Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium NSF RUI MCB-0950372 mit dem Titel Molekulare Charakterisierung von Black Widow Spinnenseidenproteinen unterstützt.

1. Betäubende die Spinne und die Isolierung des Bauches <ol><li> Übertragen Sie die Spinne aus einem Glas in einem Karton mit Kunststoff (Abbildung 1A) ausgekleidet. Wir sammeln in der Regel Spinnen aus Holzstapel, Garagen oder Büsche und Haus sie im Labor in Gläsern. Da die Spinne nicht klettern kann die Kunststoff-Futter, bietet es eine effiziente Methode, um die Spinne aus einem Glas oder Kaffee können Transfer in ein kleineres Gefäß für Anästhesie Zwecke. Beim Umgang mit der Spinne an diesem Punkt, sollten Sie das Tragen von zwei Paar Latex-Handschuhe oder Gartenhandschuhe aus Gründen der Sicherheit. </li><li> Während die Spinne ist in der Box mit Kunststoff ausgekleidet, nähern sich die Spinne von der Rückseite und lassen Sie die Spinne Abgleiten in die Kunststoff-Flasche Kultur. Nach der Spinne in die Flasche, sofort den Stecker over the top (Abbildung 1B). Wir empfehlen die Verwendung eines Fläschchens, dass etwa 101,6 mm x 31,75 mm (L x D) ist. Dies minimiert die Menge an Kohlendioxid für die Betäubung Schritt nötig. </li><li> Anesthetize die Spinne durch die Einführung von Kohlendioxid-Gas bei 5-10 Pfund pro Quadratzoll für 10 min (Abbildung 1C). Diese Gasmenge wird nur klopfen die Spinne für rund 5 min, so dass nach Betäubung müssen Sie sofort Schritte 1,4-1,5 gehen. </li><li> Setzen Sie den narkotisierten Spinne in einen kleinen Dissektion Schüssel und Verwendung einer Pinzette, um die Spinne Rückenseite nach oben (rote Sanduhr nach unten) positionieren. </li><li> Clip der Stiel (schmale Stiel Anschluss des Cephalothorax und das Abdomen), um den Bauch aus dem Rest der Spinne (Abbildung 1D) freizugeben. Bewahren Sie den Cephalothorax in der Tiefkühltruhe über Nacht in einer Petrischale und entsorgen nach gefrorenen am nächsten Tag. Seien Sie vorsichtig beim Bewegen der Cephalothorax wie die Zähne der Spinne präsentieren in diesem Segment sind. </li><li> Befestigen Sie den Bauch, um die Sylgard Material in den kleinen Dissektion Schüssel mit einem einzigen Insekten pin. Legen Sie das Insekt Stift durch das Loch aus dem Blütenstiel Clipping (Abb. 1E) gemacht. Dies kann leicht als der Ort, wo die Flüssigkeit aus dem Clipping des Stiels Schwellenländern identifiziert werden. Sicherstellen, dass die Düse (entgegengesetzten Ende des Stiels) ist nach unten orientiert (am nächsten zu Ihnen). </li></ol> 2. Die Entfernung des Exoskelett <ol><li> Sprechen Sie die erste Schnitt durch das Exoskelett mit einem Paar Mikroschere, beginnend mit dem Loch aus dem Blütenstiel Clipping. Cut seitlich bis zur Dorsalseite auf beiden Seiten (Abb. 1F) erreicht wird. Mit einer Pinzette, Ziehen Sie die vordere Exoskelett Segment und fügen Sie einen zweiten Stift an dieser Stelle. Nach dem Einlegen der zweiten Stift, drehen Sie das Sezieren Tablett kaudal (90 °-Winkel) von der ersten seitlichen Schnitten und weiter schneiden, bis die Düsen erreicht werden (Abbildung 1G). Dieser Schnitt wird senkrecht oder vertikal sein, um die ersten seitlichen Schnitt. Nicht durch die Düsen, wenn der vertikale Schnitt gemacht wird (posterior gegenüber dem Sanduhr und es hat einen kreisförmigen Aussehen) geschnitten. Nichtbeachtung der zweiten Stifteinsatz wird in den Bauch drehen, wenn die vertikale Schnitte durchgeführt werden, führen. </li><li> Tauchen Sie den Bauch in Sezieren Puffer-Lösung (0,1 M Natriumchlorid, 0,015 M Natriumcitrat, 0,1% Diethylpyrocarbonat). </li><li> Peel die restlichen Exoskelett wieder ab dem ersten, seitlichen Einschnitt. Wenn dies abgeschlossen ist, sollte das Fettgewebe deutlich sichtbar (Abbildung 1H). </li></ol> 3. Die Isolierung der Seiden-produzierenden Drüsen <ol><li> Mit einer Pinzette beginnen Hänseleien entfernt die Fettschicht (Abbildung 1H). Das Fett hat eine weißliche bis gelbliche Erscheinung. Fahren Sie bis das meiste Fett wird entfernt und die Spinndrüsen sind deutlich sichtbar. Die tubuliform Drüse besteht aus drei Paaren von sehr langen, zylindrischen Röhren, die reichlich in der Bauchhöhle sind. Die großen Ampullendrüse, die paarweise gefunden wird, ist eine große, halbmondförmige Ampulle mit einem langen gewundenen distalen Schwanz und einem proximalen Kanal, der in der Breite abnimmt, wie es der Spinne Spinndüsen Ansätze. Die kleine Ampullendrüse ist sehr ähnlich in Morphologie der großen Ampullendrüse, aber es ist deutlich kleiner. Die flagelliform Drüse, auch auftreten in Paaren, ist rund und multilobular mit einem kleinen zylindrischen Zick-Zack-Kanal, der nach unten erstreckt auf die Spinndüsen. Das Aggregat Drüse (gefunden in Paaren) ist ein sehr großes, multilobular Drüse, die eine sehr große Ausführungsgang, die große, unregelmäßige Lappen hat auf sie hat. Die aciniform Drüsen kommen in großer Zahl und ähneln kurze, kleine fingerlike Projektionen. Die birnenförmig Drüse ist die kleinste Drüse in der Bauchhöhle und hat viele verdichtet, zylindrischen Kanäle, die ein Fan mit vielen kleinen Ausführungsgänge, die bis hinab zu den Spinndüsen ähneln. </li><li> Wir empfehlen, die Drüsen in der folgenden Reihenfolge: tubuliform, großen Ampullendrüse, flagelliform, kleinere Ampullendrüse, aggregieren aciniform, und dann die birnenförmig (Abbildung 2A-B). </li><li> Beginnend mit dem tubuliform, necken diese Drüsen aus der übrigen the Drüsen - sie sollten auf der anderen Drüsen (Abbildung 2A) zu sitzen. Es gibt drei Paare von tubuliform Drüsen in einer einzigen Spinne. Lassen Sie sie zu schweben frei, sondern bleiben an ihren Spinnwarzen durch ihre Leitungen. </li><li> Next, necken sich die großen Ampullendrüse Drüsen. Es gibt zwei große Ampullendrüse Drüsen in einer Spinne. Während das Verfahren zur Entfernung sicher, dass die Leitungen verbunden bleiben die Drüsen (Abbildung 2A). </li><li> Fahren Sie mit dem Rest der Drüsen von einander entfernt