Name: microdissection of black widow spider silk-producing glands
Uploaded: 2011-01-11T23:59:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
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Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium NSF RUI MCB-0950372 mit dem Titel Molekulare Charakterisierung von Black Widow Spinnenseidenproteinen unterstützt.

1. Betäubende die Spinne und die Isolierung des Bauches <ol><li> Übertragen Sie die Spinne aus einem Glas in einem Karton mit Kunststoff (Abbildung 1A) ausgekleidet. Wir sammeln in der Regel Spinnen aus Holzstapel, Garagen oder Büsche und Haus sie im Labor in Gläsern. Da die Spinne nicht klettern kann die Kunststoff-Futter, bietet es eine effiziente Methode, um die Spinne aus einem Glas oder Kaffee können Transfer in ein kleineres Gefäß für Anästhesie Zwecke. Beim Umgang mit der Spinne an diesem Punkt, sollten Sie das Tragen von zwei Paar Latex-Handschuhe oder Gartenhandschuhe aus Gründen der Sicherheit. </li><li> Während die Spinne ist in der Box mit Kunststoff ausgekleidet, nähern sich die Spinne von der Rückseite und lassen Sie die Spinne Abgleiten in die Kunststoff-Flasche Kultur. Nach der Spinne in die Flasche, sofort den Stecker over the top (Abbildung 1B). Wir empfehlen die Verwendung eines Fläschchens, dass etwa 101,6 mm x 31,75 mm (L x D) ist. Dies minimiert die Menge an Kohlendioxid für die Betäubung Schritt nötig. </li><li> Anesthetize die Spinne durch die Einführung von Kohlendioxid-Gas bei 5-10 Pfund pro Quadratzoll für 10 min (Abbildung 1C). Diese Gasmenge wird nur klopfen die Spinne für rund 5 min, so dass nach Betäubung müssen Sie sofort Schritte 1,4-1,5 gehen. </li><li> Setzen Sie den narkotisierten Spinne in einen kleinen Dissektion Schüssel und Verwendung einer Pinzette, um die Spinne Rückenseite nach oben (rote Sanduhr nach unten) positionieren. </li><li> Clip der Stiel (schmale Stiel Anschluss des Cephalothorax und das Abdomen), um den Bauch aus dem Rest der Spinne (Abbildung 1D) freizugeben. Bewahren Sie den Cephalothorax in der Tiefkühltruhe über Nacht in einer Petrischale und entsorgen nach gefrorenen am nächsten Tag. Seien Sie vorsichtig beim Bewegen der Cephalothorax wie die Zähne der Spinne präsentieren in diesem Segment sind. </li><li> Befestigen Sie den Bauch, um die Sylgard Material in den kleinen Dissektion Schüssel mit einem einzigen Insekten pin. Legen Sie das Insekt Stift durch das Loch aus dem Blütenstiel Clipping (Abb. 1E) gemacht. Dies kann leicht als der Ort, wo die Flüssigkeit aus dem Clipping des Stiels Schwellenländern identifiziert werden. Sicherstellen, dass die Düse (entgegengesetzten Ende des Stiels) ist nach unten orientiert (am nächsten zu Ihnen). </li></ol> 2. Die Entfernung des Exoskelett <ol><li> Sprechen Sie die erste Schnitt durch das Exoskelett mit einem Paar Mikroschere, beginnend mit dem Loch aus dem Blütenstiel Clipping. Cut seitlich bis zur Dorsalseite auf beiden Seiten (Abb. 1F) erreicht wird. Mit einer Pinzette, Ziehen Sie die vordere Exoskelett Segment und fügen Sie einen zweiten Stift an dieser Stelle. Nach dem Einlegen der zweiten Stift, drehen Sie das Sezieren Tablett kaudal (90 °-Winkel) von der ersten seitlichen Schnitten und weiter schneiden, bis die Düsen erreicht werden (Abbildung 1G). Dieser Schnitt wird senkrecht oder vertikal sein, um die ersten seitlichen Schnitt. Nicht durch die Düsen, wenn der vertikale Schnitt gemacht wird (posterior gegenüber dem Sanduhr und es hat einen kreisförmigen Aussehen) geschnitten. Nichtbeachtung der zweiten Stifteinsatz wird in den Bauch drehen, wenn die vertikale Schnitte durchgeführt werden, führen. </li><li> Tauchen Sie den Bauch in Sezieren Puffer-Lösung (0,1 M Natriumchlorid, 0,015 M Natriumcitrat, 0,1% Diethylpyrocarbonat). </li><li> Peel die restlichen Exoskelett wieder ab dem ersten, seitlichen Einschnitt. Wenn dies abgeschlossen ist, sollte das Fettgewebe deutlich sichtbar (Abbildung 1H). </li></ol> 3. Die Isolierung der Seiden-produzierenden Drüsen <ol><li> Mit einer Pinzette