Diese Forschung wurde von den NIH Zuschüsse (PN2EY016525 und P41GM103832) unterstützt. SHS wurde von einem Stipendium der Nanobiologie interdisziplinäre Graduate Training Program des WM Keck Zentrum für interdisziplinäre Bioscience Ausbildung von der Golfküste Konsortien (NIH Grant No T32EB009379) unterstützt. SHS seziert, wuchs und Stein DRG und Hippocampus-Zellen; gesammelt Kryo-EM-und Kryo-ET Daten der DRG und Hippocampus Axone, rekonstruiert und Farb kommentierte den Neigungs Serie. MRG seziert und bereitgestellt Hippocampus-Zellen in MNR Labor. SC in Kippserie Annotation unterstützt. SHS wurde von CW auf, wie man zu sezieren und zu wachsen Neuronen trainiert. SHS, WCM und WC konzipiert die Experimente. SHS bereit, das Manuskript mit dem Input von anderen Autoren. Dieses Video wurde am Center for Cellular Imaging und Nanoanalytik (C-CINA) des Biozentrum t gefilmter Universität Basel. C-CINA in der Abteilung für Biosysteme (D-BSSE) der ETH Zürich, in Basel, in der Schweiz integriert.

1. Zubereitung der Speisen mit EM Grids für Überzug primären Neuronen <ol><li> Überprüfen Sie die Integrität der löchrigen Kohlenstoff auf den Gold-EM-Gitter mit einem Lichtmikroskop bei einer Vergrößerung von mindestens 25X. Stellen Sie sicher, Kohlenstoff Löcher sind&gt; 98% intakt. </li><li> Für Beschichtung primären Neuronen, verwenden Sie einen Bunsenbrenner flamm sterilisieren EM-Gitter und gleichzeitig machen sie hydrophil. Pinzette zu holen die EM Gitter am Rand, nicht das zentrale Gitterbereich. ACHTUNG: Lassen Sie eine brenn Bunsenbrenner unbeaufsichtigt und nicht Handschuhen oder Pinzette mit Kunststoff-Komponenten während der Durchführung dieser Schritte aus: <ol><li> Vor dem Anzünden des Bunsenbrenners, stellen Sie die Luft-und Gas Anpassungen minimal offene Position. </li><li> Zünden Sie die Bunsenbrenner mit einem Stürmer Feuerstein oder Gasfeuerzeug. </li><li> Ändern Sie die Luft-und Gas Anpassungen, um eine kleine, blau innere Flamme in einem größeren, helleren blauen / violetten Flamme zu erreichen. Die Spitze der inneren Flamme ist der heißeste Teil der Flamme. Der Knopf unterunterhalb der Brenner stellt die Menge des Gases, das in das Brennerrohr, während das Rohr des Brenners geschwenkt werden, um die Menge an Luft, die in den Brenner anzupassen. Durch Drehen des Lufteinstellung im Uhrzeigersinn verringert die Luft (was in einer lila Flamme) und gegen den Uhrzeigersinn erhöht die Luft (was eine gelbe Flamme). </li><li> Mit Pinzette aus Metall (keine Kunststoffteile), um die EM Netz halten, geben sie schnell durch die Flamme zweimal, mit Blick auf Kohlenstoff-Seite nach oben. Die Kohlenstoff-Seiten wird matter (weniger glänzend) sind und mit einer gräulichen Farbton als die andere Seite. </li><li> Das Raster (Kohlenstoff-Seite nach oben) sofort in die Mitte des Glasbodenschale innerhalb von 10 cm des Bunsenbrenners gebracht übertragen. Verwenden Sie eine EM Gitter pro Schale (Abbildung 1). Verwenden Sie nur Glasboden Gerichte, die vorsterilisierten werden, dh über Gamma-Bestrahlung. </li></ol></li><li> Verwenden Sie ein Lichtmikroskop, um das Raster Integrität (Kohlenstoff Löcher intakt), während er weiterhin den EM Gitter im Inneren des Glas bott überprüfenom Schüssel (um eine Kontamination zu vermeiden). Bei der Anwendung jeder Stoff auf dem Gitter oder etwas, das in Kontakt mit den Neuronen kommen wird, sterile Verfahren und sterile Pipettenspitzen. </li><li> In einer Gewebekultur Kapuze mit sterilen Verfahren gelten 250 ul des geeigneten Beschichtungssubstanz langsam und vorsichtig an die zentrale Glasfläche der Petrischale. Stellen Sie sicher, dass der geeigneten Beschichtungssubstanz umfasst die gesamte EM-Raster. <ol><li> Für hippocampale Neuronen verwenden, Poly-L-Lysin (PLL, 1 mg / ml) als Beschichtungsstoff, hergestellt wie zuvor beschrieben 19. Beachten Sie, dass 250 ul pro EM Gitter benötigt, pro Schale, so skaliert die Batch entsprechend. Für Hinterwurzelganglien (DRG) Neuronen, verwenden Sie eine gallertartige Proteinmischung von Engelbreth-Holm-Swarm (EHS)-Maus-Sarkom-Zellen sezerniert (siehe Tabelle der Materialien und Reagenzien) als Beschichtungsstoff, bereiten Sie wie folgt. Beachten Sie, dass 250 ul pro EM Gitter benötigt, pro Schale, so skaliert die Batch entsprechend. <ol><li> Tauen Sie eine Vorratsflascheder gallertartige Proteinmischung von Engelbreth-Holm-Swarm (EHS)-Maus-Sarkom-Zellen bei 4 ° C über Nacht abgesondert </li><li> Halten Sie die kalte gallertartige Proteinmischung von Engelbreth-Holm-Swarm (EHS)-Maus-Sarkom-Zellen und alle verwendet, um die Lösung zu Komponenten, dh, indem man sie auf Eis ausgeschieden wird. </li><li> Während auf Eis, verdünnt diese gelatineartigen Protein-Mischung in Neurobasal Medium, um eine Verdünnung von 1:20 zu ergeben (dh verdünnte 500 ul des gelartigen Proteinmischung in 10 ml Neurobasalmedium). </li><li> Teilen verdünnt gallertartige Proteingemisch in 1 ml Aliquots, und keine zusätzlichen Aliquots bei -20 ° C sofort speichern </li><li> Bewerben 250 ul pro EM Raster, pro Gericht, wie in Abschnitt 1.4 beschrieben. </li></ol></li></ol></li><li> Decken Sie die Petrischale mit seiner Ober-und inkubieren (entweder mit PLL zur Hippocampus-Proben, OR mit der gallertartige Proteinmischung für DRG-Proben) für 1 h bei Raumtemperatur in der Gewebekultur Kapuze. </li><li> Aspibewerten alle PLL (für Hippocampus-Proben) oder die gallertartige Proteingemisch (DRG für Proben) von den Gerichten. Um dies zu tun, verwenden Sie das Vakuumsystem in der Gewebekultur Kapuze. Verwenden Sie eine sterile Pipettenspitze in die Vakuumröhre angebracht. Vermeiden Sie direkten Kontakt mit dem EM-Raster. </li><li> Verwenden einen einstellbaren Luftverdrängungspipette zu 250 ul sterilem PBS (Phosphat-gepufferte Salzlösung) sorgfältig gelten für die EM Gitter in dem mittleren Bereich jeder Glaspetrischale, so dass der EM Gitter vollständig von PBS behandelt. Dann saugen Sie den PBS aus jedem Gericht. 3x wiederholen. </li><li> Lassen Sie die Gerichte, die mit EM-Gitter unter der Gewebekultur Haube für 15 Minuten trocknen. Achten Sie darauf, sie durch die Kontrolle unter dem Lichtmikroskop in der Gewebekulturraum vollständig trocken sind. Stellen Sie sicher, es gibt keine Blasen an Feuchtigkeit in der Startaufstellung. Wenn ja, sorgfältig absaugen neben dem EM-Raster, um diese zusätzliche Feuchtigkeit zu beseitigen. Die beschichtete Gitter sollte sofort für die Plattierung der Neuronen verwendet werden. </li></ol> 2. Vorbereitung und PlAting Primäre Neuronen auf EM-Grids <ol><li> Um primäre Neuronen ersten sezieren, trypsinize (mit 2,5% Trypsin) und verreiben, um die Platte hippocampi (oder Hinterwurzelganglien von 18 Tage alten Rattenembryonen) in einzelne Zellen zu distanzieren, wie zuvor beschrieben 19. <ol><li> Man reibt ist ein gebräuchlicher Begriff von Neurobiologen zur distanziert Klumpen von Zellen in einzelne Zellen zu beschreiben, vor allem durch die Verwendung einer Glaspipette mit einer feuerpolierten Spitze. Das Ergebnis wird durch vorsichtig und langsam Ziehen und Lösen der Zellen, oben und unten, mehrere Male (~ 30) durch die Pipette erreicht. </li></ol></li><li> Befolgen Sie die Anweisungen, wie zuvor für DRG-Dissektion und Zellisolierung 24 beschrieben, unter Hinweis auf 0,25% Trypsin (in HBSS) verwenden, um die Ratten-DRG-Neuronen isolieren, verwenden, anstatt die Enzyme vorgeschlagen (Papain, Kollagenase / Dispase), die besser geeignet sind für Maus DRG-Neuronen. </li><li> Berechnen Sie die Anzahl der isolierten Neuronen (dh mit einer Zählkammer)und diesen Wert um das entsprechende Volumen der Zellen zu berechnen, die jedem Gericht beantragen, um eine Konzentration von 50.000 Zellen / ml pro Schale zu erreichen. Die maximale Lautstärke anzuwenden ist 250 ul. Beachten Sie, dass dies nur füllt den zentralen Glasfläche nicht die gesamte Schale. </li><li> Geschirr für 30 Minuten in einem CO 2-Inkubator bei 37 ° C. Lassen Zellen sich zu erholen und zu halten. </li><li> Langsam zu jedem Gericht hinzufügen 1,5 ml erwärmt Medien, kümmert sich nicht um die EM-Netz stören. Die Art der Medien hängt vom Zelltyp (Hippocampus-oder DRG). <ol><li> Die geeignete Medien für entweder 19 oder Hippokampus-Neuronen Hinterwurzelganglienneuronen 24, die in einem 37 ° C Wasserbad vor der Verwendung erwärmt werden. Das Geschirr über Nacht inkubieren im CO 2-Inkubator. </li><li> Für Hippocampus-Neuronen, verändern die Medien am nächsten Tag. Ändern der Hälfte der Medien alle zwei Tage weiter für 14 Tage. Wärmen Sie die Medien in einem 37 ° C Wasserbad vor der Verwendung. </li&gt; <li> Für DRG-Neuronen, dem Tag nach Dissektion / Beschichtung, eine frische Bestand an Medien mit einer anti-mitotische Mittel (Uridin und 5&#39;-Fluoro-2&#39;-desoxyuridin) einen 10 mM Stammlösung von jeweils getrennt, verwenden Sie eine endgültige Konzentration von 10 &amp;mgr; M für jeden. Entfernen Sie die Hälfte des DRG-Medien (875 ul) und fügen Sie 875 ml frisches Medium mit der anti-mitotische Mittel. <ol><li> Für DRG-Neuronen, alle zwei Tage für die erste Woche, alternative verändernden Medien zwischen anti-mitotische Medien-und Standard-DRG-Medien. Für die zweite Woche, ändern Sie Standard-DRG-Medien alle zwei Tage. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Verglasen von Neuronen auf EM-Grids <ol><li> Bereiten Sie alle Geräte und Materialien für das Einfrieren und Lagern der Gold EM-Gitter bei tiefen Temperaturen: eine Verglasung Gerät mit einer feuchten Kammer 17, feinen Punktfach Pinzette zur Verglasung Maschine, lange flache Punkt Pinzette, Dewar (n) von flüssigem Stickstoff (LN 2) coolant Behälter, EM Grid-Storage-Box, Calcium-freier Filterpapier. </li><li> Starten Sie die Verglasungseinrichtung. Stellen Sie die Luftfeuchtigkeit bis 100% und die Temperatur auf 32 ° C. In dem Abschnitt &quot;Console&quot;, stellen Sie die Zeit auf Null Blot Sekunden. Dies ermöglicht die manuelle Lösch durch die Seitenfenster des Feuchtekammer der Verglasung Maschine. </li><li> Gehen Sie mit dem kalziumfreien Filterpapier mit Handschuhen, Schichtung, so dass sie drei Papiere gestapelt sind. Schneiden Sie den Stapel in 0,5 cm breite Streifen, die ~ 2 cm lang sind. Biegen sie in einem 90 ° Winkel, so daß eine Seite des Papiers eine 0,5 cm x 0,5 cm Fläche (Fig. 2). Mit einer Pinzette aus der Mitte Papier und legen Sie es auf einem anderen kalziumfreies Filterpapier bis zum Gebrauch. </li><li> Setzen Sie den Grid-Storage-Button in der Knopfhalter in der Kammer der Verglasung. Füllen Sie den Innenraum des Kühlmittelbehälter mit flüssigem Stickstoff und warten, bis eine vollständige Verdampfung. Füllen Sie den äußeren Kammer the Kühlmittelbehälter mit flüssigem Stickstoff, bis stabile Temperatur erreicht man zum nächsten Schritt. Füllen Sie den Innenraum mit hochreinem gasförmigen Ethan, die in einen flüssigen Zustand in der gekühlten Kammer kondensiert wird. </li><li> Bewegen Sie den Teller (es) aus dem Inkubator zu einem großen 100 mm Polystyrolschale für den Transport zum Verglasen Raum, wenn nicht in der unmittelbaren Umgebung. Mit den spezialisierten Verglasung Pinzette sorgfältig wählen Sie die EM Gitter aus der Schüssel. Beachten welche Seite die Neuronen auf der EM Gitter wächst, wird die Position für den nächsten Schritt wichtig. Verwenden Sie den schwarzen Schiebe-Sperre auf die Pinzette, um sicher zu verriegeln der Pinzette auf die EM-Raster. </li><li> Legen Sie die Pinzette in den Verglasungs Maschine so daß die Seite des EM-Gitter, auf dem die Neuronen auf der linken Seite angeklebt Flächen weg von der Seitenlochöffnung des Verglasungs Maschine. Fahren Sie die Fach Pinzette in den Verglasungs Maschine. </li><li> Setzen Sie den Kühlmittelbehälter in der entsprechenden InhaberVerglasung der Maschine. Es sollte mit angemessenen LN 2 und flüssigem Ethan gefüllt werden. Mit dem entsprechenden Bildschirm Kommando der Verglasung Maschine, heben Sie den Kühlmittelraum nach oben, bis es mit der Unterseite der Feuchtigkeitskammer gespült. </li><li> Mit den flachen Pinzette Punkt, fassen einen Rand des Filterpapiers, so dass die kürzere Seite (die 0,5 cm x 0,5 cm Fläche) senkrecht zu den Pinzetten ist. Diese Fläche wird für Lösch (2B) in direkten Kontakt mit dem EM-Gitter kommen. Das Filterpapier vorsichtig in die Seitenöffnung des Feuchtekammer der Verglasung Maschine (Abbildung 2A). Stabil halten das Papier gegen die EM Gitter (der abgewandten Seite der Probe) für 10 Sekunden. Entsorgen Sie das Papier danach stürzen und sofort einfrieren die Probe in flüssigem Ethan mit der Automatisierung der Verglasung Maschine. </li><li> Ihre tiefgefrorenen EM Netz transferieren Sie einen der Schlitze in einer derGrid-Storage-Tasten. Wiederholen Sie den Vorgang für weitere EM-Gitter in den Gerichten. Die EM Grid-Storage-Tasten in diesen Experimenten verwendet mehrere tiefgefrorenen EM-Gitter zu speichern. </li></ol> 4. Bildsammlung, Verarbeitung und Annotation <ol><li> Fahren Sie mit 2-D-elektronenmikroskopischen Aufnahmen und / oder 3-D-Neige Serie 5 der Neuriten mit einem Kryo-Elektronenmikroskop unter einer Niedrigdosis-Zustand zu sammeln. Die 2-D-Bilder wurden bestimmt, um die Qualität des Netzes in Bezug auf die Dicke des Eises und die möglichen Bereichen zu beurteilen nützlich für die 3-D-Tilt-Serie zu sein. <ol><li> In diesem Fall wurden alle Bilder gesammelt unter Verwendung eines 4k x 4k CCD-Kamera mit einem 200 kV-Elektronen-Mikroskop mit einem einzigen Neigungs flüssigem Stickstoff Kryo Transferhalter ausgestattet angebracht, bei 20k Mikroskopvergrößerung zu einem Zielunterfokus von 7 um und Probenahme von 4,4 Å / Pixel. </li><li> Um ein 3D-Schnittbild der Probe zu erhalten, nehmen Sie eine Reihe von Projektionsbildern, während schrittweise Kippen der Proben alOng einer Achse des Transmissionselektronenmikroskop (TEM). Angesichts der Neigungswinkel und andere experimentelle Einstellungen, gibt es verschiedene Software zur Verfügung, um automatisch die Neigung zu sammeln Serie 5. Die 3-D Kippserie hier dargestellt wurden auf die gleiche Mikroskop mit halbautomatischen Kippserie Erfassungssoftware 26 über einen Bereich von -60 ° bis 60 ° in 5 °-Schritten mit einer Gesamtdosis von ca. 60 E / A 2 gesammelt. </li></ol></li><li> Rekonstruieren Sie den Neigungs Reihe der Neuriten mit Bildverarbeitungssoftware 21, wie zuvor für andere Proben 5,29 beschrieben. </li><li> Farbanno die 3-D-Merkmale der Neuriten durch Segmentieren des ersten Schichtbild und Erzeugen eines Oberflächenmodells unter Verwendung eines 3-D-Bildverarbeitungssoftware, wie zuvor beschrieben 5. </li></ol>

