazelluläre Trap Bildung: Dynamische und Quantitative Analyse von Fluoreszenz-Mikroskopie

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

8.6K Aufrufe.  University of California, Davis. Wir beschreiben Methoden zum isolieren eckzahn Neutrophils aus Vollblut und NET Bildung in live Neutrophilen mit Fluoreszenz-Mikroskopie zu visualisieren. Protokolle, NET Bildung und citrullinierte Histon H3 zu quantifizieren sind auch beschrieben (citH3) Ausdruck mit Immunfluoreszenz-Mikroskopie.

Serie: In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them intracellularly when their antimicrobial granules fuse with the phagosome. We found that neutrophils have an additional way of killing microorganisms: upon activation, they release granule proteins and chromatin that together form extracellular fibers that bind pathogens. These novel structures, or Neutrophil Extracellular Traps (NETs), degrade virulence factors and kill bacteria1, fungi2 and parasites3. The structural backbone of NETs is DNA, and they are quickly degraded in the presence of DNases. Thus, bacteria expressing DNases are more virulent4. Using correlative microscopy combining TEM, SEM, immunofluorescence and live cell imaging techniques, we could show that upon stimulation, the nuclei of neutrophils lose their shape and the eu- and heterochromatin homogenize. Later, the nuclear envelope and the granule membranes disintegrate allowing the mixing of NET components. Finally, the NETs are released as the cell membrane breaks. This cell death program (NETosis) is distinct from apoptosis and necrosis and depends on the generation of Reactive Oxygen Species by NADPH oxidase5. 
Neutrophil extracellular traps are abundant at sites of acute inflammation. NETs appear to be a form of innate immune response that bind microorganisms, prevent them from spreading, and ensure a high local concentration of antimicrobial agents to degrade virulence factors and kill pathogens thus allowing neutrophils to fulfill their antimicrobial function even beyond their life span. There is increasing evidence, however, that NETs are also involved in diseases that range from auto-immune syndromes to infertility6.
We describe methods to isolate Neutrophil Granulocytes from peripheral human blood7 and stimulate them to form NETs. Also we include protocols to visualize the NETs in light and electron microscopy.

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) are an important innate immune mechanism to fight pathogenic bacteria, fungi and parasites. Here we describe methods to isolate neutrophil granulocytes from human blood and to activate them to form NETs. We present preparation techniques to visualize NETs in light and electron microscopy.

Neutrophil Extracellular Traps: So erzeugen und zu visualisieren

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the postcapillary venules of inflamed tissue, leukocytes initially tether and roll on the luminal surface of venular wall. Rolling leukocytes arrest on endothelium and undergo firm adhesion in response to chemokine or other chemoattractants on the venular surface. Many adherent leukocytes relocate from the initial site of adhesion to the junctional extravasation site in endothelium, a process termed intraluminal crawling3. Following crawling, leukocytes move across endothelium (transmigration) and migrate in extravascular tissue toward the source of chemoattractant (chemotaxis)4. Intravital microscopy is a powerful tool for visualizing leukocyte-endothelial cell interactions in vivo and revealing cellular and molecular mechanisms of leukocyte recruitment2,5. In this report, we provide a comprehensive description of using brightfield intravital microscopy to visualize and determine the detailed processes of neutrophil recruitment in mouse cremaster muscle in response to the gradient of a neutrophil chemoattractant. To induce neutrophil recruitment, a small piece of agarose gel (~1-mm3 size) containing neutrophil chemoattractant MIP-2 (CXCL2, a CXC chemokine) or WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met, a synthetic analog of bacterial peptide) is placed on the muscle tissue adjacent to the observed postcapillary venule. With time-lapsed video photography and computer software ImageJ, neutrophil intraluminal crawling on endothelium, neutrophil transendothelial migration and the migration and chemotaxis in tissue are visualized and tracked. This protocol allows reliable and quantitative analysis of many neutrophil recruitment parameters such as intraluminal crawling velocity, transmigration time, detachment time, migration velocity, chemotaxis velocity and chemotaxis index in tissue. We demonstrate that using this protocol, these neutrophil recruitment parameters can be stably determined and the single cell locomotion conveniently tracked in vivo.

We describe a protocol of brightfield intravital microscopy for measuring dynamic neutrophil-endothelial cell interactions during neutrophil recruitment in response to the source of a neutrophil chemoattractant in vivo. Neutrophil intraluminal crawling, transendothelial migration and chemotaxis in mouse cremaster muscle tissue are visualized with time-lapsed video photography and tracked with ImageJ.

