Name: Serie: High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes
Uploaded: 2015-03-24T16:00:00
Duration: 10 min
Description: 13.2K Aufrufe. US Food and Drug Administration. This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

Diese Arbeit wurde vom CBER / FDA-NIAID / NIH Interagency Vereinbarung YI-AI-6153-01, FDA / CBER intra-Fonds und der FDA Medical Gegen Initiative unterstützt. TCT, MNB, VPM, LMS und KDK wurden von einer Berufung in die Forschung Beteiligungsprogramm in der Mitte für Biologics Evaluation und Forschung durch den Oak Ridge Institut für Pädagogik der Naturwissenschaften durch eine Interagency Abkommen zwischen den USA Departmen für Energie und den USA verwaltet unterstützt Food and Drug Administration.

1. Vorbereitung der Standardserienverdünnungen (3A) HINWEIS: Serienverdünnungsreihe linearisierte Plasmide, die die Sequenzen von einer Pr / Pb-Set ausgerichtet sind als quantitative Standards für die qRT-PCR-Assay verwendet. Jeder Standard-Verdünnungssatz für die IFN-Subtypen enthält genügend Volumen, um 90 Testplatten laufen. Die vier Punkte der Standardverdünnungskurve für den Assay verwendet werden ausgewählt, um Ct-Werte aus einem Bereich von 20 bis 32 (Tabelle 3). <ol><li> Thaw, Wirbel, und kurz zentrifugieren Sie das Standard (50 pM) und Lachssperma-DNA (ssDNA, 10 mg / ml) Stammlösungen. </li><li> Bereiten Sie die ssDNA / Wasser-Gemisch für die 17 Standardverdünnungssätze durch Mischen von 51 ul von ssDNA mit 20,3 ml Wasser. </li><li> Beschriften Sie eine 8er PCR-Streifen für eine Standardverdünnungssatz. HINWEIS: Vorbereitung der Standardverdünnungsreihen aus den Stammlösungen wird 2-3 Stunden dauern. </li><li> Dispense 190 ul der ssDNA / Wasser-Gemisch in die first Rohr in dem Streifen und 180 ul von ssDNA / Wasser-Gemisch auf die verbleibenden fünf Röhrchen. </li><li> Führen Sie eine 1:20 Verdünnung durch die Übertragung von 10 &amp; mgr; l aus dem 50 pM Standard Lager mit dem Rohr mit 190 ul der ssDNA / Wasser, mischen; Wirbel und schnell Zentrifugieren Sie die PCR-Streifen. </li><li> Durchführen einer 1:10 Verdünnung durch Übertragung 20 &amp; mgr; l aus dem zuletzt verdünnt Rohr zum nächsten Rohr in der Reihe; Wirbel und schnell Zentrifugieren Sie die PCR-Streifen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.6 bis zum letzten Rohr in der Verdünnungsreihe hat den Standard aufgenommen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1,3-1,7 für jeden Standard. </li></ol> Siehe Tabelle 3 unten 2. Herstellung der Primer / Probe (Pr / Pb) und Leerwert-Kontrolle (NTC) Funktion Stock Mixes (3B) HINWEIS: Jede 1,7 ml Pr / Pb eingestellt Arbeits Lager und 128,6 ul Leerwert-Kontrolle (NTC) Arbeits Lager Mix 30 Assay-Platten zu machen. <ol><li> Bereiten Sie die Pr / Pb eingestellt Arbeitsstammmischungen. NICHTE: Herstellung des Pr / Pb-Set und NTC Arbeitsstammmischungen aus den Stammlösungen wird 2-3 Stunden dauern. <ol><li> Resuspendieren der Primer und Sonden bei 100 uM mit ultrareinem Wasser für die Herstellung von Stammlösungen. </li><li> Labels bis siebzehn 2-ml-Röhrchen; eine für jede Pr / Pb-Set im Test enthalten. </li><li> Thaw, Wirbel, und kurz zentrifugieren der Primer (100 uM), Sonden (100 uM) und ssDNA (10 mg / ml) Stammlösungen. </li><li> Add 2 ul von ssDNA zu jedem Rohr mit dem 12,5 ul elektronischen Mehrkanalpipette. Fügen Sie den entsprechenden Forward-Primer, Reverse-Primer und die Sonde auf jede Pr / Pb eingestellt Arbeitsstammrohr. Siehe Tabelle 1 für die Pr / Pb-Sets Targeting humanen IFN-Subtypen und Tabelle 2 für die Rhesusaffen Pr / Pb-Sets. Fügen Sie Wasser, um die Lautstärke der einzelnen Pr bringen / Pb eingestellt Arbeitsstammrohr zu 200 ul. ANMERKUNG: Das Volumen von Primern, Sonde und Wasser hinzufügen, hängt von der erforderlichen endgültigen Reaktions Konzentration eines Pr / Pbgesetzt. </li></ol></li><li> Bereiten Sie die NTC Arbeitsstammmischungen. <ol><li> Beschriften Sie zwei 5-tube PCR-Streifen für die NTC Arbeitsvorräte mischt. </li><li> Übertragen 14,3 ul jeder Pr / Pb auf die entsprechende NTC Arbeits Lager Mischrohr gesetzt. Siehe Tabelle 4 für die Pr / Pb oder Set-Kombinationen für NTC-Brunnen. Wasser In jedem der NTC Arbeits Lager mischt, um das Endvolumen auf 128,6 ul zu bringen. </li><li> Vortex, kurz zentrifugieren, und legen Sie die Röhrchen im Dunkeln auf Eis oder bei -20 ° C für die langfristige Lagerung. </li></ol></li></ol> Siehe Tabelle 4 unten <ol start="3"><li> Verdünnen Sie die Pr / Pb eingestellt Arbeitsvorräte. <ol><li> Nach der Entnahme einer Teilmenge der Pr / Pb-Sets für den NTC arbeiten Brühmassen erforderlich, fügen Sie 1,5 ml Wasser, um das Endvolumen jeder Pr / Pb bringen eingestellt Arbeitsstammrohr auf 1,7 ml. </li><li> Vortex, kurz zentrifugieren, und legen Sie die Röhrchen im Dunkeln auf Eis oder bei -20 ° C für längere Lagerung. </li></ol></li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Vorbereitung der 384-Well-Assayplatten mit Hilfe der automatischen Mehrkanalpipette <ol><li> Bereiten Sie eine 96-Loch-Source-Platte der Pr / Pb-Sets und NTC-Mischungen für Aliquotierung auf 384er Testplatten. HINWEIS: Herstellung der Source-Platte von den Pr / Pb Funktionsweise Brühmassen dauert weniger als 1 Stunde. Jeder 96-Loch-Source-Platte ist genug, um sechs 384er Testplatten (3C) zu machen. <ol><li> Vortex und kurz zentrifugieren die Pr / Pb eingestellt Arbeitsvorräte und NTC Arbeitsstammmischungen. </li><li> Legen Sie eine neue Platte mit 96 Vertiefungen in einem gekühlten 96-Loch-Kühlblock und bezeichnen die Vertiefungen für jede Pr / Pb-Set oder NTC mischen die Brunnen zu erhalten (siehe Abbildung 2). </li><li> Wasser hinzu, bis der 96-Well-Platte mit einer 250 ul elektronischen Mehrkanalpipette: Dispense 66 ul Wasser zu jedem Pr / Pb gesetzt und (mit Ausnahme der 4 Vertiefungen für Ziel 17). Dispense 82,5 ul Wasser zu den 4 Ziel 17 Brunnen. Dispense 27,5 ul Wasser zu jedem NTC gut mischen. </li&gt; <li> Fügen