beginnen Hänseleien entfernt die Fettschicht (Abbildung 1H). Das Fett hat eine weißliche bis gelbliche Erscheinung. Fahren Sie bis das meiste Fett wird entfernt und die Spinndrüsen sind deutlich sichtbar. Die tubuliform Drüse besteht aus drei Paaren von sehr langen, zylindrischen Röhren, die reichlich in der Bauchhöhle sind. Die großen Ampullendrüse, die paarweise gefunden wird, ist eine große, halbmondförmige Ampulle mit einem langen gewundenen distalen Schwanz und einem proximalen Kanal, der in der Breite abnimmt, wie es der Spinne Spinndüsen Ansätze. Die kleine Ampullendrüse ist sehr ähnlich in Morphologie der großen Ampullendrüse, aber es ist deutlich kleiner. Die flagelliform Drüse, auch auftreten in Paaren, ist rund und multilobular mit einem kleinen zylindrischen Zick-Zack-Kanal, der nach unten erstreckt auf die Spinndüsen. Das Aggregat Drüse (gefunden in Paaren) ist ein sehr großes, multilobular Drüse, die eine sehr große Ausführungsgang, die große, unregelmäßige Lappen hat auf sie hat. Die aciniform Drüsen kommen in großer Zahl und ähneln kurze, kleine fingerlike Projektionen. Die birnenförmig Drüse ist die kleinste Drüse in der Bauchhöhle und hat viele verdichtet, zylindrischen Kanäle, die ein Fan mit vielen kleinen Ausführungsgänge, die bis hinab zu den Spinndüsen ähneln. </li><li> Wir empfehlen, die Drüsen in der folgenden Reihenfolge: tubuliform, großen Ampullendrüse, flagelliform, kleinere Ampullendrüse, aggregieren aciniform, und dann die birnenförmig (Abbildung 2A-B). </li><li> Beginnend mit dem tubuliform, necken diese Drüsen aus der übrigen the Drüsen - sie sollten auf der anderen Drüsen (Abbildung 2A) zu sitzen. Es gibt drei Paare von tubuliform Drüsen in einer einzigen Spinne. Lassen Sie sie zu schweben frei, sondern bleiben an ihren Spinnwarzen durch ihre Leitungen. </li><li> Next, necken sich die großen Ampullendrüse Drüsen. Es gibt zwei große Ampullendrüse Drüsen in einer Spinne. Während das Verfahren zur Entfernung sicher, dass die Leitungen verbunden bleiben die Drüsen (Abbildung 2A). </li><li> Fahren Sie mit dem Rest der Drüsen von einander entfernt zu necken, arbeiten sorgfältig, so dass jeder Punktion der Drüsen, vor allem das Aggregat und flagelliform Drüsen. Jede Drüse sollte frei schwimmenden alle den Weg zu seinem Ausgangspunkt in das Exoskelett der Spinndüsen. Diese Drüsen sind auch paarweise gefunden. Entfernen Sie jede Drüse durch Einklemmen des Kanals mit einer Pinzette und vorsichtiges Ziehen, bis er von der Ausfahrt entfernt Pointbreaks. Die großen Ampullendrüse, flagelliform, kleinere Ampullendrüse und aggregieren Drüsen sind in Paaren gefunden. Die aciniform und birnenförmig Drüsen kommen in vielen mehr Paare. </li><li> Entfernen Sie jede Drüse durch Einklemmen des Kanals mit einer Pinzette und vorsichtiges Ziehen, bis er bricht, die Ausfahrt nach unten durch die Düse. Wir in der Regel speichern die Drüsen nass, aber wir wissen nicht zusätzliche Puffer. </li><li> Da die Drüsen entfernt werden, legen Sie sie in sterile pre-markierten 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Individuelle Drüsen sind in Abbildung 3A-G gezeigt. Bewahren Sie diese Drüsen auf Eis und dann Flash-frieren sie in flüssigem Stickstoff. Nach Schockgefrieren in flüssigem Stickstoff, legen Sie sie bei -80 ° C für die Lagerung. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Beim Entfernen der verschiedenen Drüsen, sollten extreme Vorsicht walten beim Umgang mit dem flagelliform und aggregieren Drüsen werden, da diese beiden Strukturen leicht durchstoßen werden können und beschädigt mit der Zange. Darüber hinaus ist es erwähnenswert, dass morphologisch die flagelliform und aggregieren Drüsen sehr ähnlich vor ihrer Entfernung betrachten und sie sind oft miteinander verwoben. Um zu verhindern Kreuzkontamination dieser Gewebe bei der Entnahme sollte das Dissektor sorgfältig tease diese Strukturen auseinander. Außerdem auf der ersten Exposition der Seiden-produzierenden Drüsen, die aciniform und birnenförmig Drüsen der schwierigsten