Burada sunulan yöntemler bize deneysel otoimmün ensefalomiyelit, multipl skleroz için bir hayvan modeli beyin bariyerleri arasında bağışıklık hücresi göç moleküler mekanizmaları çalışma sağlar. Kan-beyin bariyeri geçirgenliği ve matris-metalloprotaz aktivitesini aynı anda beyin dokusu bölümlerindeki immün hücre infiltrasyonu ile aynı anda araştırarak, bu nöroinflamatuar olayları EAE'nin klinik bulgularıyla tam olarak ilişkilendirebiliriz. Hastalıklı farelerin profesyonel kullanımı derinlemesine eğitim etüt ve EAE klinik bulgularıdoğru puanlama gerekir.
Böylece, görsel gösteri yararlıdır. Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı gibi spesifik patojeniçermeyen koşullarda barındırılan C57-Black/6 farelerinin anestezisi ile başlayın. Bir elinde anestezili fareyi düzeltin ve 30 mikrolitre MOG peptid enjekte edin ve Freund'un adjuvan emülsiyonunu arka bacak kanatlarının her birine alttan, inguinal lenf düğümlerine yakın bir şekilde tamamlayın.
Şimdi fareyi karnına yerleştirin ve 20 mikrolitre MOG-peptid emülsiyonunu kuyruk kökündeki hem sol hem de sağdaki yumuşak yağ dokusuna enjekte edin. Ayrıca, farenin boynuna emülsiyon küçük bir damlacık enjekte. Fareye intraperitoneally 100 mikrolitre perçin toksin çözeltisi enjekte edin.
Bağırsak içine enjeksiyon önlemek için vücut merkezinin altında farenin başını tutun. Beklenen klinik hastalık öncesinde ve sırasında farelere daha yüksek enerji içeriğine sahip gıdalar sağlamak için bakım diyetini üreme diyetine değiştirin. İlk tedaviden 48 saat sonra pertussis toksin enjeksiyonu tekrarlayın.
Kafeslerin içine bir göz atarak her sabah EAE farelerin sağlık durumunu kontrol edin. Her öğleden sonra EAE farelerini puanla. EAE deneyine dahil olan her fareyi kafesten alın ve kuyruğun tonusolup olmadığını kontrol edin.
Kuyruğu bir parmakla yukarı doğru hareket ettirin. Sağlıklı bir fare kuyruğunu yukarı tutar. Klinik EAE başlamışsa, kuyruk tonusu daha düşük olacak, kuyruk kademeli bir damla ile görülebilir.
Sonunda, fare kuyruğunu hiç kaldıramaz. Yürüme davranışını gözlemlemek ve belgelemek için EAE deneyinde yer alan her fareyi temiz bir banka yerleştirin. EAE puanı olan hastalık şiddetinin değerlendirilmesi için puanlama kriterleri için metne bakın.
Deneyde yer alan her farenin ağırlığını değerlendirin ve belgelendirin. Dekstran stok çözeltileri hazırlamak için, 10 miligram üç kilodalton Dextran Texas Red'i %0,9 sodyum klorür çözeltisi 500 mikrolitrede ve beş miligram 10 kilodalton Dextran Alexa Fluor 488'i 250 mikrolitrede %0,9 sodyum klorür çözeltisinde çözün. Dextran çalışma çözümü için, enjeksiyondan hemen önce, pipet 55 mikrolitre 10 kilodalton Dextran Alexa Fluor 488 stok çözeltisi bir sızdırmazlık filmi üzerine.
Sonra, üç kilodalton Dextran Texas Red stok çözeltisi 55 mikrolitre ekleyin. Karıştırın ve tek kullanımlık ince şırınga içine 100 mikrolitre toplamak. Daha sonra, masanın yan pozisyonuna anestezili bir fare yerleştirin.
Fare uyanmadan önce 100 mikrolitre floresan izleme ciyisini fareye intravenöz olarak enjekte edin. Metin protokolünde ayrıntılı olarak belirtildiği gibi farelerin perfüzyon gerçekleştirmeden önce izleyici 15 dakika boyunca dolaşalım. Ezilmiş kuru buz ile düz bir savaş kabı doldurun ve sıvı kuru buz paketi üzerinde yaklaşık bir santimetre ulaşana kadar 2-metilbütan ekleyin.
Buz kovası kapağı gibi gevşek bir kapakla kaplayın. Keskin makas ile perfüzyon farenin başını kırpma sonra, makas daha küçük bir set kullanarak deri ve kulakları çıkarın. Foramen magnum'dan sol ve sağ taraftaki ön kısma doğru keserek kafatası kapağını dikkatlice inceleyin ve kafatası kapağının beyin üzerinde yukarı kaymasını bekleyin.
Daha sonra, dikkatle düz bir metal spatula kullanarak optik sinirleri keserken kafatası tabanından bozulmamış beyin kaldırın. Beyni alüminyum folyoya yerleştirin. İki koronal kesik koyarak beyni üç parçaya ayırın.
