Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Energie zu beantworten, wie mitochondriale Gesundheit, energetische Effizienz und Energieverbrauch. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass der Sauerstoffverbrauch isolierter Mitochondrien direkt gemessen wird. Die Ergebnisse müssen nicht für andere intrazelluläre Stoffwechselprozesse korrigiert werden.
Wir haben uns zunächst für diese Methode bei Milchvieh entschieden, als wir untersuchen wollten, wie sich die mitochondriale Effizienz auf die Futtereffizienz auswirkt. Die Videodemonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte in der mitochondrialen Isolation schwer zu erlernen sind, da sie konsistent und präzise sein müssen. So bald wie möglich, nachdem die Leberprobe aus der Kuh entfernt wird, waschen Sie die Probe in Mitochondrien Isolationsmedien, um die roten Blutkörperchen zu entfernen.
Mit der Schere zerkleinern Sie das Gewebe fein in einen gekühlten Becher, der genügend Isolationsmedien enthält, um das Gewebe feucht zu halten. Übertragen Sie die gehackte Leber in eine 30-Milliliter-Glasfläschchen mit Mitochondrien-Isolationsmedien. Fügen Sie einen Teflon-Pestle hinzu, der eine Clearance von 0,16 Millimetern hat und in Eis inkubiert wurde und die Leberprobe bei 500 U/min für eine Minute mit vier Schlägen pro Minute homogenisiert.
Danach das Homogenat in eine Röhre mit Mitochondrien-Isolationsmedien übertragen und in ein eisverpacktes Becherglas geben. Zentrifuge homogenisieren bei 500 mal G und vier Grad Celsius für 10 Minuten. Das Pellet entsorgen und den Überstand in ein gekühltes Zentrifugenrohr geben.
Zentrifugieren Sie den resultierenden Überstand bei 10.000 mal G und vier Grad Celsius für 10 Minuten, um das mitochondriale Pellet zu erhalten. Das Pellet in 10 Millilitern Mitochondrien-Isolationsmedien mit fettsäurefreiem BSA wieder aufhängen und waschen. Dann Zentrifuge bei 8, 100 mal G und vier Grad Celsius für 10 Minuten.
Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 200 Mikroliter Isolationsmedien wieder aus. Legen Sie diese auf Eis, bis sie für den Sauerstoffverbrauch und die kinetischen Protonenlecks-Assays einsatzbereit sind. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration der Pelletsuspension mit einem Bicinchoninsäure-Kit gemäß Herstelleranleitung unter Verwendung von BSA als Standard.
Erstellen Sie zunächst Sauerstoffverbrauchsmedien, wie im Textprotokoll beschrieben. Inkubieren Sie die Sauerstoffverbrauchsmedien bei 30 Grad Celsius. Als nächstes richten Sie die Atemkammer, Pumpe und Sauerstoffelektrode für das Oxygraphensystem gemäß den Anweisungen des Herstellers ein.
Dann legen Sie einen Milliliter Sauerstoffverbrauchsmedien in die Beatmungskammer. Dann 0,35 Milligramm mitochondriales Protein in die Kammer geben. Rühren Sie kräftig, um sicherzustellen, dass die Lösung mit Luft gesättigt wird und eine Temperatur von 30 Grad Celsius aufrecht erhalten.
Erfassen Sie den Sauerstoffverbrauch für etwa fünf Minuten. Wenn der Sauerstoffverbrauch durch eine abnehmende gerade Linie konstant wird, notieren Sie dies als den Basissauerstoffverbrauch. Fügen Sie 1,25 Mikroliter einer Vier-Millimolar-Roton-Lösung hinzu, um komplexe zu hemmen, und fügen Sie dann fünf Mikroliter einer Molaren-Succinat-Lösung hinzu, um eine endgültige Konzentration von fünf Millimolaren succinat in der Atemkammer zu erreichen.
Dies ist Zustand IV Sauerstoffverbrauch. Danach einen Mikroliter einer 100-Millimolar-ADP-Lösung hinzufügen, um eine Endkonzentration von 100 Mikromolaren in der Atmungskammer zu erreichen. Der Sauerstoffverbrauch sinkt für etwa fünf Minuten und wird dann zu einer geraden Linie.