sofort visualisieren aufgrund ihrer geringeren Größe und anatomische Lage sein. Oft gibt es die Anwesenheit von vielen Eiern. Darüber hinaus muss zusätzlich darauf geachtet werden, beim Entfernen des birnenförmig Drüse werden, da dieses Gewebe ist extrem klebrig und wird oft zu Ihrem Zange halten. Wenn dieses Verfahren richtig gemacht wird, ist es möglich, alle sieben Seide produzierenden Drüsen von einer einzigen Spinne in hochreiner Form zu erhalten. In der Regel kann man wieder Mikrogramm-Mengen von Gesamt-RNA und Protein aus einer einzigen Spinne Dissektion. Ein Beispiel für die Verwendung der Gesamt-RNA für die qPCR zum mRNA-Spiegel einer tubuliform beschränkt Fibroin Gen, TuSp1 zu untersuchen, wird angezeigt (Abbildung 4). Vertreter Experimente, die an Protein aus den Drüsen Lysaten gesammelt beinhalten z. B. in-Lösung tryptischen Verdauung durch MS-Analyse (könnte auch für MS / MS-Analyse verwendet werden) oder eine Aminosäure-Zusammensetzung Analyse wird angezeigt (Abbildung 5-6, jeweils) gefolgt. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig1a.jpg" alt="Abbildung 1a" /><img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig1e.jpg" alt="Abbildung 1e" /> Abbildung 1. Handling, betäuben, und die Entfernung des Exoskelett aus dem Bauch einer weiblichen Spinne der schwarzen Witwe. A) Transfer von der Spinne in einem Karton mit Kunststoff ausgekleidet, um zu erleichtern bewegt die Spinne in einen kleineren Kunststoff-Fläschchen. B) Spider platziert in eine Kunststoff-Flasche mit Stecker. C) betäuben die Spinne mit Kohlendioxid-Gas. D) Die Trennung der Cephalothorax aus dem Bauch mit Mikroschere. E) Immobilisierung des Bauches in der Anatomie Tablett mit Insekten Pins. F) anzeigen nach einem seitlichen Einschnitt mit der Schere und ein Teil des Exoskelett ist zurück mit einer Pinzette geschält wird. G) Einschnitte senkrecht zur ersten seitlichen Schnitt. H) Die Entfernung der Exoskelett und Exposition der Fettschicht. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Visualisierung der sieben verschiedenen Seiden-produzierenden Drüsen, während intakte in den Bauch der Spinne sowie das umgebende Gewebe. A) Bilder von der tubuliform, großen Ampullendrüse, flagelliform, aggregieren kleinere Ampullendrüse Gewebe mit 12facher Vergrößerung. B) Bild des aciniform und birnenförmig Drüsen mit 12facher Vergrößerung. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig3a.jpg" alt="Abbildung 3a" /><img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig3e.jpg" alt="Abbildung 3e" /> Abbildung 3. Photographs der sieben Seide produzierenden Drüsen nach ihrer Entnahme aus dem Bauch. Alle Bilder wurden bei 20-facher Vergrößerung mit Ausnahme der aciniform und birnenförmig Drüsen, die bei 40x getan wurden gefangen genommen. A) großenAmpullendrüse; B) Dur-und Moll Ampullendrüse (rechts) zum Größenvergleich; C) tubuliform; D) flagelliform; E)-Aggregat; F) aciniform; G) birnenförmig. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Repräsentative Ergebnisse des Expressionsmusters der Seide Gen, TuSp1 nach Vermessung der TuSp1 mRNA-Spiegel in den verschiedenen Seiden-produzierenden Drüsen (mit Ausnahme der birnenförmig Drüse) mittels quantitativer real-time PCR (qPCR) nach der Isolierung von Gesamt-RNA aus die Drüsen. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5. Beispiel von MS-Analyse von Protein-Extrakten aus der birnenförmig Drüse folgenden in-Lösung tryptischen Verdau erhalten. Hinweis: x2 für 2-fache Vergrößerung des Spektrums Intensität. Spectrum Peptid-Ionen-Massen, die Regionen der PySp1 Fibroin entsprechen, sind mit dem Symbol # angezeigt. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig6.jpg" alt="Abbildung 6" /> Abbildung 6. Typisches Ergebnis der Aminosäure-Zusammensetzung Profil der Proteine ​​aus dem tubuliform Drüse extrahiert. Hinweis: ASX = Asp und Asn; GLX = Glu und Gln. Blaufärbung zeigt Aminosäuren mit polaren Seitenkette Gruppen während rote Färbung stellt Aminosäurereste mit unpolaren Seitenkette Gruppen.