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Biol. 20, 95-111 (1964).</li><li>Raza, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+is+associated+with+elevated+intracellular+calcium+levels+and+altered+calcium+homeostatic+mechanisms+in+hippocampal+neurons.">Aging is associated with elevated intracellular calcium levels and altered calcium homeostatic mechanisms in hippocampal neurons.</a> Neurosci. Lett. 418, 77-81 (2007).</li><li>Scroggs, R. S., Fox, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+current+variation+between+acutely+isolated+adult+rat+dorsal+root+ganglion+neurons+of+different+size.">Calcium current variation between acutely isolated adult rat dorsal root ganglion neurons of different size.</a> J. Physiol. 445, 639-658 (1992).</li><li>Squire, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fundamental neuroscience. , (2003).</li><li>Sulzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+hit+hypotheses+for+dopamine+neuron+loss+in+Parkinson's+disease.">Multiple hit hypotheses for dopamine neuron loss in Parkinson's disease.</a> Trends Neurosci. 30, 244-250 (2007).</li><li>Tapia, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+expression+of+glycine+and+GABA(A)+receptors+in+developing+spinal+cord+neurons.+Effects+on+neurite+outgrowth.">Early expression of glycine and GABA(A) receptors in developing spinal cord neurons. Effects on neurite outgrowth.</a> Neuroscience. 108, 493-506 (2001).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Wir zeigen, dass embryonale Rattenneuronen (Hinterwurzelganglien und Hippocampus) auf Gold-Elektronenmikroskopie (EM) Gittern gewachsen und im Glaskörper Eis dünn genug für ihre Neuriten, die abgebildet werden unter Verwendung von 2-D-Kryo-EM-und 3-D-Kryo-eingefroren werden ET. Während Hippocampus Neuriten haben zuvor mit Kryo-ET 8,10,18,23 abgebildet wurde, detailliert ein Protokoll für die erfolgreiche Replikation genug mit im Handel erhältlichen Geräte gefehlt hat. Darüber hinaus, während ihre For...