Sie die richtige Pr / Pb eingestellt Arbeits Lager an die vorgesehenen Vertiefungen der Platte mit 96 Vertiefungen: Dispense 54 ul der korrekten Pr / Pb eingestellt Arbeits Lager an die bezeichneten Pr / Pb-Set Brunnen (mit Ausnahme der 4 Vertiefungen für Ziel 17). Dispense 67,5 ul der Ziel 17 Pr / Pb eingestellt Arbeits Lager an die vorgesehenen Ziel 17 Pr / Pb-Set Brunnen. In 22,5 ul der richtigen NTC Arbeits Lager Mix auf die Kavitäten pipettieren. </li><li> Verschließen Sie die Platte mit 96 Vertiefungen mit einer Klebefolie Dichtung und Zentrifuge für 1 min bei 700 xg, um sicherzustellen, der Inhalt am Boden der Wells. </li><li> Legen Sie die Platte mit 96 Vertiefungen in der Vortex-Mischer mit einer 96-Well-Platten-Adapter und mischen Sie für 1 min bei 1000 Umdrehungen pro Minute. Zentrifuge die Platte mit 96 Vertiefungen 5 min bei 700 x g. </li><li> Lagern Sie die 96-well Platte Quelle in der Dunkelheit bei 4 ° C bei Verwendung am selben Tag, sonst bei -20 ° C bis zur Verwendung zu lagern. </li></ol></li><li> Bereiten Sie die 384er Testplatten, indem Sie den Pr / Pb-Sets mit Hilfe der automatischen Mehrkanalpipette. HINWEIS: Herstellung von sechs Testplatten aus der 96-Well-Quellenplatte wird 3-4 Stunden dauern. <ol><li> Vor dem Herstellen von Druckplatten, vorge Kühlen der Kühlnest bis 4 ° C vorheizen den Plattenverdampfer bis 125 ° C und die untere Heizblock auf 80 ° C mit Luftstrom bläst zwischen 20-25 Litern pro Minute (LPM). </li><li> Schalten Sie den automatischen Mehrkanalpipette und öffnen Sie das Protokoll für die Herstellung von IFN-Testplatten durch Doppelklick auf das Programmsymbol. </li><li> Zur Einrichtung der Plattform, legen Sie einen vollständig gefüllt Pipettenspitze Box in Plattform Position 1, der 96-Loch-Source-Platte in Position 4 und eine neue 384-Well-Platte in Position 6. Starten Sie den Lauf durch Drücken der Play-Taste. HINWEIS: Nach Abschluss eines Durchlaufs, jede Vertiefung werden 5 ul Pr / Pb-Mix enthalten. HINWEIS: pro Loch der 384er Testplatte Die endgültige Höhe der ssDNA hinzugefügt 0,025 &amp; mgr; g. </li><li> Klopfen Sie leicht die 384er Testplatte auf eine ebene Fläche, um Flüssigkeiten zu gewährleisten sind am Boden der Vertiefungen und wenden einen KlebstoffPlattendichtung. </li><li> Zentrifuge die Platte für 1 min bei 700 x g. Die Klebeplatte Dichtung entfernen, setzen Sie den 384er Testplatte in die Tellertrockner und positionieren Sie den 384er vielfältigen direkt über den Brunnen. </li><li> Wenn der Inhalt des 384-Well-Assayplatte zu trocken ist, eine neue Klebeplatte Dichtung, in Folie wickeln, Etikett, und speichern im Dunkeln bei 4 ° C bis zur Verwendung. HINWEIS: Die Platten können bei 4 ° C für mindestens 6 Monate gelagert werden. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.2.3-3.2.6 bis 6 x 384er Testplatten werden vorbereitet oder die Flüssigkeit im 96-Well-Platte Quelle erschöpft ist. </li><li> Schalten Sie die Kühlnest, schließen Sie die Software, und schalten Sie den automatischen Mehrkanalpipette. Schalten Sie den Tellertrockner. </li></ol></li></ol> 4. Laden und Ausführen eines 384er Testplatte <ol><li> Bereiten Sie zwei Housekeeping-Gen (HKG) und Mischungen, die der Pr / Pb-Set für eine HKG, ssDNA, PCR-Mastermix und Wasser bestehen, zu einem getrockneten 384-Well-Assayplatte (hinzugefügt werden <strong&gt; 3D). HINWEIS: Die Herstellung der Mischungen und Laden der Testplatte wird 1-2 Stunden dauern. Ausführen der Testplatte wird weniger als 2 Stunden dauern. <ol><li> Beschriften Sie eine 1,5-ml-Röhrchen für jeden HKG-Mix. </li><li> Verdünne 2 ul ssDNA (10 mg / ml) mit 84,9 &amp; mgr; l Wasser. Add 2 ul der verdünnten ssDNA, 11,8 ul Wasser, 23 ul des Master-Mix und 9,2 ul der richtigen 20x HKG Pr / Pr zu jedem Rohr, Wirbel, und kurz zentrifugieren gesetzt. </li><li> Verwenden Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH) und Ubiquitin C (UBC) als die HKG für das menschliche Assay (siehe Material Table). Verwenden GAPDH und 18S-rRNA als HKG für die Rhesus-Assay. HINWEIS: Die zur Durchführung des Assays HKG sind flexibel und sollte die für den Zelltyp geeigneten Genen widerspiegeln getestet GAPDH sind UBC und 18S Beispiele für häufig verwendete HKG;. andere HKG besser geeignet sein können. </li></ol></li><li> Probe vorbereiten und positiHab auch kontrollieren Mischungen, die von der Probe oder positive Kontrolle cDNA, Master-Mix und Wasser bestehen, zu einem getrockneten 384-Well-Assayplatte hinzugefügt werden. Probe vorbereiten und die positive Kontrolle Mischungen in genug Quantität zu 21 Plattenvertiefungen (3D) zu verzichten. <ol><li> Vor der cDNA-Synthese, folgen Sie den Anweisungen des Herstellers, um die RNA-Proben mit einem DNase-Verdau Schritt vorzubereiten. </li><li> Vorbereitung der Proben und der positiven Kontrolle im Voraus aus der cDNA-Synthese von mindestens 500 ng RNA, gefolgt von einer Behandlung mit RNase H (Endvolumen von 24 &amp; mgr; l für jede Probe) nach den Anweisungen des Herstellers. Bewahren Sie die vorbereitete cDNA bei -20 ° C bis zur Verwendung. Thaw, Wirbel, und kurz zentrifugieren die Probe cDNA. </li><li> In 78,8 ul des Master-Mix und 54,8 ul Wasser zu jeweils 24 ul-Probe und der positiven Kontrolle Rohr. </li><li> Vortex und kurz zentrifugiert werden die Rohre. </li></ol></li><li> Bereiten Sie die Standards und NTC gut mischt, conbestehend aus Master-Mix und Wasser zu einem getrockneten 384-well Testplatte (3D) zugesetzt werden. Für die Standards gut mischen, fügen Sie 165 ul Wasser und 275 ul der Master-Mix in einem 1,5-ml-Tube. Für die NTC gut mischen, fügen 52,5 ul Wasser auf 52,5 ul des Master-Mix in einem 1,5-ml-Tube. Vortex und kurz zentrifugiert werden die Rohre. </li><li> Bereiten Sie einen getrockneten 384-Well-Assayplatte zum Laden der Mischungen und Proben. <ol><li> Entfernen eines getrockneten 384er Testplatte von 4 ° C und Zentrifuge für 1 min bei 700 x g. </li><li> Legen