Tracking-Neutrophil Intraluminale Crawling, transendotheliale Migration und Chemotaxis in Tissue durch Intravital Video-Mikroskopie

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Quantitative<em&gt; In-vitro-</em&gt; Assay auf Neutrophile Haftung auf Aktiviert primären humanen mikrovaskulären Endothelzellen unter statischen Bedingungen messen

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils developed several antimicrobial mechanisms including phagocytosis, degranulation and formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NETs consist of a DNA scaffold decorated with histones and several granule markers including myeloperoxidase (MPO) and human neutrophil elastase (HNE). NET release is an active process involving characteristic morphological changes of neutrophils leading to expulsion of their DNA into the extracellular space. NETs are essential to fight microbes, but uncontrolled release of NETs has been associated with several disorders. To learn more about the clinical relevance and the mechanism of NET formation, there is a need to have reliable tools capable of NET quantitation. 
Here three methods are presented that can assess NET release from human neutrophils in vitro. The first one is a high throughput assay to measure extracellular DNA release from human neutrophils using a membrane impermeable DNA-binding dye. In addition, two other methods are described capable of quantitating NET formation by measuring levels of NET-specific MPO-DNA and HNE-DNA complexes. These microplate-based methods in combination provide great tools to efficiently study the mechanism and regulation of NET formation of human neutrophils.

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High throughput assays are presented that in combination provide excellent tools to quantitate NET release from human neutrophils.

Hoher Durchsatz Messung von extrazellulärer DNA Freisetzung und Quantitative NET Ausbildung in Human-Neutrophilen<em&gt; In Vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or neutralize the ingested material, or to present it as antigens and initiate adaptive immune responses. The pH of phagosomes is a critical parameter regulating fission or fusion with endomembranes and activation of proteolytic enzymes, events that allow the phagocytic vacuole to mature into a degradative organelle. In addition, translocation of H+ is required for the production of high levels of reactive oxygen species (ROS), which are essential for efficient killing and signaling to other host tissues. Many intracellular pathogens subvert phagocytic killing by limiting phagosomal acidification, highlighting the importance of pH in phagosome biology. Here we describe a ratiometric method for measuring phagosomal pH in neutrophils using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled zymosan as phagocytic targets, and live-cell imaging. The assay is based on the fluorescence properties of FITC, which is quenched by acidic pH when excited at 490 nm but not when excited at 440 nm, allowing quantification of a pH-dependent ratio, rather than absolute fluorescence, of a single dye. A detailed protocol for performing in situ dye calibration and conversion of ratio to real pH values is also provided. Single-dye ratiometric methods are generally considered superior to single wavelength or dual-dye pseudo-ratiometric protocols, as they are less sensitive to perturbations such as bleaching, focus changes, laser variations, and uneven labeling, which distort the measured signal. This method can be easily modified to measure pH in other phagocytic cell types, and zymosan can be replaced by any other amine-containing particle, from inert beads to living microorganisms. Finally, this method can be adapted to make use of other fluorescent probes sensitive to different pH ranges or other phagosomal activities, making it a generalized protocol for the functional imaging of phagosomes.

Phagosomal pH influences phagosome maturation, oxidant production, phagosomal killing as well as antigen presentation. Here we describe a ratiometric method for measuring time-course and endpoint pH changes in individual phagosomes in living phagocytes using fluorescence microscopy.

Mess Phagosomen pH durch ratiometrische Fluoreszenzmikroskopie

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Neutrophilen-Isolierung und Analyse zur Bestimmung ihrer Rolle in der Lymphom-Zellempfindlichkeit therapeutische Mittel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of lipids. The function of lipids (e.g., in host-pathogen interactions or host entry) has been reported to play a crucial role in cellular processes. Here, we show a method to determine lipid composition, with a focus on the cholesterol level of primary blood-derived neutrophils, by HPTLC in comparison to high performance liquid chromatography (HPLC). The aim was to investigate the role of lipid/cholesterol alterations in the formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NET release is known as a host defense mechanism to prevent pathogens from spreading within the host. Therefore, blood-derived human neutrophils were treated with methyl-&#946;-cyclodextrin (M&#946;CD) to induce lipid alterations in the cells. Using HPTLC and HPLC, we have shown that M&#946;CD treatment of the cells leads to lipid alterations associated with a significant reduction in the cholesterol content of the cell. At the same time, M&#946;CD treatment of the neutrophils led to the formation of NETs, as shown by immunofluorescence microscopy. In summary, here we present a detailed method to study lipid alterations in neutrophils and the formation of NETs.