Neuronen stellen die komplexe Schaltung für die Funktion des zentralen und peripheren Nervensystem durch die Ausarbeitung Dendriten und Axone, um Informationen, die oft recht lang, um mit nachgeschalteten Neuronen kommunizieren. Neuritenwachstum spielt eine fundamentale Rolle in der Embryonalentwicklung und neuronalen Differenzierung und Erhaltung von Neuriten kritisch unterstützt die Funktion des Nervensystems. Neuritische Prozesse verfügen kritisch in neuronalen Verletzungen und Regeneration sowie Erkrankungen des Nervensystems. Die Untersuchung der neuronalen Architektur ist entscheidend, sowohl die normalen und erkrankten Gehirn zu verstehen. Glücklicherweise gibt es physiologisch relevanten neuronalen Zellkultur-Systeme, dass komplexe und heterogene Zellstrukturen rekapitulieren kann. Auf der Grundlage der experimentellen Aufklärung der festen Plattformen effektive Visualisierung Strategien, die qualitativen und quantitativen Analysen der neuronalen Morphologie ermöglichen benötigt. Besonders nützlich wäreist eine detaillierte Methode, die eine einheitliche Plattform zur Visualisierung von Neuriten, beide Axonen und Dendriten im Nanometerbereich enthält. Traditionelle Elektronenmikroskopie erfordert die Verwendung von organischen Lösungsmittels während der Dehydratisierung und Harzeinbettung, die Verzerrungen in den Proben von ihrem wahren Zustand induzieren kann. So die Interpretation der Ergebnisse 4,9,25 Begrenzung - Bis heute sind die meisten strukturellen Charakterisierung auf der Nanometerskala auf größere Zellen oder Geweben, die zu solchen aggressiven Chemikalien ausgesetzt sind, basiert. Darüber hinaus für die Elektronenstrahldurch, Schnitte für Organismen oder Zell Vorsprünge aufweist eine Dicke von mehr als 1 um 12 erforderlich. Schließlich, geschnitten oder gefräst Gewebe Ergebnisse in der Sammlung von diskreten Scheibe spezifischen Datensätzen, so schwerfällig die Definition des Lang Funktion von Neuriten. Selbst für Kryo-EM, in der Schnitt eine tiefgefrorenen Probe möglich ist, stellt die Methode Kompression Artifwirkt ein. In den letzten Jahren haben die Forscher gelernt, wie Neuronen im Hippocampus direkt auf EM-Gitter und Flash-Einfrieren in flüssigem Ethan zu Neuriten mit Kryo-ET 8,10,18,23 anschließend visualisieren wachsen. Doch solche Studien entweder eine Sonderanfertigung 10,23 oder mangelnde Informationen über die Löschschritt zum Erzeugen dünn genug glasigen Eis für Routine-Visualisierung 8,18. Zum Beispiel empfiehlt eine Studie, die Verwendung von 30-40 sec für Abtupfen der EM Gitter 10, jedoch ist dieser Wert nicht für den allgemeinen Gebrauch optimiert, sondern ist spezifisch für diese maßgeschneiderte Tauchgefriergerät. Mit einer Sonderanfertigung, anstatt einen handelsüblichen 17 ein für die Aufrechterhaltung der Luftfeuchte vor stürzen Gefrieren der Probe kann eine Hürde für die weit verbreiteten Reproduzierbarkeit darstellen. Während diese Studien haben bei der Visualisierung von Neuriten Kryo-ET bahnbrech wurde, haben wir einen Schritt weiter, um die ap erkundenbarkeit der Kryo-ET zu einer Vielzahl von neuronalen Proben (hippocampalen und dorsalen Wurzelganglienneuronen). Darüber diskutieren wir beide optimale und suboptimale Ergebnisse sowie die möglichen Artefakte, die auftreten können mit einem Kryo-ET für solche Proben. Definieren einer detaillierten Technik für die Erhaltung und Visualisierung ganze Neuriten im Nanometerbereich in einer nahezu nativen Zustand würde die Fähigkeit für mehr Forscher zur Durchführung von ultrastrukturellen Studien zu verbessern. Zu diesem Zweck wird mit kommerziell erhältlichen Ausrüstung, um nicht fixierte, ungefärbten Neuronen vorzubereiten, zu visualisieren Neuriten beschreiben wir eine effektive und detaillierte Protokoll. Dies ist ein wichtiger erster Schritt zur Detaillierung der Ultrastruktur von gesunden Neuriten und den Grundstein für das Verständnis, was strukturelle Unterschiede im Nervensystem Modelle Krankheit vorliegen legen. Seit Kryo-ET kann nicht fixierten, ungefärbten Neuriten-Funktionen in 3-D auf der Nanometerskala zu beheben, wird das Verfahren machen es möglich, wie nieVordergrund zu neuritische Architektur 12 zu definieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="970">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Dumont #7 Tweezers</td>
			<td style="width:196px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:309px;">72803-01</td>
			<td style="width:171px;">For handling EM grids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek Corp.</td>
			<td>P35G-1.5-10C</td>
			<td>For growing sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electron microscopy grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Holey Carbon, Au 200, R 2/2</td>
			<td>For growing sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium-free filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1541-055</td>
			<td>For blotting sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Large flat point long tweezers</td>
			<td>Excelta Corporation</td>
			<td>E003-000590, 25-SA</td>
			<td>For blotting sample </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vitrification device and tweezers</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Vitrobot Mark III</td>
			<td>For freezing sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini grid storage boxes</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>160-40</td>
			<td>For storing EM grids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryo transfer holder</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>626 Single Tilt Liquid Nitrogen Cryo Transfer Holder</td>
			<td>For imaging samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Semi-automated tilt series acquisition software</td>
			<td>SerialEM</td>
			<td>http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/</td>
			<td>For imaging samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image processing software</td>
			<td>IMOD eTomo</td>
			<td>http://bio3d.colorado.edu/imod/</td>
			<td>For image processing</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Transmission electron microscope for cryoEM</td>
			<td>JEOL, Tokyo</td>
			<td>200-kV JEM2100 LaB6 electron microscope</td>
			<td>For imaging samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4k x 4k CCD camera</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For imaging samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-D annotation software</td>
			<td>Visage Imaging GmbH</td>
			<td>Amira/Avizo</td>
			<td>For processing 3-D data</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Software for digitally stitching 2-D images</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>Adobe Photoshop</td>
			<td>For processing 2-D data</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, High Glucose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965-118</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Boric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B-0252</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium tetraborate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B-9876</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-L-lysine </td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2636-500MG</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filter system</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430758</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B-27 supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant rat b-NGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>556-NG</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Uridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U3003-5G</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5&#39;-Fluoro-2&#39;-deoxyuridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0503-100MG</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356234</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of primary neurons for visualizing neurites in a frozen-hydrated state using cryo-electron tomography