Sie die Platte auf einer gekühlten 384-Well-Kühlblock, der Klebeplatte Dichtung zu entfernen und einen Überblick über die Vertiefungen der Platte zu bestimmen, wo die verschiedenen Mischungen und Proben pipettiert werden (Abbildung 1). </li></ol></li><li> Laden Sie die 384er Testplatte mit Standard-Mischung gut, Normen, NTC gut mischen, Muster, Positivkontrolle und HKG-Mix (3E). Vortex und kurz zentrifugieren alle Lösungen vor der Abgabe an die Platte. <ol><li> Dispense 6 ul der Standards auch zu jedem Standard-mischen Sie gut mit dem 30 ul elektronischen Mehrkanalpipette. Dispense 1,5 ul der richtigen Standardverdünnungsreihen, gut mit dem 12,5 ul elektronischen Mehrkanalpipette die bezeichnet. </li><li> Dispense 7,5 ul des NTC gut aufeinander NTC mischen gut mit dem 30 ul elektronischen Mehrkanalpipette. Verzichtet werden 7,5 ul der Probe auf die Kavitäten mit 30 ul elektronischen Mehrkanalpipette. Dispense 2,5 ul der HKG Pr / Pb oder vermischt, um die Kavitäten mit 12,5 ul elektronischen Mehrkanalpipette. </li><li> Füllen Sie alle leeren Wells mit 7,5 ul der übrig gebliebenen Wasser und Master-Mix Mischung mit dem 30 ul elektronischen Mehrkanalpipette; 7,5 ul Wasser allein wird auch funktionieren. </li><li> Dichten den 384er Assay-Platte mit dem optischen Klebefolie und Zentrifuge für 1 min bei 700 x g. Mischen Sie den verschlossenen 384-Well-Platte in den Wirbelmischer für 2 Minuten bei 2600 Umdrehungen pro Minuteund Zentrifugieren für 5 min bei 700 x g. </li><li> Das verschlossene 384er Testplatte in der qRT-PCR-Maschine, öffnen Sie die Vorlage für den Test-Layout und beginnt den Lauf. HINWEIS: Die Ergebnisse können als Tabelle oder als Text-Datei zur Analyse exportiert werden. </li><li> Mit den folgenden optimalen Thermocycler Reaktionsbedingungen für den Test: i) 50 ° C für 2 min, ii) 95 ° C für 10 min, iii) 95 ° C für 25 s, iv) 59 ° C für 1 min. Wiederholen Sie die Schritte III und IV für 40 Zyklen. </li><li> Exportieren Sie die Rohdaten von der qRT-PCR-Plattform in ein Tabellenkalkulationsanwendungssoftware. Zeichnen Sie jedes 4-Punkt-Standard als Standardkurve, um die Linearität zu beobachten gesetzt. Führen Analyse durch Berechnung der ΔCq oder Kopienzahl auf der Grundlage der vier Punkt Standardkurven 27. </li></ol></li></ol> Siehe Abbildung 3 unten

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	<li>Yan, N., Chen, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+antiviral+immunity.">Intrinsic antiviral immunity.</a> Nature. 13, 214-222 (2012).</li><li>Pestka, S., Krause, C. D., Walter, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferons,+interferon-like+cytokines,+and+their+receptors.">Interferons, interferon-like cytokines, and their receptors.</a> Immunological reviews. 202, 8-32 (2004).</li><li>Baum, A., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+type+I+interferon+by+RNA+viruses:+cellular+receptors+and+their+substrates.">Induction of type I interferon by RNA viruses: cellular receptors and their substrates.</a> Amino acids. 38, 1283-1299 (2010).</li><li>Kotenko, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN-lambdas+mediate+antiviral+protection+through+a+distinct+class+II+cytokine+receptor+complex.">IFN-lambdas mediate antiviral protection through a distinct class II cytokine receptor complex.</a> Nature. 4, 69-77 (2003).</li><li>Hardy, M. P., Owczarek, C. M., Jermiin, L. S., Ejdeback, M., Hertzog, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+type+I+interferon+locus+and+identification+of+novel+genes.">Characterization of the type I interferon locus and identification of novel genes.</a> Genomics. 84, 331-345 (2004).</li><li>Cheon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFNbeta-dependent+increases+in+STAT1,+STAT2,+and+IRF9+mediate+resistance+to+viruses+and+DNA+damage.">IFNbeta-dependent increases in STAT1, STAT2, and IRF9 mediate resistance to viruses and DNA damage.</a> The EMBO journal. 32, 2751-2763 (2013).</li><li>Schneider, W. M., Chevillotte, M. D., Rice, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-stimulated+genes:+a+complex+web+of+host+defenses.">Interferon-stimulated genes: a complex web of host defenses.</a> Annual review of immunology. 32, 513-545 (2014).</li><li>Hiscott, J., Nguyen, T. L., Arguello, M., Nakhaei, P., Paz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+the+nuclear+factor-kappaB+pathway+and+the+innate+immune+response+by+viruses.">Manipulation of the nuclear factor-kappaB pathway and the innate immune response by viruses.</a> Oncogene. 25, 6844-6867 (2006).</li><li>Alcami, A., Symons, J. A., Smith, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vaccinia+virus+soluble+alpha/beta+interferon+(IFN)+receptor+binds+to+the+cell+surface+and+protects+cells+from+the+antiviral+effects+of+IFN.">The vaccinia virus soluble alpha/beta interferon (IFN) receptor binds to the cell surface and protects cells from the antiviral effects of IFN.</a> Journal of virology. 74, 11230-11239 (2000).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+type+I+and+type+III+interferons+by+a+secreted+glycoprotein+from+Yaba-like+disease+virus.">Inhibition of type I and type III interferons by a secreted glycoprotein from Yaba-like disease virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9822-9827 (2007).</li><li>Bidwell, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+Irf7+pathways+in+breast+cancer+cells+promotes+bone+metastasis+through+immune+escape.">Silencing of Irf7 pathways in breast cancer cells promotes bone metastasis through immune escape.</a> Nature medicine. 18, 1224-1231 (2012).</li><li>Di Domizio, J., Cao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fueling+autoimmunity:+type+I+interferon+in+autoimmune+diseases.">Fueling autoimmunity: type I interferon in autoimmune diseases.</a> Expert review of clinical immunology. 9, 201-210 (2013).