Les méthodes présentées ici nous permettent d’étudier les mécanismes moléculaires de la migration des cellules immunitaires à travers les barrières cérébrales dans l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale, un modèle animal pour la sclérose en plaques. En étudiant la perméabilité de barrière de sang-cerveau et l’activité matrix-metalloprotease en même temps dans la corrélation spatiale à l’infiltration de cellules immunisées dans les sections de tissu de cerveau, nous pouvons précisément associer ces événements neuroinflammatory aux signes cliniques d’EAE. La manipulation professionnelle des souris malades nécessite une formation approfondie, ainsi que la notation correcte des signes cliniques de l’EAE.
Ainsi, la démonstration visuelle est bénéfique. Commencez cette procédure par l’anesthésie des souris C57-Black/6 qui ont été logées dans des conditions spécifiques exemptes d’agents pathogènes, telles que décrites dans le protocole textuel. Fixez la souris anesthésiée dans une main, injectez 30 microlitres de peptide MOG et complétez l’émulsion adjuvante de Freund sous-cutanée dans chacun des flancs de la jambe postérieure, à proximité des ganglions lymphatiques inguinaux.
Maintenant, placez la souris sur son ventre, et injectez 20 microlitres de l’émulsion MOG-peptide dans le tissu adipeux mou à gauche et à droite à la racine de la queue. Aussi, injecter une petite gouttelette de l’émulsion dans le cou de la souris. Injecter 100 microlitres de solution de toxine de coqueluche intraperitoneally dans la souris.
Tenez la tête de la souris sous le centre du corps pour éviter l’injection dans l’intestin. Remplacer le régime alimentaire d’entretien par le régime alimentaire reproducteur afin de fournir aux souris des aliments d’une teneur énergétique plus élevée avant et pendant la maladie clinique prévue. Répétez l’injection de toxine de coqueluche 48 heures après le premier traitement.
Vérifiez l’état de santé des souris EAE tous les matins en jetez un oeil à l’intérieur des cages. Marquez des souris EAE tous les après-midi. Sortez chaque souris incluse dans l’expérience EAE de la cage et vérifiez si la queue doit tonus.
Déplacez la queue vers le haut avec un doigt. Une souris en bonne santé gardera sa queue vers le haut. Si l’EAE clinique a commencé, le tonus de queue sera inférieur, visible par une baisse graduelle de la queue.
Finalement, la souris ne sera pas en mesure de soulever sa queue du tout. Placez chaque souris individuelle incluse dans l’expérience EAE sur le banc propre pour observer et documenter le comportement de marche. Voir le texte pour les critères de notation pour l’évaluation de la gravité de la maladie, qui est le score EAE.
Évaluer et documenter le poids de chaque souris incluse dans l’expérience. Pour préparer des solutions de stock dextran, dissoudre 10 milligrammes de de trois kilodaltons Dextran Texas Red en 500 microlitres de solution chlorure de sodium à 0,9% et cinq milligrammes de 10 kilodaltons Dextran Alexa Fluor 488 en 250 microlitres de solution chlorure de sodium à 0,9%. Pour la solution de travail dextran, juste avant l’injection, pipette 55 microlitres de 10 kilodalton Dextran Alexa Fluor 488 solution de stock sur un morceau de film d’étanchéité.
Ensuite, ajoutez 55 microlitres de solution de stock de trois kilodaltons Dextran Texas Red. Mélanger et recueillir 100 microlitres dans une seringue fine jetable. Ensuite, placez une souris anesthésiée en position latérale sur la table.
Injectez par voie intraveineuse 100 microlitres de traceurs fluorescents dans la souris avant que la souris ne se réveille. Laissez le traceur circuler pendant 15 minutes avant d’effectuer la perfusion des souris comme détaillé dans le protocole de texte. Remplir un récipient plat de dewar de glace sèche concassée et ajouter 2 méthylbutane jusqu’à ce que le liquide atteigne environ un centimètre au-dessus de la banquise sèche.
Couvrir d’un couvercle lâche, comme un couvercle de seau à glace. Après avoir coupé la tête de la souris perfusée avec des ciseaux pointus, retirez la peau et les oreilles à l’aide d’un plus petit ensemble de ciseaux. Disséquer soigneusement la calotte crâneuse en coupant du magnum foramen vers l’avant à gauche et sur le côté droit, pour permettre le ressac de la calotte sur le cerveau.
Puis, soulevez soigneusement le cerveau intact de la base du crâne tout en coupant les nerfs optiques à l’aide d’une spatule en métal plat. Placez le cerveau sur du papier d’aluminium. Couper le cerveau en trois morceaux en plaçant deux coupes coronale.