zu necken, arbeiten sorgfältig, so dass jeder Punktion der Drüsen, vor allem das Aggregat und flagelliform Drüsen. Jede Drüse sollte frei schwimmenden alle den Weg zu seinem Ausgangspunkt in das Exoskelett der Spinndüsen. Diese Drüsen sind auch paarweise gefunden. Entfernen Sie jede Drüse durch Einklemmen des Kanals mit einer Pinzette und vorsichtiges Ziehen, bis er von der Ausfahrt entfernt Pointbreaks. Die großen Ampullendrüse, flagelliform, kleinere Ampullendrüse und aggregieren Drüsen sind in Paaren gefunden. Die aciniform und birnenförmig Drüsen kommen in vielen mehr Paare. </li><li> Entfernen Sie jede Drüse durch Einklemmen des Kanals mit einer Pinzette und vorsichtiges Ziehen, bis er bricht, die Ausfahrt nach unten durch die Düse. Wir in der Regel speichern die Drüsen nass, aber wir wissen nicht zusätzliche Puffer. </li><li> Da die Drüsen entfernt werden, legen Sie sie in sterile pre-markierten 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Individuelle Drüsen sind in Abbildung 3A-G gezeigt. Bewahren Sie diese Drüsen auf Eis und dann Flash-frieren sie in flüssigem Stickstoff. Nach Schockgefrieren in flüssigem Stickstoff, legen Sie sie bei -80 ° C für die Lagerung. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Beim Entfernen der verschiedenen Drüsen, sollten extreme Vorsicht walten beim Umgang mit dem flagelliform und aggregieren Drüsen werden, da diese beiden Strukturen leicht durchstoßen werden können und beschädigt mit der Zange. Darüber hinaus ist es erwähnenswert, dass morphologisch die flagelliform und aggregieren Drüsen sehr ähnlich vor ihrer Entfernung betrachten und sie sind oft miteinander verwoben. Um zu verhindern Kreuzkontamination dieser Gewebe bei der Entnahme sollte das Dissektor sorgfältig tease diese Strukturen auseinander. Außerdem auf der ersten Exposition der Seiden-produzierenden Drüsen, die aciniform und birnenförmig Drüsen der schwierigsten sofort visualisieren aufgrund ihrer geringeren Größe und anatomische Lage sein. Oft gibt es die Anwesenheit von vielen Eiern. Darüber hinaus muss zusätzlich darauf geachtet werden, beim Entfernen des birnenförmig Drüse werden, da dieses Gewebe ist extrem klebrig und wird oft zu Ihrem Zange halten. Wenn dieses Verfahren richtig gemacht wird, ist es möglich, alle sieben Seide produzierenden Drüsen von einer einzigen Spinne in hochreiner Form zu erhalten. In der Regel kann man wieder Mikrogramm-Mengen von Gesamt-RNA und Protein aus einer einzigen Spinne Dissektion. Ein Beispiel für die Verwendung der Gesamt-RNA für die qPCR zum mRNA-Spiegel einer tubuliform beschränkt Fibroin Gen, TuSp1 zu untersuchen, wird angezeigt (Abbildung 4). Vertreter Experimente, die an Protein aus den Drüsen Lysaten gesammelt beinhalten z. B. in-Lösung tryptischen Verdauung durch MS-Analyse (könnte auch für MS / MS-Analyse verwendet werden) oder eine Aminosäure-Zusammensetzung Analyse wird angezeigt (Abbildung 5-6, jeweils) gefolgt. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig1a.jpg" alt="Abbildung 1a" /><img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig1e.jpg" alt="Abbildung 1e" /> Abbildung 1. Handling, betäuben, und die Entfernung des Exoskelett aus dem Bauch einer weiblichen Spinne der schwarzen Witwe. A) Transfer von der Spinne in einem Karton mit Kunststoff ausgekleidet, um zu erleichtern bewegt die Spinne in einen kleineren Kunststoff-Fläschchen. B) Spider platziert in eine Kunststoff-Flasche mit Stecker. C) betäuben die Spinne mit Kohlendioxid-Gas. D) Die Trennung der Cephalothorax aus dem Bauch mit Mikroschere. E) Immobilisierung des Bauches in der Anatomie Tablett mit Insekten Pins. F) anzeigen nach einem seitlichen Einschnitt mit der Schere und ein Teil des Exoskelett ist zurück mit einer Pinzette geschält wird. G) Einschnitte senkrecht zur ersten seitlichen Schnitt. H) Die Entfernung der Exoskelett und Exposition der Fettschicht. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Visualisierung der sieben verschiedenen Seiden-produzierenden Drüsen, während intakte in den Bauch der Spinne sowie das umgebende Gewebe. A) Bilder von der tubuliform, großen Ampullendrüse, flagelliform, aggregieren kleinere Ampullendrüse Gewebe mit 12facher Vergrößerung. B) Bild des aciniform und birnenförmig Drüsen mit 12facher Vergrößerung. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig3a.jpg" alt="Abbildung 3a" /><img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig3e.jpg" alt="Abbildung 3e" /> Abbildung 3. Photographs der sieben Seide produzierenden Drüsen nach ihrer Entnahme aus dem Bauch. Alle Bilder wurden bei 20-facher Vergrößerung mit Ausnahme der aciniform und birnenförmig Drüsen, die bei 40x getan wurden gefangen genommen. A) großenAmpullendrüse; B) Dur-und Moll Ampullendrüse (rechts) zum Größenvergleich; C) tubuliform; D) flagelliform; E)-Aggregat; F) aciniform; G) birnenförmig. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Repräsentative Ergebnisse des Expressionsmusters der Seide Gen, TuSp1 nach Vermessung der TuSp1 mRNA-Spiegel in den verschiedenen Seiden-produzierenden Drüsen (mit Ausnahme der birnenförmig Drüse) mittels quantitativer real-time PCR (qPCR) nach der Isolierung von Gesamt-RNA aus die Drüsen. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5. Beispiel von MS-Analyse von Protein-Extrakten aus der birnenförmig Drüse folgenden in-Lösung tryptischen Verdau erhalten. Hinweis: x2 für 2-fache Vergrößerung des Spektrums Intensität. Spectrum Peptid-Ionen-Massen, die Regionen der PySp1 Fibroin entsprechen, sind mit dem Symbol # angezeigt. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig6.jpg" alt="Abbildung 6" /> Abbildung 6. Typisches Ergebnis der Aminosäure-Zusammensetzung Profil der Proteine ​​aus dem tubuliform Drüse extrahiert. Hinweis: ASX = Asp und Asn; GLX = Glu und Gln. Blaufärbung zeigt Aminosäuren mit polaren Seitenkette Gruppen während rote Färbung stellt Aminosäurereste mit unpolaren Seitenkette Gruppen.