</li><li>Crow, Y. J., Casanova, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STING-Associated+Vasculopathy+with+Onset+in+Infancy+-+A+New+Interferonopathy.">STING-Associated Vasculopathy with Onset in Infancy - A New Interferonopathy.</a> The New England journal of medicine. , (2014).</li><li>Bermel, R. A., Rudick, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-beta+treatment+for+multiple+sclerosis.">Interferon-beta treatment for multiple sclerosis.</a> Neurotherapeutics : the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 4, 633-646 (2007).</li><li>Kingham, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+HBsAg-positive+chronic+active+hepatitis+with+human+fibroblast+interferon.">Treatment of HBsAg-positive chronic active hepatitis with human fibroblast interferon.</a> Gut. 19, 91-94 (1978).</li><li>Heathcote, J., Main, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+hepatitis+C.">Treatment of hepatitis C.</a> Journal of viral hepatitis. 12, 223-235 (2005).</li><li>Donnelly, R. P., Dickensheets, H., O'Brien, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-lambda+and+therapy+for+chronic+hepatitis+C+virus+infection.">Interferon-lambda and therapy for chronic hepatitis C virus infection.</a> Trends in immunology. 32, 443-450 (2011).</li><li>Castaigne, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+alpha+in+the+treatment+of+hairy+cell+leukemia.">Interferon alpha in the treatment of hairy cell leukemia.</a> Cancer. 57, 1681-1684 (1986).</li><li>Kumar, L., Basade, M., Gulati, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+interferon-alpha+in+chronic+myeloid+leukemia.">Role of interferon-alpha in chronic myeloid leukemia.</a> The Journal of the Association of Physicians of India. 3, 26-32 (1995).</li><li>Dai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+alpha+on+NZM2328.Lc1R27:+Enhancing+autoimmunity+and+immune+complex-mediated+glomerulonephritis+without+end+stage+renal+failure.">Interferon alpha on NZM2328.Lc1R27: Enhancing autoimmunity and immune complex-mediated glomerulonephritis without end stage renal failure.</a> Clinical immunology (Orlando, Fla.). 154, 66-71 (2014).</li><li>Maeda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-alpha+Acts+on+the+S/G2/M+Phases+to+Induce+Apoptosis+in+the+G1+Phase+of+an+IFNAR2-Expressing+Hepatocellular+Carcinoma+Cell+Line.">Interferon-alpha Acts on the S/G2/M Phases to Induce Apoptosis in the G1 Phase of an IFNAR2-Expressing Hepatocellular Carcinoma Cell Line.</a> The Journal of biological chemistry. , (2014).</li><li>Xia, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+IFN-alpha-Producing+Plasmacytoid+Dendritic+Cells+(pDCs)+in+Human+Th1-Mediated+Type+1+Diabetes:+pDCs+Augment+Th1+Responses+through+IFN-alpha+Production.">Increased IFN-alpha-Producing Plasmacytoid Dendritic Cells (pDCs) in Human Th1-Mediated Type 1 Diabetes: pDCs Augment Th1 Responses through IFN-alpha Production.</a> Journal of immunology. 193, 1024-1034 (2014).</li><li>Hervas-Stubbs, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+but+not+plasmacytoid+dendritic+cells+foster+the+systemic+virus-induced+type+I+IFN+response+needed+for+efficient+CD8+T+cell+priming.">Conventional but not plasmacytoid dendritic cells foster the systemic virus-induced type I IFN response needed for efficient CD8 T cell priming.</a> Journal of immunology. 193, 1151-1161 (2014).</li><li>Manry, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+genetic+dissection+of+human+interferons.">Evolutionary genetic dissection of human interferons.</a> The Journal of experimental medicine. 208, 2747-2759 (2011).</li><li>Chen, J., Baig, E., Fish, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+relatedness+among+the+type+I+interferons.">Diversity and relatedness among the type I interferons.</a> Journal of interferon &amp; cytokine research : the official journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 24, 687-698 (2004).</li><li>Fox, B. A., Sheppard, P. O., O'Hara, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+genomic+data+in+the+discovery,+annotation+and+evolutionary+interpretation+of+the+interferon-lambda+family.">The role of genomic data in the discovery, annotation and evolutionary interpretation of the interferon-lambda family.</a> PloS one. 4, e4933 (2009).</li><li>Hillyer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profiles+of+human+interferon-alpha+and+interferon-lambda+subtypes+are+ligand-+and+cell-dependent.">Expression profiles of human interferon-alpha and interferon-lambda subtypes are ligand- and cell-dependent.</a> Immunology and cell biology. 90, 774-783 (2012).</li><li>Schramm, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+quantitative+real-time+polymerase+chain+reaction+array+for+absolute+and+relative+quantification+of+rhesus+macaque+types+I,+II,+and+III+interferon+and+their+subtypes.">High-throughput quantitative real-time polymerase chain reaction array for absolute and relative quantification of rhesus macaque types I, II, and III interferon and their subtypes.</a> Journal of interferon &amp; cytokine research : the official journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 32, 407-415 (2012).</li><li>Wang, Q., Chen, L., Long, Y., Tian, H., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+beacons+of+xeno-nucleic+acid+for+detecting+nucleic+acid.">Molecular beacons of xeno-nucleic acid for detecting nucleic acid.</a> Theranostics. 3, 395-408 (2013).</li><li>Little, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification-refractory+mutation+system+(ARMS)+analysis+of+point+mutations.">Amplification-refractory mutation system (ARMS) analysis of point mutations.</a> Current protocols in human genetics / editorial board, Jonathan L. Haines ... [et al.]. 9 (Unit 9 8), (2001).</li></ol>

VPM and RLR are co-inventors of the technology to measure expression of IFN- and IFN- subtypes and derive royalty income from it. The remaining authors declare no conflict of interest.