Zeichnen Sie diesen Sauerstoffverbrauch als Atmung des Zustands III auf. Berechnen Sie das Atemregelverhältnis, wie im Textprotokoll beschrieben. Dann alle Lösungen aus der Atmungskammer heraussaugen.
Spülen Sie die Kammer mehrmals mit doppelt entionisiertem Wasser. Zuerst bereiten Sie eine Lösung von 80 Nanogramm pro Milliliter Nigericin in Ethanol vor, die die Menge an Ethanol begrenzt, die weniger als einem Mikroliter zugesetzt wird. Bereiten Sie auch eine Lösung von acht Mikrogramm pro Milliliter Oligomycin in Ethanol vor.
Nach gründlicher Spülung der Kammer mit doppelt entionisiertem Wasser einen Milliliter des Sauerstoffverbrauchsmediums in die Beatmungskammer geben und mit einem magnetischen Rührstab kräftig umrühren. 0,35 Milligramm mitochondriales Protein in die Atmungskammer geben. Fügen Sie dem Kammeraufbau eine Methyltriphenylphosphonium-empfindliche Elektrode hinzu, um sicherzustellen, dass das andere Ende ordnungsgemäß mit einem pH-Messgerät verbunden ist.
Fügen Sie 1,25 Mikroliter einer Vier-Millimolar-Roton-Lösung hinzu, um Complex I zu hemmen. Zeichnen Sie den Sauerstoffverbrauchswert auf, wenn er konstant wird. Als nächstes fügen Sie 0,56 Mikroliter einer Oligomycin-Lösung hinzu, um die ADP-Nutzung zu hemmen.
Nehmen Sie die Atmung für etwa zwei bis fünf Minuten auf. Zeichnen Sie den Sauerstoffverbrauchswert auf, wenn er konstant wird. Fügen Sie dann 0,112 Mikroliter einer 80 Nanogramm pro Milliliter Nigericin-Lösung hinzu, um den pH-Gradienten über die mitochondriale innere Membran abzuschaffen.
Zeichnen Sie die Atmung für zwei bis fünf Minuten auf und notieren Sie den Sauerstoffverbrauchswert, wenn er konstant wird. Fügen Sie der mitochondrialen Inkubation fünf Mikroliter der 10 Millimolaren Methyltriphenylphosphonium-Lösung hinzu, um mit der Vorbereitung einer Standardkurve zu beginnen. Wiederholen Sie diese Zugabe vier zusätzliche Male bis zu einer Gesamtkonzentration von 2,5.
Micromolar wurde hinzugefügt. Danach fünf Mikroliter einer Molaren-Succinatlösung in die Kammer geben, um die Atmung zu initiieren. Zeichnen Sie die Atmung auf, bis eine stabile Spur erreicht ist.
Fügen Sie dann Malonat eitern hinzu, um das System wie im Textprotokoll beschrieben zu titerieren. In dieser Studie werden RCR- und Protonenleckskinein7 tagenach der Fütterung der Milchkühe mit unterschiedlichen Mengen an Kupfer, Zink und Mangan 70 Tage lang in der Milch von Holsteiner Milchkühen gemessen. Die Atmung des Bundesstaates IV ist bei Kühen mit niedrigem Mangangehalt am höchsten, ist aber bei den Kontrollkühen am niedrigsten, was darauf hindeutet, dass Mangan eine wichtige Rolle bei der Minimierung der durch Protonenlecks abhängigen Atmung spielt.
Die Analyse der durch Hepatenprotonenabhängigen Atmung zeigt, dass diese Atmung bei Kühen, die mit niedrigem Mangan behandelt werden, am größten ist und die am wenigsten kontrollierten Kühe. Diese Ergebnisse bestätigen, dass die niedrige Mangangruppe die größte Atmung des Zustands IV hat, während die Kontrollgruppe die niedrigste hat. Während die Futtereffizienz bei Angus-Ochsen, die von niedrigen RFI-Bullen geboren wurden, höher ist als bei hohen RFI-Bullen, spiegelte sich dies nicht in der mitochondrialen RCR oder der Protonenleckkinetik wider.
Während der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, alle Fläschchen und Becher auf Eis zu halten, während der Verarbeitung der Mitochondrien. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Milchernährung, um die Rolle der Mitochondrien-Effizienz bei der Futtereffizienz und mitochondrialen Funktion in der Leber zu erforschen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Rotenon gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen, Augenschutz und richtige PSA sollten immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden.