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	<li>Vollrath, F., Knight, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Int. J. Biol. Macromol. 24, 243-243 (1999).</li><li>Gosline, J. M., Guerette, P. A., Ortlepp, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J. Exp. Biol. 202, 3295-3295 (1999).</li><li>Gosline, J. M., DeMont, M. E., Denny, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Endeavour. 10, 31-31 (1986).</li><li>Hinman, M. B., Jones, J. A., Lewis, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Trends Biotechnol. 18 (9), 374-374 (2000).</li><li>Lewis, R. V., Xu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 7120-7120 (1990).</li><li>Colgin, M. A., Lewis, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein Sci. 7 (3), 667-667 (1998).</li><li>Tian, M., Lewis, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Appl. Phys. A-Mater. 82, 265-265 (2006).</li><li>Hu, X., Lawrence, B., Kohler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biochemistry. 44 (30), 10020-10020 (2005).</li><li>Vasanthavada, K., Hu, X., Falick, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J Biol Chem. 282 (48), 35088-35088 (2007).</li><li>Hayashi, C. Y., Blackledge, T. A., Lewis, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mol. Biol. Evol.. 21 (10), 1950-1950 (2004).</li><li>Blasingame, E., Tuton-Blasingame, T., Larkin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J Biol Chem. 284 (42), 29097-29097 (2009).</li></ol>

