Mit diesem Protokoll kann Deuteriumoxid oder D2O, ein nicht radioaktives, stabiles Wasserisotopen, verwendet werden, um die Körperzusammensetzung und den Wasserverbrauch zu schätzen. Diese Technik ist nicht invasiv und kann daher zur Beurteilung der Körperzusammensetzung bei gefährdeten Arten sowie bei Menschen und Hausarten eingesetzt werden. Eine einzigartige Anwendung der Deuteriumoxid-Verdünnungstechnik ist die Fähigkeit, den Wasserverbrauch frei laufenden Wildtieren mit hohen Rückfangraten oder von sozial untergebrachten Tieren zu messen.
Während Anästhesie nicht erforderlich ist, kann es für diejenigen, die nicht mit subkutanen Injektionen vertraut sind, einfacher sein, die Tiere zu beruhigen, bevor sie das Deuteriumoxid liefern. Das Verfahren mit Sarah Hooper und mir demonstrieren Amanda Eshelman und Ashley Cowan, Veterinärstudenten, und Alicia Roistacher, eine Studentin aus meinem Labor. Um eine 50-Milliliter-Stammlösung von neun Gramm pro Liter salinated Deuteriumoxid zu machen, wiegen Sie zuerst 450 Milligramm Natriumchlorid in pharmazeutischer Qualität und notieren die genaue Menge auf vier Dezimalstellen.
Das gesamte Salz in ein sterilisiertes 100-Milliliter-Becherglas geben und 50 Gramm mehr als oder gleich 99,8% Deuteriumoxid in einem sterilen, abgestuften Zylinder messen. Erfassen Sie die genaue Menge an Deuteriumoxid auf vier Dezimalstellen, und übertragen Sie das Deuteriumoxid auf das sterile Becherglas von Natriumchlorid. Als nächstes befestigen Sie eine 20-Spur-Nadel an einem nichtpyrogenen, sterilen Scheibenfilter mit Submikronporen, die mit einem 10-Milliliter-Spritzenfass ausgestattet sind, und legen Sie die Nadel in das Septum einer sterilen, leeren 100-Milliliter-Durchstechflasche ein.
Befestigen Sie ein Vakuumrohr an einer 22-Spur-Nadel, und legen Sie die Nadel in das Septum der 100-Milliliter-Durchstechflasche ein. Dann 10 Milliliter isosmotischestärke Natriumchlorid in den Spritzenlauf laden und langsam das Vakuum einschalten, bis die Deuteriumoxidlösung beginnt, langsam in die Durchstechflasche zu filtern. Gießen Sie die Deuteriumoxid-Lagerlösung weiter in den Spritzenlauf, bis das gesamte 50-Milliliter-Volumen gefiltert ist.
Nachdem Sie eine fehlende Reaktion auf Zehenstiche in einer anästhesierten Fledermaus bestätigt haben, verwenden Sie ein Alkohol-Prep-Pad, um das Uropatagium über der zwischenmenschlichen Vene zu reinigen, und lassen Sie die desinfizierte Schwanzmembran trocknen. Tragen Sie eine dünne Schicht Petroleumgelee über die zwischenmenschliche Vene auf und verwenden Sie eine 29-Spur-Nadel, um den dorsalen Teil der interfemoralen Vene zu durchstechen. Verwenden Sie dann Kunststoff-Natriumheparin Kapillarrohre, um 100 Mikroliter Blut zu sammeln.
Um eine ausreichende Vermischung des Vollblutes mit dem Natriumheparin zu gewährleisten, rollen Sie jede Tube nach der Blutentnahme vor der Etikettierung vorsichtig. Nach der Bestimmung der Masse des Deuteriumoxids in Gramm zu injizieren, laden Sie eine Insulinspritze mit einer 29-Spur-Nadel mit dem entsprechenden Volumen von Deuteriumoxid ausgestattet. Wiegen Sie die mit Deuterium beladene Insulinspritze und -nadel, indem Sie das Gewicht auf vier Dezimalstellen aufzeichnen, und injizieren Sie das gesamte Volumen von Deuteriumoxid subkutan über den dorsalen Hüftbereich der anästhesierten Fledermaus.
Wir empfehlen, eine Präzisionsskala mit einem antistatischen Zugschild zu verwenden und sicherzustellen, dass er sich vor der Injektion am Kolben zurückzieht, um einen Unterdruck zu gewährleisten. Wägen Sie unmittelbar nach der Injektion die nun leere Insulinspritze und -nadel ab und notieren Sie das Gewicht auf vier Dezimalstellen. Verwenden Sie innerhalb von 30 Minuten nach der Blutentnahme eine Hämatokritzentrifuge, um jedes Kapillarrohr fünf Minuten lang bei 10.000 mal g zu drehen.