Lipids are known to play an important role in cellular functions. Here, we describe a method to determine the lipid composition of neutrophils, with emphasis on the cholesterol level, by using both HPTLC and HPLC to gain a better understanding of the underlying mechanisms of neutrophil extracellular trap formation.

Methoden Lipidveränderungen in Neutrophilen und die anschließende Bildung von Neutrophilen Extracellular Traps zu studieren

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although a component of the innate immune response, NETs are implicated in a range of disease processes including autoimmunity and thrombosis. This protocol describes a simple method for canine neutrophil isolation and quantification of NETs using a microplate fluorescence assay. Blood is collected using conventional venipuncture techniques. Neutrophils are isolated using dextran sedimentation and a density gradient using conditions optimized for dog blood. After allowing time for attachment to the wells of a 96 well plate, neutrophils are treated with NET-inducing agonists such as phorbol-12-myristate-13-acetate or platelet activating factor. DNA release is measured by the fluorescence of a cell-impermeable nucleic acid dye. This assay is a simple, inexpensive method for quantifying NET release, but NET formation rather than other causes of cell death must be confirmed with alternative methods.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are networks of DNA, histones and neutrophil proteins. Although a component of the innate immune response, NETs are implicated in autoimmunity and thrombosis. This protocol describes a simple method for canine neutrophil isolation and quantification of NETs using a microplate fluorescence assay.

Eine einfache Fluoreszenztest zur Quantifizierung von Canine Neutrophil Extracellular Einklemmschutz

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze membrane fusion within eukaryotic cells. The SNARE protein family consists of about 36 different members. Specific intracellular transport routes are catalyzed by specific sets of 3 or 4 SNARE proteins that thereby contribute to the specificity and fidelity of membrane trafficking. However, studying the precise function of SNARE proteins is technically challenging, because SNAREs are highly abundant and functionally redundant, with most SNAREs having multiple and overlapping functions. In this protocol, a new method for the visualization of SNARE complex formation in live cells is described. This method is based on expressing SNARE proteins C-terminally fused to fluorescent proteins and measuring their interaction by F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) employing fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). By fitting the fluorescence lifetime histograms with a multicomponent decay model, FRET-FLIM allows (semi-)quantitative estimation of the fraction of the SNARE complex formation at different vesicles. This protocol has been successfully applied to visualize SNARE complex formation at the plasma membrane and at endosomal compartments in mammalian cell lines and primary immune cells, and can be readily extended to study SNARE functions at other organelles in animal, plant, and fungal cells.

This protocol describes a new method allowing for the quantitative visualization of complex formation of SNARE proteins, based on F&#246;rster resonance energy transfer, and fluorescence lifetime imaging microscopy.

Visualisierung von intrazellulären SNARE Menschenhandel durch Fluoreszenz Lifetime Imaging Microscopy

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...

A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. NETs have been demonstrated to serve as an important host defense mechanism that traps and kills microorganisms. On the other hand, they have been implicated in diverse systemic autoimmune diseases. NETs are immunogenic and toxic structures that contain a pool of relevant autoantigens including anti-neutrophil cytoplasmic antibodies (ANCA)-associated vasculitis (AAV) and systemic lupus erythematosus (SLE). Different forms of NETs can be induced depending on the stimulus. The amount of NETs can be quantified using different techniques including measuring DNA release in supernatants, measuring DNA-complexed with NET-molecules like myeloperoxidase (MPO) or neutrophil elastase (NE), measuring the presence of citrullinated histones by fluorescence microscopy, or flow cytometric detection of NET-components which all have different features regarding their specificity, sensitivity, objectivity, and quantity. Here is a protocol to quantify ex vivo NET formation in a highly-sensitive, high-throughput manner by using three-dimensional immunofluorescence confocal microscopy. This protocol can be applied to address various research questions about NET formation and degradation in health and disease.

This protocol describes a highly sensitive and high throughput neutrophil extracellular trap (NET) assay for the semi-automated quantification of ex vivo NET formation by immunofluorescence three-dimensional confocal microscopy. This protocol can be used to evaluate NET formation and degradation after different stimuli and can be used to study potential NET-targeted therapies.

Ein High-Throughput-Assay zu beurteilen und zu quantifizieren Neutrophilenzahl extrazelluläre Trap Bildung

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. ...