Unsere Methodik für die Mikrodissektion der Seiden-produzierenden Drüsen aus der schwarzen Witwe bietet ein wirksames Mittel zu hoch gereinigten Seide produzierenden Drüsen zu erhalten. Dissektionen können in 1,5 bis 3 Stunden abgeschlossen sein, was zu einem kompletten Satz der sieben verschiedenen Seiden-produzierenden Drüsen aus cobweavers. Beziehen hochgereinigtes Seide-Drüse Proben ermöglicht Forschern die Möglichkeit, ein breites Spektrum an biochemischen Untersuchungen, einschließlich der Identifizierung...

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		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
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		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Sodium chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EM Science</td>
<td>SX0420-1</td>
<td>0.1 M in water</td>
</tr>
<tr>
<td>Diethyl pyrocarbonate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D-5758 - 5 ml</td>
<td>0.1% v/v</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium citrate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S1804 - 1 kg</td>
<td>0.015 M in water</td>
</tr>
<tr>
<td>Dissecting microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica Microsystems</td>
<td>Leica MZ16</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Digital microscope camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica Microsystems</td>
<td>DFC320</td>
<td>Software - Leica Application Suite v2.8.1</td>
</tr>
<tr>
<td>Vannas scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>500260</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stainless steel forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>501764</td>
<td>Mini Dumont #M5S</td>
</tr>
<tr>
<td>Insect pins</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Indigo Instruments</td>
<td>33414-2</td>
<td>Insect pins #2</td>
</tr>
<tr>
<td>Small or large dissection dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Living Systems Instrumentation</td>
<td>DD-50-S or DD-90-S</td>
<td>52 mm diameter x 18 mm H (Sylgard Depth ~6mm) or 93 mm x 22 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Drosophila culture vials</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Carolina Biological Supply Company</td>
<td>FR-17-3076</td>
<td>Size is 31.75 mm diameter x 101.6 mm</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