Neuriten, beide Dendriten und Axone sind neuronale zelluläre Prozesse, die die Leitung der elektrischen Impulse zwischen den Neuronen zu ermöglichen. Festlegen der Struktur von Neuriten ist entscheidend für das Verständnis, wie diese Prozesse bewegen, Materialien und Signale, die synaptische Kommunikation unterstützen. Elektronenmikroskopie (EM) wurde traditionell verwendet, um die ultrastrukturelle Merkmale in Neuriten beurteilen, jedoch kann die Exposition gegenüber organischen Lösemittel während der Dehydratisierung und Harzeinbettungsstrukturen verzerren. Ein wichtiges Ziel ist die unerfüllte Formulierung von Verfahren, die für die strukturelle Auswertungen nicht durch solche Artefakte beeinflusst ermöglichen. Hier haben wir eine detaillierte und reproduzierbare Protokoll für wachsende und Schockgefrieren ganze Neuriten von verschiedenen primären Neuronen auf Elektronenmikroskopie Gitter gefolgt von deren Untersuchung mit Kryoelektronentomographie (Kryo-ET) eingerichtet. Diese Technik ermöglicht 3-D-Visualisierung von gefrorenen, hydratisierten Neuriten in Nanometer-Auflösung, die Erleichterung assessment ihrer morphologischen Unterschiede. Unser Protokoll liefert eine beispiellose Ansicht der Hinterwurzelganglien (DRG) Neuriten und eine Visualisierung des Hippocampus in der Nähe von Neuriten-nativen Zustand. Als solche sind diese Methoden schaffen ein Fundament für zukünftige Studien auf Neuriten der beiden normalen Neuronen und die von neurologischen Erkrankungen betroffen.