Dieser Bericht beschreibt Design, Chargenproduktion, und einen Ansatz zur Analyse eines Assays, um die Transkription einer Reihe von sehr ähnlichen Genen in einer Forschungslaborumgebung zu messen. Die Hochdurchsatz-qRT-PCR Assay die hier berichtet misst die IFN- und - λ-Subtypen mit hoher Spezifität. Bei diesem Verfahren werden zwei wichtige Aspekte, die Gestaltung von Pr / Pb-Sets, die zwischen den Mitgliedern einer homologen Genfamilie und der Entwicklung einer Produktionsplattform für die Erstellung von zuverlässigen und konsistenten 384er Testplatten mit den Pr / Pb-Sets vorinstalliert diskriminieren. Die qRT-PCR-Sonden enthalten einen strukturellen (MB) oder chemische (LNA) Ansatz zur Verbesserung ihrer Spezifität 29. Für zwei der Primersätze in Rhesus Assay (Tabelle 2) wurde die Amplifikation Refractory Mutation System (ARMS) in die Primersequenzen enthalten, um die Spezifität weiter zu verbessern 30. Zwar ist es in der Regel am besten, Exon-Exon-Verbindungen zu ENHA Zielnz Spezifität eines qRT-PCR-Reaktion war das nicht möglich, weil der Typ I IFN-Gene fehlen Introns. Daher wird genomische DNA in die PCR-Reaktion amplifiziert werden, und müssen von einer DNase-Behandlung nach der RNA-Extraktion beeinträchtigt werden. Die Zielregion für die Pr / Pb Sets wurde zu den codierenden Regionen der reifen Peptids für jede IFN beschränkt. Aufgrund der hohen Sequenzähnlichkeit zwischen den IFN-α-Subtypen, insbesondere der reifen Peptidregion, war es manchmal erforderlich, um die Empfindlichkeit zu beeinträchtigen, um die Spezifität sicherzustellen. Dies war insbesondere der Fall bei IFN-α17, wo das reife Peptid Transkript hat nur vier einzigartigen Basen, wenn gegen die anderen IFN-α-Subtypen verglichen. Targeting IFN-α17 erforderlich Primern, die Transkripte mehrerer Subtypen binden, Einschränkung Spezifität der Sonde. Als Folge davon wird die PCR-Reaktion anderen Subtypen als IFN-α17 verstärken, wodurch ein wesentlicher Prozentsatz der PCR-Reagenzien und loweri aufwendigng die Amplitude des Fluoreszenzsignals aus der spezifischen Sonde für IFN-α17. Eine zusätzliche Herausforderung zur Gestaltung von sensitiven und spezifischen Pr / Pb-Sets für sehr ähnliche Gene wie dem IFN ist die Möglichkeit, dass die annotierte Sequenzen in der GenBank-Datenbank möglicherweise nicht vollständig oder Informationen zum Zeitpunkt der Konstruktion. Auch dies war eine Herausforderung für die IFN-α17, in denen neu kommentierte Sequenzen nicht perfekt mit der Version der Sequenz in der Datenbank zum Zeitpunkt der Konstruktion anzupassen. Daher bei der Gestaltung Pr / Pb-Sets für Gene, die nicht intensiv untersucht haben, ist es ratsam, regelmäßig die neuesten kommentierte Sequenz eines Zielgens. Schließlich ist es notwendig, sicherzustellen, dass die Pr / Pb Sätze nicht Pseudogene, die transkribiert werden kann, aber nicht umge amplifizieren. Nach der Entwicklung der Pr / Pb-Sets, ist die nächste Herausforderung Optimierung der PCR-Bedingungen von siebzehn verschiedenen Pr / Pb oder setzt auf einer 384-Well-Platte. Transcript Standards sind wich-tant bei der Prüfung der Spezifität eines Pr / Pb-Set und eine wesentliche Rolle bei der Harmonisierung der qRT-PCR-Bedingungen der zahlreichen verschiedenen PCR-Reaktionen. Testen eines Pr / Pb-Set gegen die Niederschrift Standards stellt seine Effizienz und Empfindlichkeit; Plasmide, die sehr ähnliche Pseudo ausdrücken kann notwendig sein, um sicherzustellen, dass die Pr / Pb gesetzt misst selektiv die Transkription des funktionalen Gens. Die Niederschrift Standards bieten auch ein quantitatives Mittel der Analyse (Zahl der Transkripte), zusätzlich zu den semi-quantitative Analyse relativ zu einem Housekeeping-Gen (ΔCq). Roboterkanalpipetten aus einer 96-well Quellenplatte in mehrfache 384-well-Assayplatten verbessert die Genauigkeit und Konsistenz der Plattenzwischenergebnisse. Lachssperma-DNA (ssDNA) als Träger, die stabilisiert und bewahrt die Pr / Pb-Sets für die Langzeitlagerung verwendet, ebenso wie das Trocknen der Reagenzien in den Platten entfallen. Trocknen der Platten verringert auch das Volumen des Reaktionserforderlich für reproduzierbare Ergebnisse, was wiederum bewahrt wertvollen Proben und verringert die Verwendung von teuren Reagenzien. Durch diese Schritte werden Chargen von Platten montiert, die Präzision und Konsistenz für mehr als sechs Monate ist. Nach Plattenherstellung, sind Maßnahmen zur Qualitätskontrolle entscheidend für die Konsistenz einer Charge von Platten zu überprüfen. Zu diesem Zweck sind vier zusätzliche Sätze von Standards auf einer Platte laufen. Die &quot;5-fach Standard&quot; Platte verfolgt Leistung und erzeugt eine Datenmenge, auf die Standards eines Individuums Schild verglichen. Während zehn 10-fache Verdünnungen jeder Standard in Assay-Design verwendet werden, erfordern Platzgründen, dass vier Punkte für die Standardkurve auf jeder Testplatte für die 5-fach Standard-Platte verwendet, und. Zusätzlich sollte eine positive Kontrolle auf jeder Platte enthalten sein, um die Gültigkeit der Platte zu gewährleisten. In der Regel dauert es 3-4 Stunden bis sechs Testplatten von einer Pr / Pb s vorbereitenource Platte; es ist möglich, zwölf Platten an einem einzigen Tag in einem Forschungslabor vorzubereiten. Da jeder humanen IFN-Subtyp Assayplatte untersucht siebzehn Pr / Pb-Sets und kann fünfzehn experimentellen Proben unterzubringen, ein Tag der Montage entsteht ein Stapel von Platten mit einer Kapazität bis zu 3.060 experimentellen Datenpunkte generieren. Rohdaten aus der qRT-PCR-Plattform bearbeitet werden können und mit der Programmierung Skripte in einem Tabellenkalkulationsprogramm-Software, um eine vordefinierte Analysevorlage automatisch füllen montiert. Diese Methode minimiert praktische Dateneingabe, wodurch verhindert wird, Kopierfehler und erlaubt es dem Forscher, auf die Datenanalyse, anstatt Daten Montage konzentrieren. Wie hier beschrieben, kann diese Hochdurch qRT-PCR-Assay verwendet, um die Expression von Interferon-Subtypen in der Human- oder Rhesusaffe Proben zu messen und könnte angepasst werden, dass andere Arten oder homologe Gene-Sets verwendet werden. Die Flexibilität des Plattenlayout kann der Benutzer ändern Primer / Sonde setzt, um die Gene von SchneiderInteresse zu einem bestimmten Zelltyp oder Modellsystem. Dieser Assay kann verwendet werden, um IFN-Expression Signaturen in Zellkulturmodellen studiert Pathogenen oder in Patientenproben im Rahmen des Erkrankungsmodellen gemessen, um die Signalmechanismen, die an der Immunantwort beteiligt aufzuklären.

