Dieses Protokoll präsentierte eine einfache und zuverlässige Methode zur Messung der alkalisierten Phosphatase-Aktivität in der S.aureus-Biofilmkultur. Es wird uns helfen, die Funktion von ALP in der Biofilmbildung zu verstehen. Der große Vorteil dieser Technik ist ein hoher Durchsatz.
Es ist sehr empfindlich und einfach durchzuführen. Das Verfahren wird Kevin Danikowski demonstrieren, ein ehemaliger Student vom Harper College. Zur Zubereitung von TSB die Bauchspeicheldrüsenverdauung von Casein, die papaische Verdauung von Sojamehl, Natriumchlorid, Dextrose und Dikaliumphosphat in destilliertes Wasser geben.
Bedecken Sie den Kolben mit Aluminiumfolie und legen Sie ihn in einen Autoklaven, um ihn vor Gebrauch zu sterilisieren. Um eine TSA vorzubereiten, fügen Sie Agar zu TSB hinzu und legen Sie ihn zur Sterilisation in den Autoklaven. Dann auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
Als nächstes gießen Sie es in die Petrischale im Verhältnis 20 Milliliter pro Schale. Um ein Biofilmkulturmedium vorzubereiten, fügen Sie Glukose zu autoklavierten TSB hinzu, um die Konzentration von 10 Gramm pro Liter zu erreichen. Filtrat der Lösung mit einem Vakuumfiltrationskit mit einem 0,2 Mikrometer porengroßen Filter.
Um zu impfen, verwenden Sie eine sterilisierte Impfschleife, um eine einzelne Kolonie von Staph aureus aus der Petrischale zu pflücken und sie in die Kulturröhre mit 10 MilliliterT TSB gefüllt zu platzieren. Legen Sie die Röhre in den Inkubator, um über Nacht bei 37 Grad Celsius zu wachsen. Mit einer Mikropipette 100 Mikroliter Übernachtungskultur zeichnen und in ein Kulturrohr übertragen, das mit 10 Millilitern TSB mit Glukose gefüllt ist, um eine Verdünnung des Volumenverhältnisses von 1:100 zu erhalten.
Wirbel sanft für eine konsistente Konzentration zu mischen. Verwenden Sie eine Mikropipette, um 200 Mikroliter verdünnter Kultur in insgesamt 18 Brunnen von einer 96-Well-Platte zu übertragen. Die 96-Wellplatte bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden für die Biofilmbildung inkubieren.
Für die beste Biofilm-Formation von S.aureus ist es besser, eine flache oder runde untere 96-Wellplatte zu pflücken. Danach kippen Sie die Platte leicht, um den Überstand durch Aspiration von der Kante jedes Brunnens zu dekanten. Waschen Sie jeden Gut mit 1X PBS.
Legen Sie die Platte in die Zentrifuge, um für fünf Minuten bei 8.000 Umdrehungen pro Minute zu drehen und dekantieren Sie den Überstand durch Aspiration. Fügen Sie 75 Mikroliter gepuffertes ALP-Substrat, bestehend aus handelsüblichem PNPP, zu jedem Bohrwert hinzu und verwenden Sie einen Timer, um jeden Zeitpunkt in Dreifacharbeit aufzuzeichnen. Nach jedem Inkubationszeitpunkt 75 Mikroliter von fünf Mol-Natriumhydroxid in jede der drei Brunnen geben, um die Reaktion zu stoppen.
Zentrifugieren Sie die Platte für fünf Minuten bei 800 Umdrehungen pro Minute. Verwenden Sie eine Pipette, um 100 Mikroliter Überstand in eine neue 96-Well-Platte für die kalorimetrische Messung zu übertragen. Verwenden Sie einen 96-Well-Plattenleser, um die Absorption jedes Brunnens bei 405 Nanometern zu messen.
Verwenden Sie die 30-Minuten-Zeitpunktbrunnen, um Hintergrundgeräusche zu steuern. Wiederholen Sie das gesamte Experiment in drei 96 Brunnenplatten. Dieses Protokoll entwickelt einen schnellen und zuverlässigen Test zur Messung der ALP-Aktivität im S.aureus-Biofilm, der keine Proteinisolation erfordert.
Das repräsentative Ergebnis der ALP-Aktivität zeigt einen anstiegen Trend von bis zu 75 Minuten. Nach 75 Minuten wurde keine Zunahme der ALP-Aktivität beobachtet. Es ist sehr wichtig, eine gute Biofilmkultur zu etablieren, und es kann einige Versuche dauern, um zu meistern.
Sie können die Biofilmbildung bestätigen, indem Sie kristallvioletten Assay durchführen, wie zuvor von uns und anderen berichtet, oder Sie können die Platte mit menschlichem Plasma vorbehandeln, um die Bildung von Biofilmen zu erleichtern. Nach seiner Entwicklung können Sie potenzielle ALP-Hemmer überprüfen, die die Biofilmbildung stören könnten. Das Ergebnis wird wichtige Informationen zum Biofilmmanagement im medizinischen Bereich liefern.
Fünf molare Natriumhydroxid können bei Kontakt gefährlich sein. Achten Sie darauf, persönliche Schutzausrüstung bei der Handhabung zu tragen.
