Wir entwickelten ein Verfahren zur Isolierung von Trachealbürstenzellen, seltenen spezialisierten chemosensorischen Epithelzellen aus Cholin-Acetyltransferase-Fluoreszenz-Reportermäusen. Diese Methode basiert auf einer anfänglichen Trennung des Trachealepithels von der Submucosa, was eine spätere kürzere Inkubation des Epithelblatts mit Papain ermöglicht. Dies ermöglicht eine robuste Wiederherstellung von Trachealbürstenzellen und wurde erfolgreich für die Isolation und Transkriptionsanalyse von Bürstenzellen durch RNA-Sequenzierung eingesetzt.
Eine lange Inkubation mit Verdauungsenzymen kann die Zelllebensfähigkeit verringern und das Transkriptionsprofil von Zellen verändern, die aus Geweben isoliert sind. Hier trennen wir das Trachealepithel mit Dispase und inkubieren es anschließend für kurze Zeit mit Papain und produzieren hohe Erträge lebensfähiger Bürstenzellen. Unsere Methode kann zu Studien des epithelischen Oberatemepithels beitragen.
Das gleiche Protokoll kann angewendet werden, um Bürstenzellen von anderen Schleimhautstellen wie Nasengewebe zu isolieren. Die Demonstration unserer hochreproduzierbaren Technik wird es Peer-Wissenschaftlern ermöglichen, Trachealbürstenzellen zu isolieren und weiter zu untersuchen. Um dieses Verfahren zu beginnen, fügen Sie Dispase und DNase I zu PBS bei den letzten Konzentrationen hinzu, die hier gezeigt werden, um die Dispase-Verdauungslösung vorzubereiten.
Stellen Sie sicher, dass das Dispasepulver vollständig gelöst ist, bevor Sie die Lösung in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius aufwärmen. Fügen Sie als Nächstes 5% hitzeaktiviertes FBS zu DMEM hinzu, um eine Stopplösung vorzubereiten. Um den Tyrode I Puffer vorzubereiten, fügen Sie Papain und L-Cystein in den Puffer von HEPES Tyrode ohne Kalzium hinzu.
Um den Tyrode II Puffer vorzubereiten, fügen Sie Leupeptin in den Puffer von HEPES Tyrode ohne Kalzium in einer Konzentration von zwei Mikrolitern pro Milliliter hinzu. Zur Vorbereitung des FACS-Puffers verwenden Sie Hanks Balanced Salt Solution ohne Kalzium, Magnesium und Phenolrot, ergänzt mit zwei Millimolaren EDTA und 2%FBS. Nach der Einschläferung der Maus, verwenden Sie 21 Messgerät Nadeln, um es auf einem chirurgischen Brett in der Supine-Position mit verlängerten oberen und unteren Extremitäten zu fixieren.
Das Fell mit 70% Ethanol besprühen, um den Bereich zu desinzipieren. Mit geraden Zangen, heben Sie die Haut und das Fell des Bauches und verwenden Sezieren Schere, um einen Schnitt in der Mitte zu machen. Mit der Schere, trennen Sie die Haut vom subkutanen Gewebe vom Bauch zur Mandibula.
Während Sie das unterkutane Gewebe mit der Zange hochhalten, machen Sie einen kleinen Schnitt mit der Schere in der Mitte der Bauchwand. Öffnen Sie dann das Peritoneum mit einem V-förmigen Schnitt. Mit der Zange, bewegen Sie den Dünndarm vorsichtig zur Seite.
Suchen Sie die Bauchaorta und Vena cava und machen Sie einen Schnitt mit der sezierenden Schere, um eine schnelle Exsanguination zu ermöglichen. Suchen Sie die Membran. Mit einer 18-Meter-Nadel, machen Sie eine Öffnung im Zwerchfell direkt unter dem Brustbein, um die Lunge zu entschärfen.
Mit scharfspitzer gerader Sezierenderschere entlang der Unterbasis der Rippen schneiden, um das Zwerchfell vorsichtig vom Brustkorb zu trennen. Verwenden Sie die Zange, um das exponierte Ende des Brustbeins zu heben und schneiden Sie das Brustbein längs von der Basis des Brustkorbs bis zum Hals. Verwenden Sie kurze gerade Schere, um einen zentralen Zervixschnitt zu machen und trennen Sie die beiden Lappen der submandibulären Drüse.
Danach verwenden Sie ein Paar feinpunkthohe Präzisionszange, um das umgebende Bindegewebe und den Thymus, der die Carina überlagert, vorsichtig zu entfernen. Sezieren Sie die Luftröhre frei, indem Sie zuerst das proximale Ende auf der Ebene der Epiglottis trennen und dann das distale Ende auf der Ebene der Bifurkation der Luftröhre sezieren. Suchen Sie die Epiglottis und schneiden Sie die Luftröhre längs von den Epiglottis zur Carina.