Vor dem Einfrieren und Bildgebung mittels Kryo-ET, sollte leicht Mikroskopbilder der EM-Gitter, auf dem die Neuronen wachsen genommen werden. Neuriten sollten deutlich sichtbar, ohne signifikante Überlappung miteinander sein. Eine farbige Box in 3A repräsentiert einen Bereich, der vergrößerten wird, um eine höhere Vergrößerung in 3B, in der Neuriten erstrecken sich über die Gitterwerk des Gitters zu zeigen. Jedes Gitter-Platz ist einer löchrigen Kohlenstoffschicht, die die Nerv...

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Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography

Neuronale Prozesse zur ultrastrukturellen Analyse zu erhalten, beschreiben wir ein Protokoll für die Beschichtung von primären Neuronen auf Elektronenmikroskopie Gitter gefolgt von einem Blitzgefrieren, wodurch Proben in einer Schicht von glasartigem Eis suspendiert. Diese Proben können mit einer Kryo-Elektronenmikroskop auf Strukturen im Nanometerbereich sichtbar zu prüfen.

Herstellung von primären Neuronen für die Visualisierung von Neuriten in einem tiefgefrorenen Zustand unter Verwendung von Kryo-Elektronentomographie

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the ...

preparation-primary-neurons-for-visualizing-neurites-frozen-hydrated

Research

JoVE Journal

Neuroscience

79.0K Aufrufe.  Baylor College of Medicine.  Neuronale Prozesse zur ultrastrukturellen Analyse zu erhalten, beschreiben wir ein Protokoll für die Beschichtung von primären Neuronen auf Elektronenmikroskopie Gitter gefolgt von einem Blitzgefrieren, wodurch Proben in einer Schicht von glasartigem Eis suspendiert. Diese Proben können mit einer Kryo-Elektronenmikroskop auf Strukturen im Nanometerbereich sichtbar zu prüfen. 

Serie: Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

Quantitative Analyse der synaptischen Vesikel Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Nervenzellen Granulat mit FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Forschung

Neurowissenschaften

Preparation of Drosophila Central Neurons for in situ Patch Clamping

Short generation times and facile genetic techniques make the fruit fly Drosophila melanogaster an excellent genetic model in fundamental neuroscience research. Ion channels are the basis of all behavior since they mediate neuronal excitability. The first voltage gated ion channel cloned was the Drosophila voltage gated potassium channel Shaker1,2. Toward understanding the role of ion channels and membrane excitability for nervous system function it is useful to combine powerful genetic tools available in Drosophila with in situ patch clamp recordings. For many years such recordings have been hampered by the small size of the Drosophila CNS. Furthermore, a robust sheath made of glia and collagen constituted obstacles for patch pipette access to central neurons. Removal of this sheath is a necessary precondition for patch clamp recordings from any neuron in the adult Drosophila CNS. In recent years scientists have been able to conduct in situ patch clamp recordings from neurons in the adult brain3,4 and ventral nerve cord of embryonic5,6, larval7,8,9,10, and adult Drosophila11,12,13,14. A stable giga-seal is the main precondition for a good patch and depends on clean contact of the patch pipette with the cell membrane to avoid leak currents. Therefore, for whole cell in situ patch clamp recordings from adult Drosophila neurons must be cleaned thoroughly. In the first step, the ganglionic sheath has to be treated enzymatically and mechanically removed to make the target cells accessible. In the second step, the cell membrane has to be polished so that no layer of glia, collagen or other material may disturb giga-seal formation. This article describes how to prepare an identified central neuron in the Drosophila ventral nerve cord, the flight motoneuron 5 (MN515), for somatic whole cell patch clamp recordings. Identification and visibility of the neuron is achieved by targeted expression of GFP in MN5. We do not aim to explain the patch clamp technique itself.

Preparation of Drosophila Central Neurons for in situ Patch Clamping

In situ patch clamp recordings are used for electrophysiological characterization of neurons in intact circuitry. In the Drosophila genetic model patch clamping is difficult because the CNS is small and surrounded by a robust sheath. This article describes the procedure to remove the sheath and clean neurons for subsequent patch clamp recordings.