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Unsere Methodik für die Mikrodissektion der Seiden-produzierenden Drüsen aus der schwarzen Witwe bietet ein wirksames Mittel zu hoch gereinigten Seide produzierenden Drüsen zu erhalten. Dissektionen können in 1,5 bis 3 Stunden abgeschlossen sein, was zu einem kompletten Satz der sieben verschiedenen Seiden-produzierenden Drüsen aus cobweavers. Beziehen hochgereinigtes Seide-Drüse Proben ermöglicht Forschern die Möglichkeit, ein breites Spektrum an biochemischen Untersuchungen, einschließlich der Identifizierung...

<table><tbody><tr><td>Sodium chloride</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>SX0420-1</td><td>0.1 M in water</td></tr><tr><td>Diethyl pyrocarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-5758 - 5 ml</td><td>0.1% v/v</td></tr><tr><td>Sodium citrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1804 - 1 kg</td><td>0.015 M in water</td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica MZ16</td><td></td></tr><tr><td>Digital microscope camera</td><td>Leica Microsystems</td><td>DFC320</td><td>Software - Leica Application Suite v2.8.1</td></tr><tr><td>Vannas scissors</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>500260</td><td></td></tr><tr><td>Stainless steel forceps</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>501764</td><td>Mini Dumont #M5S</td></tr><tr><td>Insect pins</td><td>Indigo Instruments</td><td>33414-2</td><td>Insect pins #2</td></tr><tr><td>Small or large dissection dishes</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>DD-50-S or DD-90-S</td><td>52 mm diameter x 18 mm H (Sylgard Depth ~6mm) or 93 mm x 22 mm</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; culture vials</td><td>Carolina Biological</td><td>FR-17-3076</td><td>Size is 31.75 mm diameter x 101.6 mm</td></tr></tbody></table>

microdissection of black widow spider silk-producing glands

Moderne Spinnen High-Performance-Seidenfasern mit einer breiten Palette von biologischen Funktionen, einschließlich Fortbewegung, Beutefang und zum Schutz der Entwicklung der Nachkommen 1,2. Spiders diese Aufgaben durch Spinnen mehrere verschiedene Fasertypen, dass diverse mechanische Eigenschaften aufweisen. Eine solche Spezialisierung der Fasertypen hat durch die Entwicklung der verschiedenen Seiden-produzierenden Drüsen, die als kleine Biofabrik Funktion aufgetreten ist. Diese Biofabrik Herstellung und Lagerung von großen Mengen von Seidenproteinen für Faserproduktion. Durch eine komplexe Reihe von biochemischen Vorgängen, sind diese Seidenproteine ​​von einer Flüssigkeit in einem festen Material nach der Extrusion umgewandelt. Mechanische Untersuchungen haben gezeigt, dass Spinnenseide stärker als hochfestem Stahl 3 sind. Analysen, um die Beziehung zwischen der Struktur und Funktion der Spinnenseide Themen verstehen haben ergeben, dass Spinnenseide zum größten Teil aus Proteinen oder Fibroine, dass Block wiederholt haben im Rahmen ihrer Proteinsequenzen 4 besteht. Gemeinsame molekulare Signaturen, die die unglaubliche Zugfestigkeit und Dehnbarkeit von Spinnenseide beitragen werden durch die Analysen der übersetzten Seide cDNAs entwirrt. Angesichts der außergewöhnlichen Materialeigenschaften von Spinnenseide sind Forschungslabors auf der ganzen Welt Rennen zu verstehen und zu imitieren das Spinnverfahren für synthetische Seidenfasern für kommerzielle, militärische und industrielle Anwendungen. Eine der größten Herausforderungen für die Spinnerei künstliche Spinnenseide im Forschungslabor beinhaltet ein vollständiges Verständnis der biochemischen Prozesse, die während der Extrusion der Fasern von der Seiden-produzierenden Drüsen auftreten. Hier präsentieren wir eine Methode zur Isolierung von den sieben verschiedenen Seiden-produzierenden Drüsen aus der cobweaving Schwarze Witwe, die die großen und kleinen Ampullendrüse Drüsen enthält [fertigt dragline und Gerüste Seide] 5,6, tubuliform [synthetisiert Eihülle Seide] 7 , 8, flagelliform [unbekannter Funktion in cob-Weber], aggregieren [macht Leim Seide], aciniform [synthetisiert Beute Verpackung und Eihülle Themen] 9 und birnenförmig [produziert Befestigung Disc Seide] 10. Dieser Ansatz basiert auf betäuben die Spinne mit Kohlendioxid-Gas, anschließende Trennung der Cephalothorax aus dem Bauch, und Mikrodissektion des Bauches, die Seiden-produzierenden Drüsen zu erhalten basiert. Nach der Trennung der verschiedenen Seiden-produzierenden Drüsen, können diese Gewebe verwendet, um verschiedene Makromoleküle für verschiedene biochemische Analysen, einschließlich der quantitativen real-time PCR, Northern-und Western-Blot analysiert Massenspektrometrie (MS oder MS / MS) zu identifizieren abgerufen werden New Silk Protein-Sequenzen, Suche nach Proteinen, die in die Seide Montage Weg zu beteiligen, oder verwenden Sie das intakte Gewebe für die Zellkultur oder histologische Untersuchungen.