Les trois pièces représentent le cerveau frontal, le cerveau moyen et le cervelet avec le tronc cérébral. Remplissez un Cryomold jusqu’au premier trimestre avec une matrice de coupe à température optimale. Ensuite, placez les tranches de cerveau dans le Cryomold, avec le côté antérieur de chaque morceau de cerveau faisant face vers le bas.
Couvrez complètement le tissu de matrice. Placez le Cryomold avec le tissu dans une orientation horizontale dans le bain à 2 méthylbutanes. Assurez-vous que le tissu gèle du bas vers le haut dans la minute en évitant de plonger l’ensemble du bloc tissulaire dans le bain.
Transférer les tissus congelés à moins 80 degrés Celsius pour les entreposer. Voir le protocole texte pour la préparation des sections des tissus congelés. Récupérer six microns, sections de tissu cérébral non fixe qui avaient été préparés à partir de souris EAE.
Dans un capot de fumée, décongeler les sections à l’intérieur de la boîte de congélation en plastique contenant du gel de silice dans le couvercle pour éviter la rétention d’eau dans le tissu. Séparez deux sections de tissu sur une diapositive en dessinant des lignes avec un stylo répulsant l’eau. Solutions de réaction centrifugeuse pendant cinq minutes à 13, 300 fois g à température ambiante, et préchauffer à 37 degrés Celsius à l’aide d’un bain d’eau.
Ensuite, réhydrater les sections tissulaires pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius à l’aide d’un tampon de réaction 1X. Après cinq minutes, versez le tampon de réaction 1X. Ajoutez une solution de réaction sur les sections tissulaires et incubez pendant quatre heures à 37 degrés Celsius.
Ensuite, lavez les glissières cinq fois dans de l’eau doublement distillée. Maintenant, fixez les sections pendant cinq minutes avec du méthanol glacé à moins 20 degrés Celsius avant de les laver une fois avec du PBS à température ambiante. Ajouter 1%BSA en PBS à la section, et incuber pendant 20 minutes à température ambiante.
Ensuite, jetez le tampon de la section en renversant la lame sur un tissu. Ajouter le cocktail d’anticorps primaires à la section et incuber pendant une heure à température ambiante. Après avoir lavé les sections deux fois avec du PBS, ajouter le cocktail secondaire d’anticorps et incuber pendant une heure à température ambiante.
Ensuite, lavez les sections deux fois avec PBS, et montez les diapositives avec la solution d’intégration. Après avoir laissé sécher les sections montées toute la nuit à température ambiante, analyser les sections de tissus tachés à l’aide d’un microscope fluorescent. La gravité de la maladie d’EAE augmente jusqu’au pic de la maladie, qui peut être prévu entre les jours 16 et 20 après l’induction d’EAE.
Au sommet de l’EAE clinique, les souris ont également montré le poids corporel le plus bas, qui augmente en corrélation avec l’amélioration de l’EAE dans la phase de rémission de la maladie. On y voit une image représentative du plexus choroïde et du parenchyme cérébral adjacent d’une souris C57-Black/6 souffrant d’EAE. La souris a été injectée par voie intraveineuse 15 minutes avant de sacrifier.
Les traceurs se diffusent facilement à travers les microvétères fenestrated dans la stomie du plexus choroïde, tandis que la barrière hémato-encéphalique ne permet pas la diffusion de traceurs circulants dans le parenchyme cérébral, qui est donc dépourvu de tout signal fluorescent. Ces images montrent des vaisseaux sanguins représentatifs qui fuient dans le cervelet d’une souris C57-Black/6 souffrant d’EAE. Les pointes de flèche indiquent des traceurs diffusés à travers les microvessels de cerveau dans le parenchyme de CNS, suggérant que la fonction de barrière hémato-encéphalique soit altérée dans ces vaisseaux.
Dans le parenchyme du SNC, le signal fluorescent vert et rouge est visible à l’extérieur des parois des vaisseaux sanguins. Le placement sous-cutané correct de l’émulsion MOG-CFA est essentiel pour monter la réponse immunitaire appropriée menant à l’EAE. L’injection intraperitoneal et intramusculaire devrait être évitée.
Préparer le CFA sous un capot de fumée pour éviter l’inhalation de la Mycobacterium atténuée. En outre, évitez l’auto-injection avec l’émulsion MOG-CFA, car cela peut causer le condylome ou même conduire à l’EAE chez les personnes qui sont génétiquement prédisposées. Les cellules immunitaires infiltrant le cerveau peuvent être isolées du SNC de souris souffrant d’EAE pour quantifier l’infiltration de sous-ensembles de cellules immunitaires pendant la neuroinflammation par cytométrie d’écoulement.
L’évaluation de l’intégrité de l’endothélial et des barrières glialement cérébrales peut se traduire par l’analyse de modèles muraux génétiquement modifiés ou par des modèles d’autres troubles neurologiques.