Herstellung<em&gt; Drosophila</em&gt; Central Neuronen<em&gt; In situ</em&gt; Patch Clamping

Short generation times and facile genetic techniques make the fruit fly Drosophila melanogaster an excellent genetic model in fundamental neuroscience ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. Technological advances have identified these structures as key elements in neuron connectivity and synaptic plasticity. The quantitative analysis of spine morphology using light microscopy remains an essential problem due to technical limitations associated with light's intrinsic refraction limit. Dendritic spines can be readily identified by confocal laser-scanning fluorescence microscopy. However, measuring subtle changes in the shape and size of spines is difficult because spine dimensions other than length are usually smaller than conventional optical resolution fixed by light microscopy's theoretical resolution limit of 200 nm.
Several recently developed super resolution techniques have been used to image cellular structures smaller than the 200 nm, including dendritic spines. These techniques are based on classical far-field operations and therefore allow the use of existing sample preparation methods and to image beyond the surface of a specimen. Described here is a working protocol to apply super resolution structured illumination microscopy (SIM) to the imaging of dendritic spines in primary hippocampal neuron cultures. Possible applications of SIM overlap with those of confocal microscopy. However, the two techniques present different applicability. SIM offers higher effective lateral resolution, while confocal microscopy, due to the usage of a physical pinhole, achieves resolution improvement at the expense of removal of out of focus light. In this protocol, primary neurons are cultured on glass coverslips using a standard protocol, transfected with DNA plasmids encoding fluorescent proteins and imaged using SIM. The whole protocol described herein takes approximately 2 weeks, because dendritic spines are imaged after 16-17 days in vitro, when dendritic development is optimal. After completion of the protocol, dendritic spines can be reconstructed in 3D from series of SIM image stacks using specialized software.

This article describes a working protocol to image dendritic spines from hippocampal neurons in vitro using Structured Illumination Microscopy (SIM). Super-resolution microscopy using SIM provides image resolution significantly beyond the light diffraction limit in all three spatial dimensions, allowing the imaging of individual dendritic spines with improved detail.

Imaging dendritischen Dornen von Rat Primär Hippocampus Neuronen mit Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

Primärkultur von Maus dopaminergen Neuronen

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their post-natal development, abundance, and accessibility, CGNs are an ideal model to study neuronal processes, including neuronal development, neuronal migration, and physiological neuronal activity stimulation. In addition, CGN cultures provide an excellent model for studying different modes of cell death including excitotoxicity and apoptosis. Within a week in culture, CGNs express N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors, a specific ionotropic glutamate receptor with many critical functions in neuronal health and disease. The addition of low concentrations of NMDA in conjunction with membrane depolarization to rodent primary CGN cultures has been used to model physiological neuronal activity stimulation while the addition of high concentrations of NMDA can be employed to model excitotoxic neuronal injury. Here, a method of isolation and culturing of CGNs from 6 day old pups as well as genetic manipulation of CGNs by adenoviruses and lentiviruses are described. We also present optimized protocols on how to stimulate NMDA-induced excitotoxicity, low-potassium-induced apoptosis, oxidative stress and DNA damage following transduction of these neurons.

This protocol describes a simple method for isolating and culturing primary mouse cerebral granule neurons (CGNs) from 6-7 day old pups, efficient transduction of CGNs for loss and gain of function studies, and modelling NMDA-induced neuronal excitotoxicity, low-potassium-induced cell death, DNA-damage, and oxidative stress using the same culture model.

Modellierung von neuronalen Tod und Degeneration in Maus primären zerebelläre Granulat Neuronen

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral tissues. The hypothalamus in the central nervous system (CNS) is the control center for energy and insulin signal response regulation. Chronic inflammation in peripheral tissues and imbalances of certain chemokines (such as CCL5, TNF&#945;, and IL-6) contribute to diabetes and obesity. However, the functional mechanism(s) connecting chemokines and hypothalamic insulin signal regulation still remain unclear.
In vitro primary neuron culture models are convenient and simple models which can be used to investigate insulin signal regulation in hypothalamic neurons. In this study, we introduced exogeneous GLUT4 protein conjugated with GFP (GFP-GLUT4) into primary hypothalamic neurons to track GLUT4 membrane translocation upon insulin stimulation. Time-lapse images of GFP-GLUT4 protein trafficking were recorded by deconvolution microscopy, which allowed users to generate high-speed, high-resolution images without damaging the neurons significantly while conducting the experiment. The contribution of CCR5 in insulin regulated GLUT4 translocation was observed in CCR5 deficient hypothalamic neurons, which were isolated and cultured from CCR5 knockout mice. Our results demonstrated that the GLUT4 membrane translocation efficiency was reduced in CCR5 deficient hypothalamic neurons after insulin stimulation.

This protocol describes a technique for observation of real-time Green Fluorescence Protein (GFP) tagged Glucose Transporter 4 (GLUT4) protein trafficking upon insulin stimulation and characterization of the biological role of CCR5 in the insulin&#8211;GLUT4 signaling pathway with Deconvolution Microscopy.

Live-Bilder von GLUT4 Protein Menschenhandel Maus primäre hypothalamische Neurone mit Dekonvolution Mikroskopie

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

Use of Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips for Compartmentalizing Primary Murine Neurons

Microfabricated methods to compartmentalize neurons have become essential tools for many neuroscientists. This protocol describes the use of a commercially available pre-assembled plastic chip for compartmentalizing cultured primary rat hippocampal neurons. These plastic chips, contained within the footprint of a standard microscope slide, are compatible with high-resolution, live, and fluorescence imaging. This protocol demonstrates how to retrograde label neurons via isolated axons using a modified rabies virus encoding a fluorescent protein, create isolated microenvironments within one compartment, and perform axotomy and immunocytochemistry on-chip. Neurons are cultured for &gt;3 weeks within the plastic chips, illustrating the compatibility of these chips for long-term neuronal cultures.