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Microdissection of Black Widow Spider Silk-producing Glands

Hier beschreiben wir eine effiziente Strategie, um die Seide produzierenden Drüsen aus dem Bauch der weiblichen Schwarzen Witwen zu entfernen. Dieses Verfahren ermöglicht die schnelle Trennung der sieben verschiedenen Seiden-produzierenden Drüsen in hochreiner Mode, ein wichtiger Prozess für die Ermittler Studium Spinnenseide Produktion und Faserverbund.

Mikrodissektion von Black Widow Spider Silk-produzierenden Drüsen

Modern spiders spin high-performance silk fibers with a broad range of biological functions, including locomotion, prey capture and protection of ...

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Research

JoVE Journal

Biology

15.7K Aufrufe.  University of the Pacific. Hier beschreiben wir eine effiziente Strategie, um die Seide produzierenden Drüsen aus dem Bauch der weiblichen Schwarzen Witwen zu entfernen. Dieses Verfahren ermöglicht die schnelle Trennung der sieben verschiedenen Seiden-produzierenden Drüsen in hochreiner Mode, ein wichtiger Prozess für die Ermittler Studium Spinnenseide Produktion und Faserverbund.

Serie: Microdissection of Black Widow Spider Silk-producing Glands

Synthetic Spider Silk Production on a Laboratory Scale

As society progresses and resources become scarcer, it is becoming increasingly important to cultivate new technologies that engineer next generation biomaterials with high performance properties. The development of these new structural materials must be rapid, cost-efficient and involve processing methodologies and products that are environmentally friendly and sustainable. Spiders spin a multitude of different fiber types with diverse mechanical properties, offering a rich source of next generation engineering materials for biomimicry that rival the best manmade and natural materials. Since the collection of large quantities of natural spider silk is impractical, synthetic silk production has the ability to provide scientists with access to an unlimited supply of threads. Therefore, if the spinning process can be streamlined and perfected, artificial spider fibers have the potential use for a broad range of applications ranging from body armor, surgical sutures, ropes and cables, tires, strings for musical instruments, and composites for aviation and aerospace technology. In order to advance the synthetic silk production process and to yield fibers that display low variance in their material properties from spin to spin, we developed a wet-spinning protocol that integrates expression of recombinant spider silk proteins in bacteria, purification and concentration of the proteins, followed by fiber extrusion and a mechanical post-spin treatment. This is the first visual representation that reveals a step-by-step process to spin and analyze artificial silk fibers on a laboratory scale. It also provides details to minimize the introduction of variability among fibers spun from the same spinning dope. Collectively, these methods will propel the process of artificial silk production, leading to higher quality fibers that surpass natural spider silks.

Despite the outstanding mechanical and biochemical properties of spider silks, this material cannot be harvested in large quantities by conventional means. Here we describe an efficient strategy to spin artificial spider silk fibers, which is an important process for investigators studying spider silk production and their use as next-generation biomaterials.

Synthetische Spinnenseide Produktion im Labormaßstab

As society progresses and resources become scarcer, it is becoming increasingly important to cultivate new technologies that engineer next generation ...