microdissection of black widow spider silk-producing glands

Moderne Spinnen High-Performance-Seidenfasern mit einer breiten Palette von biologischen Funktionen, einschließlich Fortbewegung, Beutefang und zum Schutz der Entwicklung der Nachkommen 1,2. Spiders diese Aufgaben durch Spinnen mehrere verschiedene Fasertypen, dass diverse mechanische Eigenschaften aufweisen. Eine solche Spezialisierung der Fasertypen hat durch die Entwicklung der verschiedenen Seiden-produzierenden Drüsen, die als kleine Biofabrik Funktion aufgetreten ist. Diese Biofabrik Herstellung und Lagerung von großen Mengen von Seidenproteinen für Faserproduktion. Durch eine komplexe Reihe von biochemischen Vorgängen, sind diese Seidenproteine ​​von einer Flüssigkeit in einem festen Material nach der Extrusion umgewandelt. Mechanische Untersuchungen haben gezeigt, dass Spinnenseide stärker als hochfestem Stahl 3 sind. Analysen, um die Beziehung zwischen der Struktur und Funktion der Spinnenseide Themen verstehen haben ergeben, dass Spinnenseide zum größten Teil aus Proteinen oder Fibroine, dass Block wiederholt haben im Rahmen ihrer Proteinsequenzen 4 besteht. Gemeinsame molekulare Signaturen, die die unglaubliche Zugfestigkeit und Dehnbarkeit von Spinnenseide beitragen werden durch die Analysen der übersetzten Seide cDNAs entwirrt. Angesichts der außergewöhnlichen Materialeigenschaften von Spinnenseide sind Forschungslabors auf der ganzen Welt Rennen zu verstehen und zu imitieren das Spinnverfahren für synthetische Seidenfasern für kommerzielle, militärische und industrielle Anwendungen. Eine der größten Herausforderungen für die Spinnerei künstliche Spinnenseide im Forschungslabor beinhaltet ein vollständiges Verständnis der biochemischen Prozesse, die während der Extrusion der Fasern von der Seiden-produzierenden Drüsen auftreten. Hier präsentieren wir eine Methode zur Isolierung von den sieben verschiedenen Seiden-produzierenden Drüsen aus der cobweaving Schwarze Witwe, die die großen und kleinen Ampullendrüse Drüsen enthält [fertigt dragline und Gerüste Seide] 5,6, tubuliform [synthetisiert Eihülle Seide] 7 , 8, flagelliform [unbekannter Funktion in cob-Weber], aggregieren [macht Leim Seide], aciniform [synthetisiert Beute Verpackung und Eihülle Themen] 9 und birnenförmig [produziert Befestigung Disc Seide] 10. Dieser Ansatz basiert auf betäuben die Spinne mit Kohlendioxid-Gas, anschließende Trennung der Cephalothorax aus dem Bauch, und Mikrodissektion des Bauches, die Seiden-produzierenden Drüsen zu erhalten basiert. Nach der Trennung der verschiedenen Seiden-produzierenden Drüsen, können diese Gewebe verwendet, um verschiedene Makromoleküle für verschiedene biochemische Analysen, einschließlich der quantitativen real-time PCR, Northern-und Western-Blot analysiert Massenspektrometrie (MS oder MS / MS) zu identifizieren abgerufen werden New Silk Protein-Sequenzen, Suche nach Proteinen, die in die Seide Montage Weg zu beteiligen, oder verwenden Sie das intakte Gewebe für die Zellkultur oder histologische Untersuchungen.

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Microdissection of Black Widow Spider Silk-producing Glands

Hier beschreiben wir eine effiziente Strategie, um die Seide produzierenden Drüsen aus dem Bauch der weiblichen Schwarzen Witwen zu entfernen. Dieses Verfahren ermöglicht die schnelle Trennung der sieben verschiedenen Seiden-produzierenden Drüsen in hochreiner Mode, ein wichtiger Prozess für die Ermittler Studium Spinnenseide Produktion und Faserverbund.

Mikrodissektion von Black Widow Spider Silk-produzierenden Drüsen

Modern spiders spin high-performance silk fibers with a broad range of biological functions, including locomotion, prey capture and protection of ...

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Research

JoVE Journal

Biology

15.7K Aufrufe.  University of the Pacific. Hier beschreiben wir eine effiziente Strategie, um die Seide produzierenden Drüsen aus dem Bauch der weiblichen Schwarzen Witwen zu entfernen. Dieses Verfahren ermöglicht die schnelle Trennung der sieben verschiedenen Seiden-produzierenden Drüsen in hochreiner Mode, ein wichtiger Prozess für die Ermittler Studium Spinnenseide Produktion und Faserverbund.

Serie: Microdissection of Black Widow Spider Silk-producing Glands

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol demonstrates dissection techniques for removal of the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes. 



The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for vector pathogens like Plasmodium falciparum and the dengue virus. This video demonstrates the dissection techniques for removing the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes.

Dissection der Dünndarm-und Speicheldrüsen von Ae. aegypti Moskitos

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

Forschung

Biologie

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. LMD techniques rely on a thermo labile membrane placed either on top of, or underneath, the tissue section. In one method, focused laser energy is used to melt the membrane onto the underlying cells, which can then be lifted out of the tissue section. In the other, the laser energy vaporizes the foil along a path "drawn" on the tissue, allowing the selected cells to fall into a collection device. Each technique allows the selection of cells with a minimum resolution of several microns. DNA, RNA, protein, and lipid samples may be isolated and analyzed from micro-dissected samples. In this video, we demonstrate the use of the Leica AS-LMD laser microdissection instrument in seven segments, including an introduction to the principles of LMD, initializing the instrument for use, general considerations for sample preparation, mounting the specimen and setting up capture tubes, aligning the microscope, adjusting the capture controls, and capturing tissue specimens. Laser-capture micro-dissection enables the investigator to isolate samples of pure cell populations as small as a few cell-equivalents. This allows the analysis of cells of interest that are free of neighboring contaminants, which may confound experimental results.

