Dieses Protokoll wird zeigen, wie differenzierte induzierte pluripotente Stammzellen auf einem Organ-on-Chip ausgesät werden können, um eine vollständig menschliche, personalisierte, mikrofluidische Blut-Hirn-Schranke zu erzeugen, die verwendet werden kann, um die Durchlässigkeit des Zentralnervensystems vorherzusagen und neurologische Störungen zu untersuchen. Anhand eines handelsüblichen Organ-on-Chip zeigen wir, wie jedes biologisch orientierte Labor diese Technologie nutzen kann, um eine personalisierte, mikrofluidische Blut-Hirn-Barriere auf Chip zu erzeugen. Akkumulierende Beweise deuten darauf hin, dass BBB eine Rolle bei neurologischen Erkrankungen spielt, indem personalisierte BBB-Chips aus iPSCs von Personen mit einer genetischen neurologischen Erkrankung generiert werden.
Es wird möglich sein, die Rolle des BBB bei Gesundheit und Krankheit zu untersuchen. Diese Methode kann auch nützlich für Pharmaunternehmen sein, die diese menschliche BBB-Plattform verwenden können, um die Durchlässigkeit von kandidaten neurologischen Medikamenten in das menschliche Gehirn zu überprüfen. Die Anwendung von Organ-on-Chip-Technologien erfordert in der Regel spezialisierte Ingenieurskompetenzen.
Die Verwendung kommerziell erhältlicher Plattformen ermöglicht die Anwendung dieser Technologie in jedem biologisch orientierten Labor. Um zu beginnen, bringen Sie die Schale mit den vorbereiteten Chips in den Biosicherheitsschrank. Mit einer P200 Pipette, sanft waschen beide Kanäle durch Zugabe von 200 Mikroliter neuronalen Differenzierungsmedium in den Einlass und ziehen Sie die Flüssigkeit aus dem Auslass.
Vermeiden Sie den Kontakt mit den Anschlüssen, saugen Sie sorgfältig überschüssige Medientröpfchen von der Oberfläche des Chips. Rühren Sie die Zellsuspension vorsichtig, um eine homogene Zellsuspension zu gewährleisten. Um die von iPSC abgeleiteten neuronalen Vorläuferzellen in den oberen Kanal zu saatieren, um die Gehirnseite zu erzeugen, fügen Sie eine P200-Spitze hinzu, die 30 bis 100 Mikroliter Zellsuspension in der Konzentration von ein mal 10 zu den sechs Zellen pro Milliliter zum oberen Kanaleinlass enthält, und lassen Sie die Spitze vorsichtig von der Pipette los.
Nehmen Sie eine leere P200-Pipette, drücken Sie den Kolben, legen Sie sie in den oberen Kanalauslass ein und ziehen Sie vorsichtig die einzellige Suspension durch die Spitze. Übertragen Sie den Chip an das Mikroskop, um die Sädichte und homogene Verteilung der Zellen innerhalb des oberen Kanals zu überprüfen. Nach Bestätigung der Zelldichte bei 20% Abdeckung, legen Sie die Chips sofort in den Inkubator für zwei Stunden bei 37 Grad Celsius.
Danach die Zellen, die nicht anhaften, wegwaschen, indem man dem Einlass frisches neuronales Differenzierungsmedium hinzufügt und die Flüssigkeit über pipette aus dem Auslass zieht. Halten Sie die Zellen unter statischen Bedingungen bei 37 Grad Celsius mit einem täglichen neuronalen Differenzierungsmedium Ersatz. Nachdem iNPCs angebracht haben oder an einem darauffolgenden Tag nach der Aussaat, bringen Sie die Schale mit den vorbereiteten Chips in den Biosicherheitsschrank.
Waschen Sie den unteren Kanal vorsichtig mit 200 Mikroliteren Endothelzellmedium. Vermeiden Sie den Kontakt mit den Anschlüssen, saugen Sie sorgfältig Tröpfchen von überschüssigen Endothelzellmedium von der Oberfläche des Chips, stellen Sie sicher, Medium in beiden Kanälen zu verlassen. Rühren Sie die Zellsuspension vorsichtig, um eine homogene Zellsuspension zu gewährleisten.