Typ I und Typ III-Interferone (IFN) sind kritisch bei der Immunantwort auf Viren und anderen pathogenen Stimuli und Zeit in allen Vertebraten 1. Immun- und Nicht-Immun-Zellen zu exprimieren und sezernieren, aber auch reagieren auf, IFN 2. Angeborenen Immunsensoren, wie Toll-like Rezeptoren (TLR), STING und RIG-I, induzieren Typ I und III IFN-Expression bei Erkennung pathogen associated molecular patterns (PAMP) 3,4. Beim Menschen Typ I IFN umfassen IFN-β, -ω, -κ und 12 Subtypen von IFN-α und binden an den IFNAR1 / IFNAR2-Rezeptorkomplex 2,5. Typ III IFN gehören IFN-λ1, -λ2 und -λ3 und auf die IL10RB / IL28RA Rezeptor-Komplex 2 zu binden. Klassisch, Typ I und III IFN binden an ihren jeweiligen Rezeptor-Komplexe, die dann rekrutieren STAT1 / STAT2 Heterodimere und die Transkription der Interferon-stimulierte Gene (ISG) 6. ISG in ein breites Spektrum von Funktionen beteiligt, von antiviralen und antiproliferative Aktivität zur Aktivierung der adaptiven Immunantwort. 7 Die zahlreichen Mechanismen Krankheitserreger entwickelt haben, um zu entgehen, unterlaufen, und die Entführung von Elementen der IFN-Signalweges zeigen die Bedeutung von IFN in der angeborenen Immunantwort 8. Zum Beispiel Vaccinia-Virus exprimiert ein Köder-Rezeptor mit IFNAR1 Homologie, die Typ-I-IFN 9 während ein Yaba-like disease virus sondert ein Glykoprotein, das Typ I und III IFN Proteine ​​hemmt 10 maskiert. Zusätzlich zu ihrer Rolle bei der Verteidigung des Wirts werden IFN auch in Krebsüberwachung und einer Reihe von Auto-entzündlichen Erkrankungen in Verbindung gebracht: Silencing von IFN-Expression in Brustkrebs-Zellen einschränkt immunosurveillance 11 ist eine Überproduktion von IFN-α ein Mechanismus in der Entwicklung von systemischer Lupus erythematodes 12 und fehlerhafte Aktivierung des STING führt zu systemischen Entzündung durch übermäßige Mengen von IFN in STING-assoziierten Vaskulopathie verursacht13. Therapeutisch IFN verwendet werden, um Multiple Sklerose zu behandeln 14, chronischen Virusinfektionen, wie HBV 15 und HCV 16,17 und Krebsarten, wie Haarzellenleukämie 18 und chronischer myeloischer Leukämie 19. Fragen über den Stellenwert von IFN in einem bestimmten physiologischen Prozess zeigen kontinuierlich die allgegenwärtige Natur dieser Zytokin-Familie. Typ-I-IFN, insbesondere der IFN-α-Subtypen, werden häufig als eine Einheit 20-23, anstatt als eine Gruppe von eng verwandten, aber verschiedene Proteine ​​betrachtet. Die Existenz und die Persistenz von mehreren IFN-Spezies einschließlich der IFN-α-Subtypen, ganz der Wirbeltierevolution 24 wird vorgeschlagen, dass zumindest eine Teilmenge dieser Subtypen spezifische oder spezielle Funktionen. Es ist möglich, dass die Festlegung Muster IFN Ausdruck wird zu entschlüsseln und zur Charakterisierung der spezifischen Funktionen von einem oder mehreren der Subtypen 17. Die Herausforderung des Studiums ter I und III IFN Subtypen geben auf ihrer gemeinsamen Sequenzidentität zu Grunde: die zwölf IFN-α-Subtypen teilen&gt; 50% 25 und die IFN-λ-Subtypen Aktien 81-96% 26 ihrer Aminosäuresequenzen. In der beschriebenen qRT-PCR-Assay, Molecular Beacons (MB) und die Locked Nucleic Acid (LNA) Fluoreszenzsonden unterscheiden einzigen Basenpaar Unterschiede zwischen den in hohem Maße ähnlich IFN-Subtyp-Sequenzen und ermöglichen die Charakterisierung der IFN-Expression Signatur. 384-Well-Plattenformat des Assays umfasst sowohl quantitative (transcript-Standards) und semi-quantitative (die Haushaltsgene (HKG)) Maßnahmen, was eine Analyse durch Transkript Kopienzahl und ΔCq auf. Batch Montage, durch automatisierte Mehrkanalpipetten, und die Langzeitlagerung, möglich durch das Trocknen der Primer / Probe (Pr / Pb) erleichtert setzt auf den Platten, erhöhen die Reproduzierbarkeit, Nutzen und Praxistauglichkeit des Assays. Dieses Protokoll beschreibt den Prozesszur Herstellung von 384-Well-qRT-PCR-Platten (1) mit bis zu siebzehn verschiedenen Pr / Pb Sätze Targeting human IFN-Subtypen (Tabelle 1). Pr / Pb eingestellt Arbeits Lager Quelle Platten (Bild 2) werden verwendet, um mehrere 384-Well-Assayplatten in einem Prozess, der mit Hilfe eines Roboter-Mehrkanalpipette automatisiert werden kann vorzubereiten. Während die anfängliche Schwerpunkt lag auf der Erstellung eines Protokolls für das Studium der menschlichen IFN-Expression Signaturen hat sich diese Methode, um Rhesusaffen als auch angewendet. Obwohl die Plattenlayouts sind etwas anders und die Pr / Pb Sätze (Tabelle 2) unterscheiden, ist die Gesamtherstellungsverfahren für die Erstellung der menschlichen und Rhesus-Platten identisch. Mit minimalen Modifikationen des Protokolls kann das Verfahren ausgeführt werden, um für die Entwicklung von Assays für andere Gruppen von eng verwandten Genen zu untersuchen erlaubt. Siehe 1 und 2 unten Siehe Tabellen 1 und 2 Below

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1824">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;"></td>
			<td style="width:668px;"></td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:531px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.2mL PCR Tube Strips&#160;</td>
			<td>Eppendorf (Westbury, NY, USA)</td>
			<td>E0030 124 286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 0.5-12.5uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>14-387-139</td>
			<td>*Discontinued</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 1-30uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>14-387-137</td>
			<td>*Discontinued</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">12-channel Electronic Pipette, 5-250uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td style="width:141px;">14-387-118</td>
			<td>*Discontinued</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2.0mL Micro Centrifuge tube, sterile</td>
			<td>Celltreat Scientific Products (Shirley, MA, USA)</td>
			<td>229446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">8-channel Electronic Pipette, 15-1250uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>14-387-115</td>
			<td>*Discontinued</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Disposable Reagent Reservoirs&#160;</td>
			<td>VWR International (Radnor, PA, USA)</td>
			<td>89094-668</td>
			<td>25mL reservoirs with 2 dividers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">E-Centrifuge</td>
			<td>Wealtec Corp. (Sparks, NV, USA)</td>
			<td>1090003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Eukaryotic 18S rRNA (18S)</td>
			<td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td>
			<td>Hs99999901_s1</td>