Laser Capture Mikrodissektion von Säugetiergewebe

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

Microdissection of Zebrafish Embryonic Eye Tissues

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post fertilization (dpf), the larvae will show the first visual response. Many genes have been identified to control a proper eye development, but we are far from a complete understanding of the underlying genetic architecture. Whole genome gene expression profiling is a useful tool to elucidate genetic regulatory network for eye development. However, the small size of the embryonic eye in zebrafish makes it challenging to obtain intact and pure eye tissues for expression analysis. For example, the anterior-posterior length of the eye between day 2 and 3 is only approximately 200-300 &mu;m, while the diameter of the lens is less 100 &mu;m. Also, the retinal pigment epithelium (RPE) underlying the retina is just a single-layer epithelium. While gene expression profiles can be obtained from the whole embryo, they do not accurately represent the expression of these tissues. Therefore pure tissue must be obtained for a successful gene expression profiling of eye development. To address this issue, we have developed an approach to microdissect intact retina and retina with RPE attached from 1-3 dpf, which cover major stages of eye morphogenesis. All procedures can be done with fine forceps and general laboratory supplies under standard stereomicroscopes. For retinal dissection, the single-layer RPE is removed and peeled off by brushing action and the preferential adherence of the RPE remnants to the surface of the culture plate for dissection. For RPE-attached retinal dissection, the adherence of RPE to the dissection plate is removed before the dissection so that the RPE can be completely preserved with the retina. A careful lifting action of this tissue can efficiently separate the presumptive choroid and sclera. The lens can be removed in both cases by a chemically etched tungsten needle. In short, our approach can obtain intact eye tissues and has been successfully utilized to study tissue-specific expression profiles of zebrafish retina1, 2 and retinal pigment epithelium3.

This article describes an approach to microdissect zebrafish retinas with and without retinal pigment epithelium attached, from one to three days postfertilization embryos.

Mikrodissektion von Zebrafisch Embryonale Augentücher

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post ...

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Many plants possess specialized structures that are involved in the production and secretion of specific low molecular weight compounds and proteins. These structures are almost always localized on plant surfaces. Among them are nectaries or glandular trichomes. The secreted compounds are often employed in interactions with the biotic environment, for example as attractants for pollinators or deterrents against herbivores.
Glands that are unique in several aspects can be found in carnivorous plants. In so-called pitcher plants of the genus Nepenthes, bifunctional glands inside the pitfall-trap on the one hand secrete the digestive fluid, including all enzymes necessary for prey digestion, and on the other hand take-up the released nutrients. Thus, these glands represent an ideal, specialized tissue predestinated to study the underlying molecular, biochemical, and physiological mechanisms of protein secretion and nutrient uptake in plants. Moreover, generally the biosynthesis of secondary compounds produced by many plants equipped with glandular structures could be investigated directly in glands.
In order to work on such specialized structures, they need to be isolated efficiently, fast, metabolically active, and without contamination with other tissues. Therefore, a mechanical micropreparation technique was developed and applied for studies on Nepenthes digestion fluid. Here, a protocol is presented that was used to successfully prepare single bifunctional glands from Nepenthes traps, based on a mechanized microsampling platform. The glands could be isolated and directly used further for gene expression analysis by PCR techniques after preparation of RNA.

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Plants glands are specialized structures responsible for the biosynthesis and secretion of many compounds involved in interactions with the biotic environment. To enable studies on their molecular and biochemical features, a mechanical micropreparation technique was established in order to isolate single metabolically active glands, here from the carnivorous plant Nepenthes.

Many plants possess specialized structures that are involved in the production and secretion of specific low molecular weight compounds and proteins. ...

Reconstruction of 3-Dimensional Histology Volume and its Application to Study Mouse Mammary Glands

Histology volume reconstruction facilitates the study of 3D shape and volume change of an organ at the level of macrostructures made up of cells. It can also be used to investigate and validate novel techniques and algorithms in volumetric medical imaging and therapies. Creating 3D high-resolution atlases of different organs1,2,3 is another application of histology volume reconstruction. This provides a resource for investigating tissue structures and the spatial relationship between various cellular features. We present an image registration approach for histology volume reconstruction, which uses a set of optical blockface images. The reconstructed histology volume represents a reliable shape of the processed specimen with no propagated post-processing registration error. The Hematoxylin and Eosin (H&#38;E) stained sections of two mouse mammary glands were registered to their corresponding blockface images using boundary points extracted from the edges of the specimen in histology and blockface images. The accuracy of the registration was visually evaluated. The alignment of the macrostructures of the mammary glands was also visually assessed at high resolution.
This study delineates the different steps of this image registration pipeline, ranging from excision of the mammary gland through to 3D histology volume reconstruction. While 2D histology images reveal the structural differences between pairs of sections, 3D histology volume provides the ability to visualize the differences in shape and volume of the mammary glands.