Mit einer P200-Pipette 30 bis 100 Mikroliter der iPSC-abgeleiteten mikrovaskulären Endothelzellsuspension des Gehirns in der Konzentration von 14 bis 20 mal 10 bis zu den sechs Zellen pro Milliliter aufstellen und die Spitze in den unteren Kanaleinlass legen. Der wichtigste Schritt, um funktionelle Barriereeigenschaften zu erreichen, ist die Aussaat von mikrovaskulären Endothelzellen im Gehirn. Es ist entscheidend, dass Samenzellen mit angemessener Dichte Blasenbildung vermeiden, um die homogene Verteilung innerhalb des Organchips zu überprüfen.
Drücken Sie den Kolben auf einer P200 Pipette mit einer leeren Spitze, setzen Sie ihn in den unteren Kanalauslass ein, und lassen Sie den Pipettenkolben langsam los, um die einzellige Aufhängung vorsichtig durch den unteren Kanal zu ziehen. Saugen Sie die überschüssige Zellsuspension von der Oberfläche des Chips. Vermeiden Sie direkten Kontakt mit den Ein- und Auslassanschlüssen, um sicherzustellen, dass keine Zellsuspension aus den Kanälen abgesaugt wird.
Übertragen Sie den Chip auf das Mikroskop, um die Sädichte zu überprüfen. Der untere Kanal ist mit Zellen gefüllt, die keine beobachtbaren Lücken dazwischen haben. Nach Bestätigung der korrekten Zelldichte säen Sie die Zellen in den verbleibenden Chips.
Um die Zellen an der porösen Membran zu befestigen, die sich oben auf dem unteren Kanal befindet, invertieren Sie jeden Chip und lassen Sie sie in einer Span-Wiege ruhen. Legen Sie ein kleines Reservoir mit sterilem DPBS in die 150-Millimeter-Schale, um Feuchtigkeit für die Zellen bereitzustellen. Inkubieren Sie die Chips bei 37 Grad Celsius für etwa drei Stunden oder bis Zellen im unteren Kanal befestigt sind.
Sobald die iPSC-abgeleiteten mikrovaskulären Endothelzellen des Gehirns angebracht sind, kehren Sie die Chips wieder in eine aufrechte Position zurück, um eine Zellbindung am unteren Teil des unteren Kanals zu ermöglichen. 48 Stunden nach der Aussaat der iPSC-abgeleiteten mikrovaskulären Endothelzellen des Gehirns, gleicht die Temperatur des Endothelzellmediums durch Erwärmung in einem 37-Grad-Celsius-Wasserbad für eine Stunde aus. Entgasen Sie das Medium dann 15 Minuten lang durch Inkubation unter einem vakuumgetriebenen Filtersystem.
Als nächstes reinigen Sie das Äußere der tragbaren Modulverpackungen und Trays mit 70% Ethanol, wischen Sie sie ab und übertragen Sie sie in den Biosicherheitsschrank. Öffnen Sie das Paket, und legen Sie die Module in das Fach Orient sie mit den Reservoirs auf der Rückseite des Fachs. Pipette drei Milliliter der vorausgeglichenen, warmen Medien zu jedem Einlassbehälter.
Fügen Sie dem Einlassreservoir des unteren Kanals und dem neuronalen Differenzierungsmedium das Medium Endothelzellkultur des oberen Kanals hinzu. Dann Pipette 300 Mikroliter der vorausgeglichenen, warmen Medien zu jedem Auslassbehälter, direkt über jedem Auslassanschluss. Legen Sie bis zu sechs tragbare Module auf jedes Tablett.
Tragen Sie Schalen zum Inkubator und schieben Sie sie vollständig in das Kulturmodul mit dem nach außen gerichteten Traygriff. Wählen Sie den Prime-Zyklus im Kulturmodul aus, und führen Sie ihn aus. Schließen Sie die Inkubatortür, und lassen Sie das Kulturmodul die tragbaren Module für etwa eine Minute grundieren.