Forschung

Biotechnik

Harvesting Venom Toxins from Assassin Bugs and Other Heteropteran Insects

Heteropteran insects such as assassin bugs (Reduviidae) and giant water bugs (Belostomatidae) descended from a common predaceous and venomous ancestor, and the majority of extant heteropterans retain this trophic strategy. Some heteropterans have transitioned to feeding on vertebrate blood (such as the kissing bugs, Triatominae; and bed bugs, Cimicidae) while others have reverted to feeding on plants (most Pentatomomorpha). However, with the exception of saliva used by kissing bugs to facilitate blood-feeding, little is known about heteropteran venoms compared to the venoms of spiders, scorpions and snakes.
One obstacle to the characterization of heteropteran venom toxins is the structure and function of the venom/labial glands, which are both morphologically complex and perform multiple biological roles (defense, prey capture, and extra-oral digestion). In this article, we describe three methods we have successfully used to collect heteropteran venoms. First, we present electrostimulation as a convenient way to collect venom that is often lethal when injected into prey animals, and which obviates contamination by glandular tissue. Second, we show that gentle harassment of animals is sufficient to produce venom extrusion from the proboscis and/or venom spitting in some groups of heteropterans. Third, we describe methods to harvest venom toxins by dissection of anaesthetized animals to obtain the venom glands. This method is complementary to other methods, as it may allow harvesting of toxins from taxa in which electrostimulation and harassment are ineffective. These protocols will enable researchers to harvest toxins from heteropteran insects for structure-function characterization and possible applications in medicine and agriculture.

Although many insects in the suborder Heteroptera (Insecta: Hemiptera) are venomous, their venom composition and the functions of their venom toxins are mostly unknown. This protocol describes methods to harvest heteropteran venoms for further characterization, using electrostimulation, harassment, and gland dissection.

Ernte Venom Giftstoffe aus Assassin Bugs und andere Heteropteran Insekten

Heteropteran insects such as assassin bugs (Reduviidae) and giant water bugs (Belostomatidae) descended from a common predaceous and venomous ancestor, ...

Umwelt

Measuring Hypopharyngeal Gland Acinus Size in Honey Bee (Apis mellifera) Workers

The nurse hypopharyngeal glands produce the protein fraction of the worker and royal jelly that is fed to developing larvae and queens. These paired glands that are located in the head of the bee are highly sensitive to the quantity and quality of pollen and pollen substitutes that the nurse bee consumes. The glands get smaller when nurses are fed deficient diets and are large when they are fed complete diets. Because nurse hypopharyngeal gland size is a robust indicator of nurse nutrition, it is essential that those studying honey bee nutrition know how to measure these glands. Here, we provide detailed methods for dissecting, staining, imaging, and measuring nurse bee hypopharyngeal glands. We present comparisons of unstained and stained tissue and data that were used to study the impact of pollen on gland size. This method has been used to test how diet impacts hypopharyngeal gland size but has further use for understanding the role of these glands in hive health.

Measuring Hypopharyngeal Gland Acinus Size in Honey Bee Apis mellifera Workers

Hypopharyngeal gland acinus size is a robust measure of nurse honey bee nutrition. Here, we provide a detailed protocol for dissecting, staining, imaging, and measuring nurse bee hypopharyngeal gland acini.

Messung der Schlunddrüsen Drüse Acinus Größe in Honigbiene (Apis Mellifera) Arbeitnehmer

The nurse hypopharyngeal glands produce the protein fraction of the worker and royal jelly that is fed to developing larvae and queens. These paired ...

Analyzing Murine Schwann Cell Development Along Growing Axons

The development of peripheral nerves is an intriguing process. Neurons send out axons to innervate specific targets, which in humans are often more than 100 cm away from the soma of the neuron. Neuronal survival during development depends on target-derived growth factors but also on the support of Schwann cells (SCs). To this end SC ensheath axons from the region of the neuronal soma (or the transition from central to peripheral nervous system) to the synapse or neuromuscular junction. Schwann cells are derivatives of the neural crest and migrate as precursors along emerging axons until the entire axon is covered with SCs. This shows the importance of SC migration for the development of the peripheral nervous system and underlines the necessity to investigate this process. In order to analyze SC development, a setup is needed which next to the SCs also includes their physiological substrate for migration, the axon. Due to intrauterine development in vivo time-lapse imaging, however, is not feasible in placental vertebrates like mouse (mus musculus). To circumvent this, we adapted the superior cervical ganglion (SCG) explant technique. Upon treatment with nerve growth factor (NGF) SCG explants extend axons, followed by SC precursors migrating along the axons from the ganglion to the periphery. The beauty of this system is that the SC are derived from a pool of endogenous SC and that they migrate along their own physiological axons which are growing at the same time. This system is especially intriguing, because the SC development along axons can be analyzed by time-lapse imaging, opening further possibilities to gain insights into SC migration.

Here we describe a Schwann cell (SC) migration assay in which SCs are able to develop along extending axons.

Analyse Murine Schwann Zell Entwicklung entlang wachsenden Axone

The  development of peripheral nerves is an intriguing process. Neurons send out  axons to innervate specific targets, which in humans are often more than ...