We present an image registration approach for 3-dimensional (3D) histology volume reconstruction, which facilitates the study of the changes of an organ at the level of macrostructures made up of cells . Using this approach, we studied the 3D changes between wild-type and Igfbp7-null mammary glands.

Die Rekonstruktion der 3-Dimensional Histologie Volume und seine Anwendung auf Maus Milchdrüsen Studieren

Histology volume reconstruction facilitates the study of 3D shape and volume change of an organ at the level of macrostructures made up of cells. It can ...

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The colonic epithelium is dynamically turned over and epithelial cells are generated in the stem cell containing crypts of Lieberk&#252;hn. Progenitor cells produced in the crypt-bases migrate toward the luminal surface, undergoing a process of cellular differentiation before being shed into the gut lumen. In order to study these processes at the molecular level, we have developed a simple method for the microdissection of two spatially distinct regions of the colonic mucosa; the proliferative crypt zone, and the differentiated surface epithelial cells. Our objective is to isolate specific crypt and surface epithelial cell populations from mouse colonic mucosa for the isolation of RNA and protein.

Here we describe a simple method for the isolation of spatially distinct murine colonic epithelial surface cells from the underlying crypt-base cells.

Kryoschneiden Verfahren zur Mikrodissektion von Murine Kolonschleimhaut

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...

Rodent Working Heart Model for the Study of Myocardial Performance and Oxygen Consumption

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways that cannot be accomplished in vivo. For example, inotropic medications commonly also affect preload and afterload, precluding load-independent assessments of their myocardial effects in vivo. Additionally, this model allows for sampling of coronary sinus effluent without contamination from systemic venous return, permitting assessment of myocardial oxygen consumption. Further, the advent of miniaturized pressure-volume catheters has allowed for the precise quantification of markers of both systolic and diastolic performance. We describe a model in which the left ventricle can be studied while performing both volume and pressure work under controlled conditions. 
In this technique, the heart and lungs of a Sprague-Dawley rat (weight 300-500 g) are removed en bloc under general anesthesia. The aorta is dissected free and cannulated for retrograde perfusion with oxygenated Krebs buffer. The pulmonary arteries and veins are ligated and the lungs removed from the preparation. The left atrium is then incised and cannulated using a separate venous cannula, attached to a preload block. Once this is determined to be leak-free, the left heart is loaded and retrograde perfusion stopped, creating the working heart model. The pulmonary artery is incised and cannulated for collection of coronary effluent and determination of myocardial oxygen consumption. A pressure-volume catheter is placed into the left ventricle either retrograde or through apical puncture. If desired, atrial pacing wires can be placed for more precise control of heart rate. This model allows for precise control of preload (using a left atrial pressure block), afterload (using an afterload block), heart rate (using pacing wires) and oxygen tension (using oxygen mixtures within the perfusate).

Isolated working heart models can be used to measure the effect of loading conditions, heart rate, and medications on myocardial performance and oxygen consumption. We describe methods for preparation of a rodent left heart working model that permits study of systolic and diastolic performance and oxygen consumption under various conditions.

Nagetier Arbeits Herz Modell für die Untersuchung der myokardialen Leistung und Sauerstoffverbrauch

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal architecture. Here, a small pocket below the skin was created using Mayo scissors, allowing separation of the glands within the subcutaneous tissue from the underlying peritoneum. Visualization of the glands was aided by the use of 3.5x-R surgical micro loupes. The pelt was inverted and pinned back allowing identification of the intact mammary fat pads. Each of the #4 abdominal glands was bluntly dissected by sliding the scalpel blade laterally between the subcutaneous layer and the glands. Immediately post-harvest, glands were placed in 10% neutral buffered formalin for subsequent tissue processing. Excision of the entire gland is advantageous because it primarily eliminates the risk of excluding important tissue-wide interactions between ductal epithelial cells and other microenvironmental cellular populations that could be missed in a partial biopsy. One drawback of the methodology is the use of serial sections from fixed tissues which limits analyses of ductal morphogenesis and protein expression to discrete locations within the gland. As such, changes in ductal architecture and protein expression in 3 dimensions (3D) is not readily obtainable. Overall, the technique is applicable to studies requiring whole intact murine mammary glands for downstream investigations such as developmental ductal morphogenesis or breast cancer.