Der Grundierungszyklus ist abgeschlossen, wenn die Statusleiste bereit liest. Entfernen Sie das Tablett aus dem Kulturmodul, und bringen Sie es in den Biosicherheitsschrank. Prüfen Sie die Unterseite jedes tragbaren Moduls im Biosicherheitsschrank, um sicherzustellen, dass die tragbaren Module erfolgreich grundiert wurden.
Achten Sie auf das Vorhandensein von kleinen Tröpfchen an allen vier Ports. Wenn ein tragbares Modul keine Tröpfchen anzeigt, führen Sie den Prime-Zyklus auf diesen Modulen erneut aus. Wenn Medien auf das Tablett tropften, was häufiger an den Auslassöffnungen vorkommt, reinigen Sie das Fach mit 70 % Ethanol.
Als nächstes waschen Sie vorsichtig beide Kanäle jedes Chips mit einem warmen, gleichförmigen zellspezifischen Kulturmedium, um mögliche Blasen im Kanal zu entfernen, und legen Sie kleine Tröpfchen Von Medien auf die Oberseite jedes Ein- und Auslassanschlusses. Legen Sie die Chips mit Trägern in die tragbaren Module ein und legen Sie bis zu sechs auf jedes Tablett. Legen Sie die Schalen in das Kulturmodul ein.
Programmieren Sie die entsprechenden Organchipkulturbedingungen, wie Strömungsgeschwindigkeit und Dehnung, auf dem Kulturmodul. Sobald der Regelzyklus abgeschlossen ist, der etwa zwei Stunden dauert, beginnen die programmierten Bedingungen. Danach beginnt das Kulturmodul bei den voreingestellten Organchip-Kulturbedingungen zu fließen.
Die Immunzytochemie auf dem iPSC-basierten Blut-Hirn-Barrierenchip sieben Tage nach der Aussaat zeigt die EZ-Sphären, die sich in eine gemischte neuronale Zellpopulation im oberen Hirnseitenkanal differenziert haben, einschließlich S100-Beta-positive Astrozyten, Nestin-positive neuronale Vorläuferzellen sowie GFAP-positive Astrozyten und Beta-III-Tubulin-positive Neuronen. IPSC-abgeleitete mikrovaskuläre Endothelzellen des Gehirns, die im unteren Blutseitenkanal gesät wurden, exprimierten GLUT-1 und PECAM-1. Die Auswertung der Durchlässigkeit des Blut-Hirn-Schrankenchips zeigt, dass der Organchip, der mit iPSC-abgeleiteten mikrovaskulären Endothelzellen und EZ-Kugeln gesät wurde, eine enge Barriere im Vergleich zu Organchips hatte, die allein mit iPSC-abgeleiteten mikrovaskulären Endothelzellen aus gesäten wurden.
Organchips, die mit EZ-Kugeln allein gesät wurden, zeigten keine Barriereeigenschaften. Von der anfänglichen Oberflächenbehandlung des Kanals bis zum Medium, das jeden Tag schaltet, vermeiden Sie Blasenbildung im Kanal. Während des gesamten Protokolls, in dem Oberflächenaktivierungsreagenz, extrazelluläre Matrix oder zellhaltiges Medium durch die Kanäle eingefügt werden müssen, ist es äußerst wichtig, sorgfältig zu überprüfen, ob keine Blase gefunden wird.
Der Permeability-Assay kann durchgeführt werden, um die Durchlässigkeit von Kandidatenmedikamenten im menschlichen Gehirn zu beurteilen. Dieser Ansatz kann dazu dienen, potenzielle Therapeutika zu testen. Die Anwendung des iPSC-basierten BBB-Chips ermöglicht es, die Rolle des BBB bei verschiedenen neurologischen Erkrankungen zu untersuchen.
In Zukunft kann eine solche Plattform für vorausschauende, personalisierte Medizinanwendungen nützlich sein.
