Die hier vorgestellten Methoden ermöglichen es uns, die molekularen Mechanismen der Immunzellmigration über die Hirnbarrieren bei experimenteller Autoimmunenzephalomyelitis, einem Tiermodell für Multiple Sklerose, zu untersuchen. Durch die Untersuchung der Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke und der Matrix-Metalloprotease-Aktivität gleichzeitig in räumlicher Korrelation mit der Infiltration von Immunzellen in Hirngewebeabschnitten können wir diese neuroinflammatorischen Ereignisse genau mit den klinischen Anzeichen von EAE assoziieren. Der professionelle Umgang mit erkrankten Mäusen erfordert eine gründliche Schulung sowie die korrekte Bewertung der klinischen Symptome von EAE.
Daher ist die visuelle Demonstration von Vorteil. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Anästhesisierung von C57-Black/6-Mäusen, die unter spezifisch-pathogenfreien Bedingungen untergebracht wurden, wie im Textprotokoll beschrieben. Fixieren Sie die anästhesierte Maus in einer Hand, und injizieren Sie 30 Mikroliter MOG-Peptid und vervollständigen Sie Freunds adjuvante Emulsion subkutan in jede der Hinterbeinflanken, in unmittelbarer Nähe zu den Leistenlymphknoten.
Legen Sie nun die Maus auf ihren Bauch und injizieren Sie 20 Mikroliter der MOG-Peptid-Emulsion in das weiche Fettgewebe auf der linken und rechten Seite an der Schwanzwurzel. Auch ein kleines Tröpfchen der Emulsion in den Hals der Maus injizieren. Injizieren Sie 100 Mikroliter Pertussistoxin-Lösung intraperitoneal in die Maus.
Halten Sie den Kopf der Maus unter dem Körperzentrum, um injektionn in den Darm zu vermeiden. Ersetzen Sie die Erhaltungsdiät auf die Zuchtdiät, um den Mäusen vor und während der erwarteten klinischen Erkrankung Nahrung mit höherem Energiegehalt zu liefern. Wiederholen Sie die Pertussistoxin-Injektion 48 Stunden nach der ersten Behandlung.
Überprüfen Sie jeden Morgen den Gesundheitszustand von EAE-Mäusen, indem Sie einen Blick in die Käfige werfen. Score EAE Mäuse jeden Nachmittag. Nehmen Sie jede einzelne Maus, die im EAE-Experiment enthalten ist, aus dem Käfig und überprüfen Sie, ob der Schwanz Tonus hat.
Bewegen Sie den Schwanz mit einem Finger nach oben. Eine gesunde Maus hält ihren Schwanz hoch. Wenn die klinische EAE begonnen hat, wird der Schwanztonus niedriger sein, sichtbar durch einen allmählichen Tropfen des Schwanzes.
Irgendwann wird die Maus ihren Schwanz überhaupt nicht mehr heben können. Platzieren Sie jede einzelne Maus, die im EAE-Experiment enthalten ist, auf die saubere Bank, um das Gehverhalten zu beobachten und zu dokumentieren. Siehe Text für Bewertungskriterien für die Bewertung des Schweregrads der Erkrankung, d. h. den EAE-Wert.
Bewerten und dokumentieren Sie das Gewicht jeder Maus, die im Experiment enthalten ist. Zur Herstellung von Dextran-Stammlösungen 10 Milligramm Drei-Kilodalton Dextran Texas Red in 500 Mikrolitern 0,9% Natriumchloridlösung und fünf Milligramm 10-Kilodalton-Dextran Alexa Fluor 488 in 250 Mikrolitern 0,9%Natriumchloridlösung auflösen. Für die Dextran-Arbeitslösung, kurz vor der Injektion, Pipette 55 Mikroliter 10-Kilodalton Dextran Alexa Fluor 488 Stofflösung auf ein Stück Dichtfolie.
Fügen Sie dann 55 Mikroliter Drei-Kilodalton Dextran Texas Red Aktie Lösung. Mischen und sammeln Sie 100 Mikroliter in einer Einweg-Feinspritze. Als nächstes legen Sie eine anästhesierte Maus in der seitlichen Position auf dem Tisch.
Intravenös 100 Mikroliter fluoreszierende Tracer in die Maus injizieren, bevor die Maus aufwacht. Lassen Sie den Tracer 15 Minuten zirkulieren, bevor Sie eine Perfusion von Mäusen durchführen, wie im Textprotokoll beschrieben. Füllen Sie einen flachen Dewar-Behälter mit zerkleinertem Trockeneis und fügen Sie 2-Methylbutan hinzu, bis die Flüssigkeit etwa einen Zentimeter über der Trockeneispackung erreicht.
Abdeckung mit einem lockeren Deckel, wie z. B. einer Eiskübelabdeckung. Nachdem Sie den Kopf der perffundierten Maus mit einer scharfen Schere abgeschnitten haben, entfernen Sie die Haut und die Ohren mit einer kleineren Schere. Sezieren Sie vorsichtig die Schädelkappe, indem Sie von der Foramen magnum nach vorne links und rechts schneiden, um eine Aufklappung der Schädelkappe über dem Gehirn zu ermöglichen.
Heben Sie dann vorsichtig das intakte Gehirn von der Schädelbasis heraus, während Sie die optischen Nerven mit einem flachen Metallspachtel abtrennen. Legen Sie das Gehirn auf Aluminiumfolie. Schneiden Sie das Gehirn in drei Stücke, indem Sie zwei koronale Schnitte platzieren.