Here, we present a protocol for the isolation of whole, intact mouse mammary glands to investigate extracellular matrix (ECM) expression and ductal morphology. Mouse #4 abdominal glands were extracted from 8-10 week old female nulliparous mice, fixed in neutral buffered formalin, sectioned and stained using immunohistochemistry for ECM proteins.

Isolierung von intakt, ganze Maus Milchdrüsen zur Analyse der extrazellulären Matrix Ausdruck und Drüse Morphologie

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Investigating Teliospore Germination Using Microrespiration Analysis and Microdissection

Smut fungi are the etiological agents of several devastating agricultural diseases. They are characterized by the production of teliospores, which are thick-walled dispersal agents. Teliospores can remain dormant for decades. The dormancy is characterized by low metabolic rates, paused macromolecular biosynthesis and greatly reduced levels of respiration. Upon receiving required environmental signals, teliospores germinate to produce haploid cells, which can initiate new rounds of infection. Teliospore germination is characterized by the resumption of macromolecular biosynthesis, increased respiration and dramatic morphological changes. In order to precisely measure changes in cellular respiration during the early stages of germination, we have developed a simple protocol employing a Clark-type respirometer. The later stages of germination are distinguished by specific morphological changes, but germination is asynchronous. We developed a microdissection technique that enables us to collect teliospores at distinct germination stages.

Smut fungi cause many devastating agricultural diseases. They are dispersed as dormant teliospores that germinate in response to environmental cues. We outline two methods to investigate molecular changes during germination: measuring respiration increase to detect metabolic activation and assessing changing molecular events by isolating teliospores at distinct morphological stages.

Untersuchung von Teliospore Keimen mit Microrespiration Analyse und Mikrodissektion

Smut fungi are the etiological agents of several devastating agricultural diseases. They are characterized by the production of teliospores, which are ...

Isolation of Myoepithelial Cells from Adult Murine Lacrimal and Submandibular Glands

The lacrimal gland (LG) is an exocrine tubuloacinar gland that secretes an aqueous layer of tear film. The LG epithelial tree is comprised of acinar, ductal epithelial, and myoepithelial cells (MECs). MECs express alpha smooth muscle actin (&#945;SMA) and have a contractile function. They are found in multiple glandular organs and are of ectodermal origin. In addition, the LG contains SMA+ vascular smooth muscle cells of endodermal origin called pericytes: contractile cells that envelop the surface of vascular tubes. A new protocol allows us to isolate both MECs and pericytes from adult murine LGs and submandibular glands (SMGs). The protocol is based on the genetic labeling of MECs and pericytes using the SMACreErt2/+:Rosa26-TdTomatofl/fl mouse strain, followed by preparation of the LG single-cell suspension for fluorescence activated cell sorting (FACS). The protocol allows for the separation of these two cell populations of different origins based on the expression of the epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) by MECs, whereas pericytes do not express EpCAM. Isolated cells could be used for cell cultivation or gene expression analysis.

The lacrimal gland (LG) has two cell types expressing &#945;-smooth muscle actin (&#945;SMA): myoepithelial cells (MECs) and pericytes. MECs are of ectodermal origin, found in many glandular tissues, while pericytes are vascular smooth muscle cells of endodermal origin. This protocol isolates MECs and pericytes from murine LGs.

Isolierung von myepithelialen Zellen aus der Urmorine, Lacrimal und Submandibular Drüsen

The lacrimal gland (LG) is an exocrine tubuloacinar gland that secretes an aqueous layer of tear film. The LG epithelial tree is comprised of acinar, ...

Mikrodissektion von Black Widow Spider Silk-produzierenden Drüsen

Zusammenfassung

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Dissection der Dünndarm-und Speicheldrüsen von Ae. aegypti Moskitos

Laser Capture Mikrodissektion von Säugetiergewebe

Mikrodissektion von Zebrafisch Embryonale Augentücher

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Die Rekonstruktion der 3-Dimensional Histologie Volume und seine Anwendung auf Maus Milchdrüsen Studieren

Kryoschneiden Verfahren zur Mikrodissektion von Murine Kolonschleimhaut

Nagetier Arbeits Herz Modell für die Untersuchung der myokardialen Leistung und Sauerstoffverbrauch

Isolierung von intakt, ganze Maus Milchdrüsen zur Analyse der extrazellulären Matrix Ausdruck und Drüse Morphologie

Untersuchung von Teliospore Keimen mit Microrespiration Analyse und Mikrodissektion

Isolierung von myepithelialen Zellen aus der Urmorine, Lacrimal und Submandibular Drüsen