			<td>Rhesus HKG Primer/probe set</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fixed Speed Mini Vortexer</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>02-215-360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gas Permeable Adhesive Plate Seal</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>AB-0580</td>
			<td>Disposable plate seal used during the plate preparation process&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)</td>
			<td>FBR (Silver Spring, MD, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td>Human HKG Primer/probe set</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)</td>
			<td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td>
			<td>Rh02621745_g1</td>
			<td>Rhesus HKG Primer/probe set</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hudson Solo automated multichannel pipettor&#160;</td>
			<td>Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA)</td>
			<td>800200</td>
			<td>Modified with a 384-well cooling nest</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Linearized plasmids (IFN genes)</td>
			<td>Aldevron (Fargo, ND, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td>Item 3000, 3580; used for assay standards&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LNA inhibitors</td>
			<td>Exiqon (Woburn, MA, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td>Item 500100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LNA Probes</td>
			<td>Sigma-Proligo (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td>Material number VC00023</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrix Filtered Pipet Tips, 12.5uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>14-387-193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrix Filtered Pipet Tips, 30uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>14-387-196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 1250uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>14-387-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 250uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>14-387-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode</td>
			<td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td>
			<td>4309849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate</td>
			<td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td>
			<td>N8010560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td>
			<td>4311971</td>
			<td>Adhesive film used for sealing the plate prior to the qRT-PCR run&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microsoft Excel 2010 Spreadsheet</td>
			<td>Microsoft (Redmond, WA, USA)&#160;</td>
			<td>Office 2010</td>
			<td>Visual Basic programming language&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MixMate Vortex Mixer</td>
			<td>Eppendorf (Westbury, NY, USA)</td>
			<td>5353 000.014</td>
			<td>2 dimensional plate vortex apparatus</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Molecular Beacon Probes</td>
			<td>FBR (Silver Spring, MD, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes</td>
			<td>Eppendorf (Westbury, NY, USA)</td>
			<td>Z606634-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plate Dryer (manifold)</td>
			<td>Mechanical and Electrical Design Fabrications, NIH Office of Research Services (Bethesda, MD, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primer sets</td>
			<td>FBR (Silver Spring, MD, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pUC57 plasmid DNA</td>
			<td>Genescript (Piscataway, NJ, USA)</td>
			<td>SD1176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rnase-Free 1.5mL Microfuge Tubes</td>
			<td>Life Technologies (Grand Island, NY, USA)</td>
			<td>AM12400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase-free DNase Set (50)</td>
			<td>Qiagen (Valencia, CA, USA)</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase H</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswitch, MA, USA)</td>
			<td>M0297L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNeasy Mini Kit (250)</td>
			<td>Qiagen (Valencia, CA, USA)</td>
			<td>74106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Robot Tips (clear tip pre-sterilized pipet tips)</td>
			<td>Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA)</td>
			<td>800350-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Salmon Sperm DNA Solution</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)</td>
			<td>15632-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SoftLinx Version V</td>
			<td>Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td>Software for programming pipetting steps</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2x), no AmpErase UNG</td>
			<td>Life Technologies (Grand Island, NY, USA)</td>
			<td>4352042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ABgene Adhesive Plate Seals&#160;&#160;</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>AB0580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">Ubiquitin C (UBC)</td>
			<td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td>
			<td>Hs01871556_s1</td>
			<td>Human HKG Primer/probe set</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Verso cDNA synthesis Kit</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>AB1453B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ViiA 7 Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td>
			<td>4453536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water-Ultra Pure</td>
			<td>Quality Biological, INC. (Gaithersburg, MD, USA)</td>
			<td>351-029-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zipvap 384 (plate dryer heating element)</td>
			<td>Glas-Col LLC (Terre Haute, IN, USA)</td>
			<td>384-109A</td>
			<td>Plate Dryer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput quantitative real-time rt-pcr assay for determining expression profiles of types i and iii interferon subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