Neurowissenschaften

Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, including cell biology, oncology, dentistry, and immunology. The SMG is an exocrine gland comprised of secretory epithelial cells, myofibroblasts, endothelial cells, nerves, and extracellular matrix. Dynamic cellular processes in the rat and mouse SMG have previously been imaged, mostly using inverted multi-photon microscope systems. Here, we describe a straightforward protocol for the surgical preparation and stabilization of the murine SMG in anesthetized mice for in vivo imaging with upright multi-photon microscope systems. We present representative intravital image sets of endogenous and adoptively transferred fluorescent cells, including the labeling of blood vessels or salivary ducts and second harmonic generation to visualize fibrillar collagen. In sum, our protocol allows for surgical preparation of mouse salivary glands in upright microscopy systems, which are commonly used for intravital imaging in the field of immunology.

We describe a protocol to surgically expose and stabilize the murine submandibular salivary gland for intravital imaging using upright intravital microscopy. This protocol is easily adaptable to other exocrine glands of the head and neck region of mice and other small rodents.

Vorbereitung der murinen mandibulären Speicheldrüse aufrecht Intravitalen Mikroskopie

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, ...

Immunologie und Infektion

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Intravitalmikroskopie zur Imaging subzellulärer Strukturen in lebenden Mäusen Ausdruck Fluoreszierende Proteine

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Biologie

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Many plants possess specialized structures that are involved in the production and secretion of specific low molecular weight compounds and proteins. These structures are almost always localized on plant surfaces. Among them are nectaries or glandular trichomes. The secreted compounds are often employed in interactions with the biotic environment, for example as attractants for pollinators or deterrents against herbivores.
Glands that are unique in several aspects can be found in carnivorous plants. In so-called pitcher plants of the genus Nepenthes, bifunctional glands inside the pitfall-trap on the one hand secrete the digestive fluid, including all enzymes necessary for prey digestion, and on the other hand take-up the released nutrients. Thus, these glands represent an ideal, specialized tissue predestinated to study the underlying molecular, biochemical, and physiological mechanisms of protein secretion and nutrient uptake in plants. Moreover, generally the biosynthesis of secondary compounds produced by many plants equipped with glandular structures could be investigated directly in glands.
In order to work on such specialized structures, they need to be isolated efficiently, fast, metabolically active, and without contamination with other tissues. Therefore, a mechanical micropreparation technique was developed and applied for studies on Nepenthes digestion fluid. Here, a protocol is presented that was used to successfully prepare single bifunctional glands from Nepenthes traps, based on a mechanized microsampling platform. The glands could be isolated and directly used further for gene expression analysis by PCR techniques after preparation of RNA.

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Plants glands are specialized structures responsible for the biosynthesis and secretion of many compounds involved in interactions with the biotic environment. To enable studies on their molecular and biochemical features, a mechanical micropreparation technique was established in order to isolate single metabolically active glands, here from the carnivorous plant Nepenthes.

Many plants possess specialized structures that are involved in the production and secretion of specific low molecular weight compounds and proteins. ...

Extraction of Venom and Venom Gland Microdissections from Spiders for Proteomic and Transcriptomic Analyses

Venoms are chemically complex secretions typically comprising numerous proteins and peptides with varied physiological activities. Functional characterization of venom proteins has important biomedical applications, including the identification of drug leads or probes for cellular receptors. Spiders are the most species rich clade of venomous organisms, but the venoms of only a few species are well-understood, in part due to the difficulty associated with collecting minute quantities of venom from small animals. This paper presents a protocol for the collection of venom from spiders using electrical stimulation, demonstrating the procedure on the Western black widow (Latrodectus hesperus). The collected venom is useful for varied downstream analyses including direct protein identification via mass spectrometry, functional assays, and stimulation of venom gene expression for transcriptomic studies. This technique has the advantage over protocols that isolate venom from whole gland homogenates, which do not separate genuine venom components from cellular proteins that are not secreted as part of the venom. Representative results demonstrate the detection of known venom peptides from the collected sample using mass spectrometry. The venom collection procedure is followed by a protocol for dissecting spider venom glands, with results demonstrating that this leads to the characterization of venom-expressed proteins and peptides at the sequence level.

This article provides a protocol for the extraction of venom from spiders using electrical stimulation in order to 1) conduct proteomic characterization, 2) stimulate venom gland gene expression, and 3) perform functional studies of venoms. This is followed by a description of venom gland microdissections for gene expression studies.

