Krebserkrankungen in der Kopf- und Nackenregion werden immer häufiger. Dennoch gibt es ein begrenztes Verständnis der Tumormikroumgebung und der Mechanismen der Behandlungsresistenz in dieser Region. Diese Technik kann verwendet werden, um die native Mikroumgebung von Kopf-Hals-Tumoren auf zugängliche Weise zu rekapitulieren und produziert klinische Manifestationen ähnlich denen beim Menschen.
Wenn die Tumorzellkultur 70% Konfluenz erreicht hat, waschen Sie die Zellen dreimal mit kalten PBS pro Waschgang und befestigen Sie die Zellen mit genügend 0,25% Trypsin, um die untere Oberfläche des Kulturkolbens zu bedecken. Nach drei bis vier Minuten im Zellkultur-Inkubator die Ablösung unter einem Lichtmikroskop bestätigen und das Trypsin mit 12 MilliliterDM F12 Medium neutralisieren, ergänzt durch fetales Rinderserum. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 50 Milliliter konisches Rohr und mischen Sie die Zellen drei- bis viermal durch Inversion.
Dann sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und setzen Sie das Pellet in Serum und antibiotikafreies DMEM bei einem mal 10 bis sechsten Tumorzelle pro 50 Mikroliter mittlerer Konzentration auf Eis wieder auf. Unmittelbar vor der Injektion mischen Sie die Zellen bei einer Eins-zu-Eins-Tumorzellensuspension zu Keller-Membran-Matrix-Verhältnis auf Eis. Laden Sie eine 0,5-Milliliter-Spritze mit einer 23-Spur-Nadel mit 100 Mikroliter Zellen pro Empfängertier.
Legen Sie die Spritzen auf Eis und bestätigen Sie eine mangelnde Reaktion auf Zehenkneifen in einer anästhesierten Maus. Als nächstes legen Sie die Nadel in den rechten oder linken bukkalen Bereich durch den verfügbaren offenen Raum auf beiden Seiten des Mundes, wobei die Spritze parallel zum bukkalen Bereich gehalten wird, während sie sich in der Mundhöhle befindet, um die Injektion des vollen 100-Mikroliter-Volumens der Zellkeller-Membranmatrixsuspension über einen Zeitraum von fünf Sekunden zu erleichtern. Bewahren Sie die Spritze weitere fünf Sekunden an, um sicherzustellen, dass das gesamte Material injiziert wurde, bevor Sie die Spritze vorsichtig zurückziehen.
Die Tumore werden in etwa einer Woche stark sichtbar. Eine Woche nach der Injektion verwenden Sie Sättel, um die Länge und Breite jedes Tumors zu messen, um das Tumorvolumen ein- bis zweimal pro Woche zu bestimmen. Und messen Sie das Gewicht jedes Tieres, um die Auswirkungen des Tumorwachstums auf die Fütterung zu bewerten.
Verwenden Sie am entsprechenden experimentellen Endpunkt scharfe Scheren und stumpfe Zangen, um einen Hautschnitt durch die Mittellinie im Hals zu machen. Und legen Sie die Schere sanft unter die Haut, die den Tumor bedeckt, um Lufttaschen zu schaffen, indem Sie die Schere über und in die Haut drücken. Sobald die Haut ausreichend vom Tumor getrennt ist, verbrauchen Sie die entwässernden Lymphknoten, um zu vermeiden, dass das Tumorgewebe durch das Vorhandensein von Lymphgewebe verwirrt und durch die Ränder des Tumors geschnitten wird, bis das gesamte Volumen abgetrennt ist.
Um den Tumor für die nachgeschaltete Analyse zu verarbeiten, schneiden Sie den Tumor in ein bis zwei Millimeter große Stücke und legen Sie die Stücke in eine 50 Milliliter konische Röhre mit Kollagenase drei, DNAs eins und Trypsin-Inhibitor. Nach der Inkubation der Tumorstücke bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten, mit Schütteln alle 10 Minuten, fügen Sie 20 Milliliter HBSS in die Röhre und übergeben Sie die Suspension mit den Tumorstücken durch ein 70 Mikrometer Gießen Nylon Sieb. Verwenden Sie einen Fünf-Milliliter-Spritzenkolben, um die Tumorstücke im Sieb zu zermahlen und zusätzlich 10 Milliliter HBSS durch das Sieb hinzuzufügen.
Drehen Sie die Zellen durch Zentrifugation nach unten. Das Pellet in zwei bis drei Milliliter roter Blutzelllysepuffer mit strenger Pipettierung wieder aufhängen und die Lyse mit 20 Millilitern frischem HBSS nach zwei Minuten bei Raumtemperatur neutralisieren. Dann setzen Sie die Zellen in weiteren 20 Milliliter N.B. HBSS für eine weitere Zentrifugation wieder auf und belasten sie die Zellen durch einen 40-Mikrometer-Gießfilter, um den letzten Schmutz aus der Tumorzellsuspension zu entfernen.
LY2-Tumoren wachsen mit einer höheren Rate, im Vergleich zu B4B8-Tumoren. Und Mäuse, die Kieferverschiebung zeigen, entwickeln schnell Gewichtsverlust, aufgrund von Dysphagie. Das mediane Überleben bei LY2-Mäusen ist ebenfalls weniger als halb so hoch wie bei B4B8-Tumor-tragenden Mäusen.
Die Magnetresonanztomographie von tumortragenden Mäusen zeigt gut abgegrenzte Tumoren, die sich in die innere Schicht der bukkalen Schleimhaut ausdehnen, aber nicht in die Zunge oder andere nahe gelegene Organe. Die histologische Untersuchung zeigt, dass alle LY2-Tumor-tragenden Mäuse ein schlecht differenziertes Plattenepithelkarzinom entwickeln, während Mäuse mit B4B8-Tumoren ein mäßig differenziertes Plattenepithelkarzinom entwickeln. Alle LY2-Tumor tragenden Mäuse haben auch histologisch bestätigte Nekrose, wobei die Mehrheit eine mittelschwere bis schwere Nekrose zeigt.
In diesem repräsentativen Experiment wurde ein LY2-Tumor geerntet und drei Wochen nach der Injektion von bukkalen Tumorzellen verarbeitet, wie gezeigt. CD45-positive Immunzellen machten 7,3% der gesamten Tumorzellpopulation aus. CD11b-positive myeloide Zellen stellten 37,8% aller CD45-positiven Zellen dar, von denen die Mehrheit als F480-positive Makrophagen bestimmt wurde, wobei auch kleine Populationen von Neutrophilen und myeloiden suppressorischen Suppressorzellen beobachtet wurden.
T-Zellen machten 15,9 % der CD45-positiven Immunzellpopulation aus, davon 53,4 % CD4-positive FoxP3-positive regulatorische T-Zellen. Natürliche Killerzellen machten weniger als 2% aller CD45-positiven Zellen aus. Es ist wichtig, Injektion zu üben, um Vertrauen und Komfort im Halten der Nadel und der Empfängermaus und bei der Exposition des Mundes des Tieres zu entwickeln.
Sobald das Verfahren erfolgreich durchgeführt wurde, können Experimente durchgeführt werden, die die Beurteilung der Tumorreaktion auf die Therapie oder die Bewertung der Tumor intrinsischen und mikroökologischen Faktoren beinhalten. Diese Technik hat den Weg für die Entwicklung einer vom Forscher initiierten klinischen Studie geebnet, in der die Auswirkungen der Kombination von Strahlentherapie und Anti-PL1-Therapie bei Kopf- und Nackenkrebspatienten bewertet wurden.