Schneiden Sie mit einer scharfen Schere das Kunststoffkapillarrohr zwischen Vollblut und Plasma und verwenden Sie eine 200-Mikroliter-Pipette, um das Plasma direkt in ein markiertes 500-Mikroliter-Speicherrohr zu vertreiben. Sammeln und lagern Sie nach der Ausgleichsperiode weitere 100 Mikroliter Blut aus der interfemoralen Vene, wie gerade gezeigt. Für die FTIR-Spektrophotometrie-Analyse stellen Sie die Temperatur eines Sandbades auf 60 Grad Celsius ein, um die Destillation zu erleichtern, und fügen Sie 50 Mikroliter jeder Plasmaprobe und Standard in einzelne 1,5-Milliliter-konische Mikrozentrifugenkappen ein.
Halten Sie die Mikrozentrifugenkappe auf den Kopf, schrauben Sie das 1,5-Milliliter-Konikonltorialrohr auf die Kappe und setzen Sie das invertierte Rohr mindestens 12 Stunden lang mit dem Sand im Sandbad in Kontakt. Legen Sie am nächsten Morgen eine neue, saubere Kappe auf jedes Rohr und pulsieren Sie die Mikrozentrifugenrohre für 10 Sekunden in einer Mikrozentrifuge. Installieren Sie eine flüssige Übertragungszelle in das FTIR-Spektrometer und füllen Sie die Zelle mit Methanol.
Schließen Sie den Injektionsanschluss an und füllen Sie die Zelle langsam mit Hintergrundwasser, während Sie die Methanolspritze vorsichtig entfernen, um das Risiko von Luftblasen zu reduzieren. Schließen Sie Schläuche an den Ausgangsanschluss an, um die Entfernung der Proben nach der Analyse zu ermöglichen, und öffnen Sie die FTIR-Spektrometersoftware. Legen Sie die Parameter entsprechend der Tabelle fest, und sammeln Sie eine Hintergrundprobe mit dem Verdünnungsmittel, 0,22-Mikrometer-gefiltertem, destilliertem Wasser.
Injizieren Sie 40 Mikroliter eines Null-Teile-Pro-Millionen-Deuteriumoxid-Standards, und erfassen und speichern Sie die Spektren als durch Kommas getrennte Wertedatei. Nach dem Einspritzen und Speichern der Spektren aller Standards, um eine Standardkurve zu erstellen, injizieren Sie 40 Mikroliter jeder destillierten Probe in die flüssige Übertragungszelle und speichern Sie die Spektren. Mit einer bekannten Ausgleichszeit können das gesamte Körperwasser, die schlanke Körpermasse und die Körperfettmasse für wild gefangene große braune Fledermäuse und gefangene große braune Fledermäuse bestimmt werden.
Eine negative Körperfettmasse kann aufgrund eines oder mehrerer der folgenden Gründe berechnet werden: nicht die gesamte Dosis von Deuteriumoxid erhalten, während der Gleichgewichtsphase torpid werden, ungewöhnlich große Fettmassen und minimale magere Massen haben oder weniger als drei bis 5% Körperfett haben, wie durch duale Röntgenabsorptiometrie bestimmt. Hierwird wird ein repräsentativer Anteil an Körperfett gezeigt, der durch die Deuteriumoxid-Verdünnungstechnik im Vergleich zur dualen Röntgenabsorptiometrie bestimmt wird. Die beiden Techniken sind gut korreliert, mit der Körperfettmasse zeigt starke Korrelationen zwischen dem Körperfett und Körpergewicht und mit der Deuterium Oxid Verdünnung Technik nicht konsequent über oder unterschätzen die Körperfettmasse.
Die Deuteriumoxid-Verdünnungsmethode wurde zuvor bei Katzen validiert, und die Technik wurde angepasst, um die Messung des täglichen Wasserverbrauchs von sozial untergebrachten Katzen während jedes Ernährungsblocks des Experiments zu ermöglichen. Denken Sie daran, dass diese Technik nur an gesunden Tieren durchgeführt werden sollte und dass Sie genau wiegen, aufzeichnen und die volle Dosis Deuteriumoxid an jedes Tier liefern sollten. Zur Validierung der Deuteriumoxid-Technik kann eine sekundäre Methode zur Bestimmung der Körperzusammensetzung, wie z. B. eine vollständige Schlachtkörperanalyse oder DEXA, abgeschlossen werden.
Diese Technik ermöglichte es uns, eine sozial untergebrachte Katze zu identifizieren, die ungewöhnlich hohe Mengen Wasser verbrauchte, ohne jede Katze zu trennen, um ihren Wasserverbrauch zu messen.