This protocol describes the use of plastic chips to culture and compartmentalize primary murine neurons. These chips are preassembled, user-friendly, and compatible with high-resolution, live, and fluorescence imaging. This protocol describes how to plate rat hippocampal neurons within these chips and perform fluidic isolation, axotomy and immunostaining.

Einsatz von vormontierten Kunststoff mikrofluidischen Chips für Abschottung primäre Murine Neuronen

Microfabricated methods to compartmentalize neurons have become essential tools for many neuroscientists. This protocol describes the use of a ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of pyramidal neurons and dendritic spines, a ballistic labeling technique can be utilized. In the present protocol, pyramidal neurons are labeled with DilC18(3) dye and analyzed using neuronal reconstruction software to assess neuronal morphology and dendritic spines. To investigate neuronal structure, dendritic branching analysis and Sholl analysis are performed, allowing researchers to draw inferences about dendritic branching complexity and neuronal arbor complexity, respectively. The evaluation of dendritic spines is conducted using an automatic assisted classification algorithm integral to the reconstruction software, which classifies spines into four categories (i.e., thin, mushroom, stubby, filopodia). Furthermore, an additional three parameters (i.e., length, head diameter, and volume) are also chosen to assess alterations in dendritic spine morphology. To validate the potential of wide application of the ballistic labeling technique, pyramidal neurons from in vitro cell culture were successfully labeled. Overall, the ballistic labeling method is unique and useful for visualizing neurons in different brain regions in rats, which in combination with sophisticated reconstruction software, allows researchers to elucidate the possible mechanisms underlying neurocognitive dysfunction.

We present a protocol to label and analyze pyramidal neurons, which is critical for evaluating potential morphological alterations in neurons and dendritic spines that may underlie neurochemical and behavioral abnormalities.

Ballistische Kennzeichnung von Pyramidal neurons in Gehirnscheiben und in der primären Zellkultur

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...

Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

Parkinson&#8217;s disease (PD) is a devastating neurodegenerative disorder caused by the degeneration of dopaminergic (DA) neurons. Excessive Ca2+ influx due to the abnormal activation of glutamate receptors results in DA excitotoxicity and has been identified as an important mechanism for DA neuron loss. In this study, we isolate, dissociate, and culture midbrain neurons from the mouse ventral mesencephalon (VM) of ED14 mouse embryos. We then infect the long-term primary mouse midbrain cultures with an adeno-associated virus (AAV) expressing a genetically encoded calcium indicator, GCaMP6f under control of the human neuron-specific synapsin promoter, hSyn. Using live confocal imaging, we show that cultured mouse midbrain neurons display spontaneous Ca2+ fluxes detected by AAV-hSyn-GCaMP6f. Bath application of glutamate to midbrain cultures causes abnormal elevations in intracellular Ca2+ within neurons and this is accompanied by caspase-3 activation in DA neurons, as demonstrated by immunostaining. The techniques to identify glutamate-mediated apoptosis in primary mouse DA neurons have important applications for the high content screening of drugs that preserve DA neuron health.

Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

Here we present a protocol to measure in vitro Ca2+ fluxes in midbrain neurons and their downstream effects on caspase-3 using primary mouse midbrain cultures. This model can be employed to study pathophysiologic changes related to abnormal Ca2+ activity in midbrain neurons, and to screen novel therapeutics for anti-apoptotic properties.

Quantifizierung von Spontan-Ca2+-Fluxes und ihren nachgelagerten Auswirkungen in primären Maus-Midbrain-Neuronen

Parkinson&#8217;s disease (PD) is a devastating neurodegenerative disorder caused by the degeneration of dopaminergic (DA) neurons. Excessive Ca2+ influx ...

Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator

Mitochondrial redox homeostasis is important for neuronal viability and function. Although mitochondria contain several redox systems, the highly abundant thiol-disulfide redox buffer glutathione is considered a central player in antioxidant defenses. Therefore, measuring the mitochondrial glutathione redox potential provides useful information about mitochondrial redox status and oxidative stress. Glutaredoxin1-roGFP2 (Grx1-roGFP2) is a genetically encoded, green fluorescent protein (GFP)-based ratiometric indicator of the glutathione redox potential that has two redox-state-sensitive excitation peaks at 400 nm and 490 nm with a single emission peak at 510 nm. This article describes how to perform confocal live microscopy of mitochondria-targeted Grx1-roGFP2 in primary hippocampal and cortical neurons. It describes how to assess steady-state mitochondrial glutathione redox potential (e.g., to compare disease states or long-term treatments) and how to measure redox changes upon acute treatments (using the excitotoxic drug N-methyl-D-aspartate (NMDA) as an example). In addition, the article presents co-imaging of Grx1-roGFP2 and the mitochondrial membrane potential indicator, tetramethylrhodamine, ethyl ester (TMRE), to demonstrate how Grx1-roGPF2 can be multiplexed with additional indicators for multiparametric analyses. This protocol provides a detailed description of how to (i) optimize confocal laser scanning microscope settings, (ii) apply drugs for stimulation followed by sensor calibration with diamide and dithiothreitol, and (iii) analyze data with ImageJ/FIJI.

This article describes a protocol to determine differences in basal redox state and redox responses to acute perturbations in primary hippocampal and cortical neurons using confocal live microscopy. The protocol can be applied to other cell types and microscopes with minimal modifications.

Live-Bildgebung des mitochondrialen Glutathion-Redox-Zustands in primären Neuronen unter Verwendung eines ratiometrischen Indikators

Mitochondrial redox homeostasis is important for neuronal viability and function. Although mitochondria contain several redox systems, the highly abundant ...