Diese Methode ermöglicht es, die menschliche Blut - Hirn-Schranke zu analysieren, indem bakterielle Traversal auf verschiedene Behandlungen zu messen. Es kann helfen, die Pathogenese der bakteriellen Meningitis und postoperativeDelirium zu entdecken. Es ist eine einfache Methode und die Auswirkungen der Behandlung werden direkt durch die Anzahl der Bakterien dargestellt.
Es kann modifiziert werden, um eine Analyse von Verbindungen mit hohem Durchsatz an den Endothelzellen zu ermöglichen. Beginnen Sie mit der Montage der 12-Well-Platte in einem biologischen Sicherheitsschrank. Entpacken Sie die Platte und jeden Einsatz, dann verwenden Sie sterilisierte Zangen, um die Einsätze an ihrer Basis zu greifen und legen Sie sie in die Brunnen.
Beschichten Sie die poröse Membran jedes Inserts mit 90 Mikrolitern von 10 Mikrogramm pro Mikroliter Kollagen IV und Fibronectin-Mischung und inkubieren Sie die Platte in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden. Waschen Sie die Einsätze nach der Inkubation zweimal, indem Sie einen Milliliter PBS in jeden Einsatz einleiten und mit einer Vakuumpumpe anbringen. Dann die Membranen ausdemieren, indem man vorgewärmte DMEM F12 medium in den oberen und unteren Kammern absenkt und die Platte bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid inkubieren.
Um die menschlichen mikrovaskulären Endothelzellen auszusäen, saugen Sie das Medium aus dem Zellkulturkolben und waschen Sie die Zellen mit 10 Milliliter PBS. Bedecken Sie die Zellen vollständig mit fünf Millilitern Trypsin EDTA und bebrüten den Kolben drei bis fünf Minuten bei 37 Grad Celsius. Übertragen Sie fünf Milliliter der Zellen in eine 15-Milliliter-Röhre und fügen Sie fünf Milliliter FCS mit Medium hinzu, um die enzymatische Reaktion zu stoppen.
Zentrifugieren Sie die Suspension für drei Minuten bei 210 mal g, entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in fünf Millilitern Medium wieder auf. 10 Mikroliter der Zellsuspension zu 10 Mikrolitern mit 0,4% Trypanblaugeben hinzufügen und dann 10 Mikroliter der Mischung in eine Zählkammer geben. Setzen Sie die Zählkammer in den Zellenzähler und starten Sie das entsprechende Programm, um sicherzustellen, dass der Zähler fokussiert ist.
Nach dem Zählen, Samen 200 000 Zellen in jede obere Kammer auf der 12-Well-Platte und bebrüten die Platte bei 37 Grad Celsius für 14 Tage wechseln die Medien in der oberen und unteren Kammer alle zwei bis drei Tage. Stellen Sie nach 14 Tagen sicher, dass die Zellkonfluenz 100 % beträgt, indem Sie sie mit einem Mikroskop abbilden. Einen Tag vor der Permeabilitätsmessung, legte eine Kolonie des E.coli-Stamms GM2163 in drei Milliliter LB-Medium.
Kultur die Zellen bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden in einem Inkubationsshaker. Um Zellen mit einer Verbindung von Interesse zu behandeln, verdünnen Sie es auf seine endgültige Konzentration in DMEM F12 Medium und fügen Sie diese Mischung in die oberen und unteren Kammern in der 12-Well-Platte, dann inkubieren Sie die Platte in einem Zellkultur-Inkubator. Nach der Inkubation das komplette Medium mit einem antibiotikafreien Medium austauschen.
Bestimmen Sie die Konzentration der über Nacht bakteriellen Kultur, indem Sie ihre optische Dichte bei 600 Nanometern messen und dann in einem 50 Milliliter Falcon-Rohr auf einen OD600 von 0,5 verdünnen. In einem biologischen Sicherheitsschrank 450 Mikroliter der bakteriellen Lösung in jede obere Kammer der 12-Well-Platte geben und dann die Platte sechs Stunden lang bei 37 Grad Celsius bebrüten. Nach der Inkubation den Einsatz mit Zangen entfernen und 50 Mikroliter des Mediums aus jeder unteren Kammer abziehen, wobei darauf zu achten ist, dass das Medium nicht aus den oberen Kammern in die unteren versenkt wird.
Es ist wichtig, die Medien der oberen und unteren Kammer strikt zu trennen, da ein Übergreifen von Bakterien der oberen Kammer zu falsch positiven Ergebnissen führen würde. Lassen Sie jede Probe auf eine separate Agarplatte fallen und streift die Lösung mit einem Zellstreuer. Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden, dann zählen Sie die Kolonien.
Um die Wirkung der Glykation auf die mikrobielle Durchquerung der Blut-Hirn-Schranke zu untersuchen, wurden die Zellen eine Stunde lang mit einer 0,5- und einer 0,15-Millimolaren-Glyoxallösung behandelt, wobei unbehandelte Zellen als Kontrolle dienten. Die Glykation wurde dann durch Immunoblotting mit Anti-AGE-Antikörpern nachgewiesen. Die erhaltenen Bakterienkolonien wurden gezählt und als die absolute Anzahl der Kolonien oder die relative Anzahl der Kolonien, die zur Kontrolle normalisiert wurden, dargestellt.
Proben, die mit Glyoxal behandelt wurden, zeigten eine erhöhte Anzahl von Kolonien, was darauf hindeutet, dass die Behandlung einen Einfluss auf die Zellbarrieredichte hat. Zur Untersuchung der Glukose-induzierten Proteinglykation wurden THBMECs in normalem Glukose- und hohem Glukosemedium kultiviert. Die absolute Anzahl der Kolonien und die relative Anzahl der Kolonien normalisiert auf die Kontrolle zeigte, dass Glukose keine signifikante Nesseinfluss auf die Integrität der Blut - Hirn-Schranke hatte.
Behandelte Endothelzellen können durch Proteomik-Ansätze, z.B. Massenspektrometrie, weiter analysiert werden, um Veränderungen im Proteom zu analysieren. Diese Technik hilft beim Verständnis der menschlichen Blut - Hirn-Schranke und bakterielle Traversal. Es kann verwendet werden, um Aspekte des Alterns und neurodegenerative Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit zu entdecken.