Üç parça frontal beyin temsil, orta beyin, ve beyin sapı ile beyincik. Bir Cryomold'ı ilk çeyreğe kadar optimum sıcaklık kesme matrisi ile doldurun. Sonra, Cryomold içine beyin dilimleri yerleştirin, her beyin parçasının ön tarafı aşağı bakacak şekilde.
Dokuyu tamamen matrisle kapatın. 2-metilbütan banyo içine yatay bir yönde doku ile Cryomold yerleştirin. Banyoiçine tüm doku bloğu daldırma kaçınarak bir dakika içinde doku alttan üst donuyor emin olun.
Dondurulmuş dokuyu depoiçin eksi 80 dereceye aktarın. Dondurulmuş doku bölümlerinin hazırlanması için metin protokolüne bakın. EAE farelerden hazırlanan altı mikronlu, sabit olmayan beyin dokusu kesitlerini alın.
Bir duman kaputunda, dokuda su tutmasını önlemek için kapağında silika jel içeren plastik donma kutusunun içindeki bölümleri eritin. Bir slaytüzerinde su itici kalemile çizgiler çizerek iki doku kesiti ayırın. Oda sıcaklığında 13, oda sıcaklığında 300 kez ve su banyosu kullanarak 37 dereceye kadar önceden ısınarak beş dakika santrifüj reaksiyon çözeltisi.
Daha sonra, 1X reaksiyon tampon kullanarak 37 santigrat derece beş dakika doku bölümleri rehydrate. Beş dakika sonra, 1X reaksiyon arabelleği dökün. Doku bölümlerine reaksiyon çözeltisi ekleyin ve 37 santigrat derecede dört saat kuluçkaya yatırın.
Daha sonra, iki kez distile suda slaytlar beş kez yıkayın. Şimdi, oda sıcaklığında PBS ile bir kez yıkamadan önce eksi 20 santigrat derece buz gibi metanol ile beş dakika için bölümleri düzeltmek. Bölüme PBS'de %1 BSA ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatın.
Ardından, slaytı bir dokunun üzerine çevirerek arabelleği bölümden atın. Bölüme birincil antikor kokteyli ekleyin ve oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatın. Bölümleri PBS ile iki kez yıkadıktan sonra ikincil antikor kokteyli ekleyin ve oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatın.
Daha sonra bölümleri PBS ile iki kez yıkayın ve slaytları gömme çözeltisi ile monte edin. Monte edilen bölümlerin oda sıcaklığında bir gecede kurumasına izin vererek, lekeli doku bölümlerini floresan mikroskop kullanarak analiz edin. EAE hastalığının şiddeti hastalığın doruk noktasına kadar artar, Bu gün arasında beklenebilir 16 ve 20 EAE indüksiyon sonra.
Klinik EAE zirvesinde, fareler de hastalığın remisyon aşamasında EAE iyileştirilmesi ile korelasyon artar en düşük vücut ağırlığı gösterdi. Burada gösterilen koroid pleksus ve Bir C57-Siyah / 6 fare EAE muzdarip bitişik beyin parankim temsili bir resim. Fare, kurban etmeden 15 dakika önce damardan enjekte edilmiş.
İzciler kolayca koroid pleksus stoma içine fenestrated mikrodamarlar arasında yayılır, kan-beyin bariyeri beyin parankim içine dolaşan izleyicilerin difüzyon izin vermez iken, bu nedenle herhangi bir floresan sinyal yoksundur. Bu görüntüler, EAE muzdarip bir C57-Black/6 fare beyincilik temsili sızdıran kan damarları göstermektedir. Ok uçları, beyin mikrodamarları boyunca CNS parankimiçine yayılmış izcileri gösteriyor, bu da bu damarlarda kan-beyin bariyeri fonksiyonunun bozulduğunu gösteriyor.
CNS parankim, yeşil ve kırmızı floresan sinyal kan damarı duvarları dışında görülebilir. EAE'ye giden uygun bağışıklık yanıtını n için MOG-CFA emülsiyonunun doğru deri altı yerleşimi gereklidir. İntraperitoneal ve kas içi enjeksiyondan kaçınılmalıdır.
Zayıflatılmış Mycobacterium teneffüs önlemek için bir duman başlık altında CFA hazırlayın. Ayrıca, MOG-CFA emülsiyon ile kişinin kendi kendine enjeksiyon kaçının, Bu kondilom neden olabilir gibi hatta genetik yatkınlıklı bireylerde EAE yol açabilir. Beyin-infiltrasyon bağışıklık hücreleri akış sitometri ile nöroinflamasyon sırasında infiltrasyon bağışıklık hücresi alt kümeleri ölçmek için EAE muzdarip farelerin CNS izole edilebilir.
Endotel ve glial beyin bariyerlerinin bütünlüğünün değerlendirilmesi, genetiği değiştirilmiş fare modellerinin analizine veya diğer nörolojik hastalıkların modellerine çevrilebilir.