Die drei Teile repräsentieren das frontale Gehirn, das mittlere Gehirn und das Kleinhirn mit Hirnstamm. Füllen Sie einen Cryomold bis zum ersten Quartal mit optimaler Schnittmatrix. Legen Sie dann die Gehirnscheiben in den Cryomold, wobei die vordere Seite jedes Gehirnstücks nach unten zeigt.
Bedecken Sie das Gewebe vollständig mit Matrix. Legen Sie den Cryomold mit dem Gewebe in horizontaler Ausrichtung in das 2-Methylbutan-Bad. Stellen Sie sicher, dass das Gewebe innerhalb einer Minute von unten nach oben gefriert, indem Sie vermeiden, den gesamten Gewebeblock in das Bad zu tauchen.
Übertragen Sie das gefrorene Gewebe zur Lagerung auf minus 80 Grad Celsius. Siehe Textprotokoll zur Vorbereitung der gefrorenen Gewebeabschnitte. Holen Sie sich sechs Mikrometer, nicht fixierte Hirngewebeabschnitte, die von EAE-Mäusen hergestellt worden waren.
In einer Dunstabzugshaube die Abschnitte in der Kunststoff-Gefrierbox, die Kieselgel im Deckel enthält, auftauen, um Wassereinlagerungen im Gewebe zu vermeiden. Trennen Sie zwei Gewebeabschnitte auf einer Folie, indem Sie Linien mit einem wasserabweisenden Stift zeichnen. Zentrifugenreaktionslösungen für fünf Minuten bei 13, 300 mal g bei Raumtemperatur und vorwärmend auf 37 Grad Celsius mit einem Wasserbad.
Dann rehydrieren Sie die Gewebeabschnitte für fünf Minuten bei 37 Grad Celsius mit 1X Reaktionspuffer. Gießen Sie nach fünf Minuten den 1X-Reaktionspuffer ab. Fügen Sie Reaktionslösung auf den Gewebeabschnitten hinzu und brüten Sie vier Stunden bei 37 Grad Celsius.
Dann waschen Sie die Rutschen fünfmal in doppelt destilliertem Wasser. Fixieren Sie die Abschnitte nun für fünf Minuten mit eiskaltem Methanol bei minus 20 Grad Celsius, bevor Sie sie einmal mit PBS bei Raumtemperatur waschen. Fügen Sie 1%BSA in PBS zu dem Abschnitt hinzu, und inkubieren Sie 20 Minuten bei Raumtemperatur.
Entsorgen Sie dann den Puffer aus dem Abschnitt, indem Sie die Folie auf einem Gewebe umdrehen. Fügen Sie den primären Antikörpercocktail in den Abschnitt ein und brüten Sie eine Stunde bei Raumtemperatur. Nachdem Sie die Abschnitte zweimal mit PBS gewaschen haben, fügen Sie einen sekundären Antikörpercocktail hinzu und brüten Sie eine Stunde bei Raumtemperatur.
Waschen Sie dann die Abschnitte zweimal mit PBS, und montieren Sie die Dias mit Einbettlösung. Nachdem Sie die montierten Abschnitte über Nacht bei Raumtemperatur trocknen lassen, analysieren Sie gefärbte Gewebeabschnitte mit einem Fluoreszenzmikroskop. Die Schwere der EAE-Krankheit nimmt bis zum Höhepunkt der Krankheit zu, was zwischen den Tagen 16 und 20 nach der EAE-Induktion zu erwarten ist.
Auf dem Höhepunkt der klinischen EAE zeigten Mäuse auch das niedrigste Körpergewicht, was die Korrelation zur Verbesserung von EAE in der Remissionsphase der Krankheit erhöht. Hier ist ein repräsentatives Bild des Aderhautplexus und des angrenzenden Hirnparenchyms einer C57-Black/6-Maus mit EAE-Leiden zu sehen. Die Maus wurde 15 Minuten vor dem Aufopferung intravenös injiziert.
Tracer diffundieren leicht über die fenestrated Mikrogefäße in das Stoma des Aderhautplexus, während die Blut-Hirn-Schranke nicht die Diffusion von zirkulierenden Tracern in das Gehirn parenchyma erlaubt, die somit frei von fluoreszierendem Signal ist. Diese Bilder zeigen repräsentative undichte Blutgefäße im Kleinhirn einer C57-Black/6-Maus, die an EAE leidet. Pfeilspitzen zeigen Tracer, die über die Mikrogefäße des Gehirns in das ZNS-Parenchym diffundiert werden, was darauf hindeutet, dass die Funktion der Blut- und Hirnschranke in diesen Gefäßen beeinträchtigt ist.
Im ZNS Parenchym ist ein grünes und rotes Fluoreszenzsignal außerhalb der Blutgefäßwände sichtbar. Die korrekte subkutane Platzierung der MOG-CFA-Emulsion ist wichtig, um die richtige Immunantwort zu montieren, die zu EAE führt. Intraperitoneale und intramuskuläre Injektion sollte vermieden werden.
Bereiten Sie CFA unter einer Dunstabzugshaube vor, um das Einatmen des abgeschwächten Mycobacteriums zu vermeiden. Vermeiden Sie auch die Selbstinjektion mit der MOG-CFA-Emulsion, da dies Condyloma verursachen oder sogar zu EAE bei Personen führen kann, die genetisch veranlagt sind. Hirninfiltrierende Immunzellen können aus der ZNS von Mäusen isoliert werden, die an EAE leiden, um infiltrierende Immunzell-Submengen während der Neuroinflammation durch Durchflusszytometrie zu quantifizieren.
Die Beurteilung der Integrität der Endothel- und Glial-Hirnbarrieren kann in die Analyse genetisch veränderter Mausmodelle oder in Modelle anderer neurologischer Störungen übersetzt werden.