Um zu beginnen, legen Sie die Luftröhre in eine 1,5 Milliliter Tube mit 750 Mikroliter Dispase-Verdauungslösung vorgewärmt auf 37 Grad Celsius. Bedecken Sie das Rohr mit Aluminiumfolie, um die Exposition gegenüber direktem Licht zu reduzieren und auf einem Shaker bei 200 U/min und bei Raumtemperatur für 40 Minuten zu brüten. Dann 750 Mikroliter DMEM mit 5%FBS hinzufügen, um die Reaktion zu stoppen und die Röhre auf Eis zu legen.
Die Luftröhre in eine Petrischale geben. Richten Sie die Luftröhre mit der epitheliale Seite nach oben. Die längs sezierte Luftröhre hat eine halbzylindrische Form, die von den Knorpelringen gepflegt wird.
Das Epithel befindet sich auf der konkaven Oberfläche. Mit geraden Zangen, tether die Epiglottis Bereich der Luftröhre an die Petrischale und verwenden Sie eine Größe 22 Entsorgung Skalpell, um das Epithel von der Luftröhre zu kratzen. Die Epithelschicht trennt sich als transluzentes Blatt.
Verwenden Sie das Skalpell, um das Epithel zu zerkleinern und die Epithelschicht in ein Zwei-Milliliter-Rohr zu übertragen. Spülen Sie die Petrischale mit 750 MikroliterTyrode I Puffer und übertragen Sie diese in das Rohr, das die Epithelschicht enthält. Bedecken Sie das Rohr mit Aluminiumfolie, um die Exposition gegenüber direktem Licht zu reduzieren und bei 37 Grad Celsius auf einem Shaker bei 200 U/min für 30 Minuten zu brüten.
Dann 750 Mikroliter kalten Tyrode II Puffer hinzufügen. Wirbeln Sie das verdautgewebe 20 bis 30 Sekunden lang kräftig aus. Mit einer Spritze, die an einer 18-Spur-Nadel befestigt ist, trituieren Sie das Homogenat 10 Mal.
Danach wechseln Sie zu einer 21-Spur-Nadel und trituieren Sie 10 bis 20 Mal mehr. Filtern Sie die Zellen durch ein 100-Mikrometer-Sieb in ein 50 Milliliter konisches Rohr. Fügen Sie kalten FACS-Puffer bei einem volumetrischen Verhältnis von 30 zu eins hinzu.
Zentrifuge bei 350 mal g und bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet im kalten FACS-Puffer wieder auf. Übertragen Sie diese Suspension auf ein 12 mal 75 Millimeter Polystyrolrohr.
Zentrifuge wieder bei 350 mal g und bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 100 Mikroliter FACS-Puffer wieder auf. Als Nächstes fügen Sie einen Mikroliter Anti-Maus-CD1632 blockierenden Antikörper hinzu, um unspezifische Bindungen zu blockieren und 15 Minuten lang auf Eis zu brüten.
Fügen Sie dann Antikörper in die jeweiligen Isotype-Steuerelemente ein, wie im Textprotokoll beschrieben. 45 Minuten auf Eis bebrüten, während sie vor direktem Licht geschützt sind. Danach 4,5 Milliliter kalten FACS-Puffer hinzufügen und mischen.
Zentrifuge bei 350 mal g und bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 300 Mikroliter kalten FACS-Puffer wieder auf. Fügen Sie Propidiumiodid unmittelbar vor der zytometrischen Durchflusssortierung hinzu.
In dieser Studie werden Trachealbürstenzellen von ChAT eGFP Acetylcholin-Fluoreszenz-Reportermäusen erfolgreich für die RNA-Sequenzierung isoliert. Zellen werden aus Dentrümmern durch vorwärts und seitlichen Streuwinkel identifiziert. Doublets werden mit Vorwärtsstreuhöhe und -breite und Seitenstreuhöhe und -breite ausgeschlossen.
Die Doublets sind die Zellen mit hohen Breitenwerten. Innerhalb der einzelnen Zellen werden die lebenden Zellen als die Population identifiziert, die Propidiumiodid negativ ist. Innerhalb der lebenden Einzelzellen werden die CD45-Niedrigen bis negativen Zellen anhand der Isotypkontrolle identifiziert.
Innerhalb der CD45-Schwachzellen sind die EpCAM-positiven Zellen, die auch eGFP-positiv im FITC-Kanal sind, die Population von Pinselzellen. Pinselzellzahlen werden durch die Exposition gegenüber mikrobiellen Metaboliten und Protozoen verändert und spiegeln daher die Variabilität der institutionellen Mikrobiota wider. Daher schlagen wir vor, die Anzahl der Pinselzellen durch Fluoreszenzmikroskopie abzuschätzen, um die erwartete Anzahl isolierter Pinselzellen durch zytometrische Durchflusssortierung zu messen.
Achten Sie darauf, die Epithelschicht der Luftröhre richtig zu trennen, da sie die Erträge isolierter Bürstenzellen bestimmt. Die isolierten Trachealbürstenzellen können in einer breiten Palette von Assays wie RNA-Sequenzierung, Zellkultur und funktionelle Analyse eingesetzt werden.