Extraktion von Venom und Giftdrüse Mikrodissektionen von Spiders für Proteomik und transkriptomischen Analysen

Venoms are chemically complex secretions typically comprising numerous proteins and peptides with varied physiological activities. Functional ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal architecture. Here, a small pocket below the skin was created using Mayo scissors, allowing separation of the glands within the subcutaneous tissue from the underlying peritoneum. Visualization of the glands was aided by the use of 3.5x-R surgical micro loupes. The pelt was inverted and pinned back allowing identification of the intact mammary fat pads. Each of the #4 abdominal glands was bluntly dissected by sliding the scalpel blade laterally between the subcutaneous layer and the glands. Immediately post-harvest, glands were placed in 10% neutral buffered formalin for subsequent tissue processing. Excision of the entire gland is advantageous because it primarily eliminates the risk of excluding important tissue-wide interactions between ductal epithelial cells and other microenvironmental cellular populations that could be missed in a partial biopsy. One drawback of the methodology is the use of serial sections from fixed tissues which limits analyses of ductal morphogenesis and protein expression to discrete locations within the gland. As such, changes in ductal architecture and protein expression in 3 dimensions (3D) is not readily obtainable. Overall, the technique is applicable to studies requiring whole intact murine mammary glands for downstream investigations such as developmental ductal morphogenesis or breast cancer.

Here, we present a protocol for the isolation of whole, intact mouse mammary glands to investigate extracellular matrix (ECM) expression and ductal morphology. Mouse #4 abdominal glands were extracted from 8-10 week old female nulliparous mice, fixed in neutral buffered formalin, sectioned and stained using immunohistochemistry for ECM proteins.

Isolierung von intakt, ganze Maus Milchdrüsen zur Analyse der extrazellulären Matrix Ausdruck und Drüse Morphologie

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Dissection and Immunostaining of Larval Salivary Glands from Anopheles gambiae Mosquitoes

Mosquito salivary glands (SGs) are a requisite gateway organ for the transmission of insect-borne pathogens. Disease-causing agents, including viruses and the Plasmodium parasites that cause malaria, accumulate in the secretory cavities of SG cells. Here, they are poised for transmission to their vertebrate hosts during a subsequent blood meal. As adult glands form as an elaboration of larval SG duct bud remnants that persist beyond early pupal SG histolysis, the larval SG is an ideal target for interventions that limit disease transmission. Understanding larval SG development can help develop a better understanding of its morphology and functional adaptations and aid in the assessment of new interventions that target this organ. This video protocol demonstrates an efficient technique for isolating, fixing, and staining larval SGs from Anopheles gambiae mosquitoes. Glands dissected from larvae in a 25% ethanol solution are fixed in a methanol-glacial acetic acid mixture, followed by a cold acetone wash. After a few rinses in phosphate-buffered saline (PBS), SGs can be stained with a broad array of marker dyes and/or antisera against SG-expressed proteins. This method for larval SG isolation could also be used to collect tissue for in situ hybridization analysis, other transcriptomic applications, and proteomic studies.

Dissection and Immunostaining of Larval Salivary Glands from Anopheles gambiae Mosquitoes

The adult mosquito salivary gland (SG) is required for the transmission of all mosquito-borne pathogens to their human hosts, including viruses and parasites. This video demonstrates efficient isolation of the SGs from the larval (L4) stage Anopheles gambiae mosquitoes and preparation of the L4 SGs for further analysis.

Dissektion und Immunfärbung von Larven-Speicheldrüsen von Anopheles gambiae Mücken

Mosquito salivary glands (SGs) are a requisite gateway organ for the transmission of insect-borne pathogens. Disease-causing agents, including viruses and ...

Mikrodissektion von Black Widow Spider Silk-produzierenden Drüsen

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Synthetische Spinnenseide Produktion im Labormaßstab

Ernte Venom Giftstoffe aus Assassin Bugs und andere Heteropteran Insekten

Messung der Schlunddrüsen Drüse Acinus Größe in Honigbiene (Apis Mellifera) Arbeitnehmer

Analyse Murine Schwann Zell Entwicklung entlang wachsenden Axone

Vorbereitung der murinen mandibulären Speicheldrüse aufrecht Intravitalen Mikroskopie

Intravitalmikroskopie zur Imaging subzellulärer Strukturen in lebenden Mäusen Ausdruck Fluoreszierende Proteine

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Extraktion von Venom und Giftdrüse Mikrodissektionen von Spiders für Proteomik und transkriptomischen Analysen

Isolierung von intakt, ganze Maus Milchdrüsen zur Analyse der extrazellulären Matrix Ausdruck und Drüse Morphologie

Dissektion und Immunfärbung von Larven-Speicheldrüsen von Anopheles gambiae Mücken