Die qRT-PCR-Assay beschrieben implementiert werden, um die Expressionsmuster der Typen I und III IFN in einer Vielzahl von Zelltypen und Kontexte zu analysieren. So wurden beispielsweise menschlichen Typ I und III IFN Expression Signaturen in peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) von 6 Spendern stimuliert mit TLR-Liganden untersucht; Poly I: C (25 ug / ml), LPS (10 ng / ml), Imiquimod (10 uM) und CpG-Oligonukleotide (1 uM) (Figur 4). Die Daten wurden unter Verwendung eines Tabellenkalkulationsanwendungsprogramm analysiert und als Netzdiagramme mit den IFN-α-Subtypen gemß dem phylogenetischen Baum ihrer Proteinsequenz 27 im Uhrzeigersinn angeordnet dargestellt. Die Radardiagramme des menschlichen IFN-Expression in einer Berechnung mit den zwei verschiedenen Analyseverfahren in das Assaydesign integriert logarithmischen Skala dargestellt: absolute Cq Wert HKG (ΔCq) normalisiert, und die Kopienzahl der Vorlage pro Mikrogramm (ug) der Gesamt-RNA . Kopienzahl-Werte werden von der Ergebnisse o berechnet<html> Standardkurve fa Transkript ist. Die Daten zeigen, dass das menschliche IFN-Expression Signaturen von TLR-Agonisten hervorgerufen sind Liganden spezifisch. Siehe Abbildung 4 unten Was die menschliche IFN-Expression Signaturen gezeigt, Ausdruck Unterschriften von Typ I und III IFN in Rhesusaffen waren ebenfalls TLR-Liganden spezifisch. C (50 ug / ml), LPS (10 ug / ml), Imiquimod (10 ug / ml) für 3 Stunden (Figur 5): PBMC von 3 Spendern wurden mit Poly I stimuliert. IFN-Subtyp Ausdruck in unstimulierten Zellen zu Beginn der Studie war gering. C: Eine begrenzte Anzahl von IFN- Subtypen wurden als Reaktion auf LPS und Poly I ausgedrückt. Im Gegensatz dazu IFN-Expression in Reaktion auf Imiquimod war hoch und der Subtyp Ausdruck war breit. Die Expression von IFN-β und IFN-λ1 wurde verbessert, indem alle drei TLR-Agonisten 28. Siehe Abbildung 5 unten immer &quot;&gt; <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52650/52650fig1.jpg" /> Abb. 1: Das Layout für eine 384-Well-Testplatte mit siebzehn Pr / Pb-Sets Zielzahl bezieht sich auf eine Pr / Pb-Set. Die Vierpunkt-Standardkurven (dunkelgrau Dreieck) werden die Spalten 1-5 aufgenommen. Die HKG Pr / Pb Sätze (weißer Hintergrund) werden den Spalten 6 und 7. Die verbleibenden Spalten 8-24 aufgenommen, sind spezifisch für eine der siebzehn Pr / Pb-Sets. Die Proben werden auf Zeilen AP aus den Spalten 6-24 (schwarze Pfeile) zugegeben. Die beiden Bohrungen (O5, P5) am unteren Rand des Spalte 5 erhalten nur Wasser und Master-Mix. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52650/52650fig2.jpg" /> Abb. 2: Das Layout für ein 96-Loch-Source-Platte mit siebzehn Pr / Pb-Sets Zielzahl bezieht sich auf eine Pr / Pbgesetzt. Schwarze Pfeile zeigen, wenn ein Pr / Pb-Set ist mit mehreren Vertiefungen gegeben. NTC-Mischungen in die Kavitäten pipettieren (dunkelgrau Hintergrund) aufgenommen. Die beiden Bohrungen (F3, G3) mit diagonalen Linien werden nicht verwendet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52650/52650fig3.jpg" /> Abbildung 3: Schematische Darstellung der einzelnen Schritte in der qRT-PCR Assay-Protokoll AE Diagramm wählen Teile des Protokolls.. (A) Schritt 1: Herstellung der Standardverdünnungsreihen. (B) Schritt 2: Herstellung von Pr / Pb und NTC Arbeitsstammmischungen. (C) Schritt 3.1: Herstellung einer 96-Well-Platte Arbeitsvorräte der Pr / Pb-Sets und NTC Mischungen. (D) Schritt 4.1-3: Herstellung der Mischungen für das Laden der 384-Well-Testplatte. (Estep 4.5: Laden des 384-Well-Assayplatte. Zeichnungen sind von links oben nach rechts unten zu lesen. Reagenzien für die Interferon (IFN) Assay bei -20 ° C gelagert und sind in der linken Spalte aufgelistet ist; Linien separate Aktionen im Protokoll. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650fig3highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="4" src="/files/ftp_upload/52650/52650fig4.jpg" /> Abbildung 4: Das IFN-Expression Signatur in peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) menschliche unterscheidet sich in Abhängigkeit von den für die Stimulation verwendeten PBMCs wurden mit TLR-Liganden stimuliert, und RNA wurde nach qRT-PCR-Analyse geerntet TLR-Liganden.. Die geometrischen Mittel der Peak-Antworten zu Poly I: C (25 ug / ml) auf 8 h (rote Quadrate), LPS (10 ng / ml) bei 4 h (grüne Dreiecke), Imiquimod (10 uM) bei 16 h ( lila Diamanten), CpG (1 uM) an16 Stunden (schwarze Kreise), und nicht-stimulierten Kontrolle bei 16 Stunden (blaue Kreise) von 6 Spendern werden in log 10 Skala als Funktion der Ausdruck der HKG UBC ΔCq (links) gezeigt, oder als Kopienzahl pro ug RNA (rechts) . IFN-α-Subtypen werden nach der phylogenetischen Plot der Aminosäuresequenzähnlichkeit geordnet. Diese Zahl wurde ursprünglich in Immunologie und Zellbiologie 27 veröffentlicht. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/52650/52650fig5.jpg" /> Abb. 5: Die Rhesusaffen IFN-Expression Signatur in peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) unterscheidet sich in Abhängigkeit von den für die Stimulation von PBMC drei Rhesusaffen (durch das Quadrat, Diamant und Dreieck bezeichnet) verwendet TLR-Liganden wurden aus Vollblut isoliert und C (50 ug / ml) oder Imiquimod (10 ug / ml): mit Lipopolysaccharid (LPS) (10 ug / ml), Poly-I stimuliert. Die Zellen wurden bei 0 h geerntet (open Formen) oder nach 3 h von TLR-Stimulation (geschlossene Form) zur Messung der IFN-Expression. Transcript Ebenen des Typs I, II, und III IFN in log 10 Skala als Funktion der Ausdruck der HKG GAPDH ΔCq (links) oder als Kopiernummer / ug RNA (rechts) angezeigt. Diese Zahl wurde ursprünglich in der Zeitschrift der Interferon und Zytokin-Forschung 28 veröffentlicht. <img alt="Tabelle 1" fo:content-="" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52650/52650table1.jpg" width="700" /> Tabelle 1:. Menschen IFN Primer / Sonden-Set Sequenzen und Reaktionsinformationen <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650table1.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.</a> <img alt="Tabelle 2" fo:content-="" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52650/52650table2.jpg" width="700" /> Tabelle 2:. Rhesusaffe IFN Primer / Sonden-Set Sequenzen und Reaktionsinformationen <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650table2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> Plasmid-Konzentration (fM) </td></tr><tr><td></td><td> A </td><td> B </td><td> C </td><td> D </td></tr><tr><td> IFN-α1 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0,25 </td><td> 0,025 </td></tr><tr><td> IFN-α2 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0,25 </td><td> 0,025 </td></tr><tr><td> IFN-α4 </td><td> 2500 </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> IFN-α5 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0,25 </td><td> 0,025 </td></tr><tr><td> IFN-α6 </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td>0,25 </td></tr><tr><td> IFN-α7 </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0,25 </td></tr><tr><td> IFN-α8 </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0,25 </td></tr><tr><td> IFN-α10 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0,25 </td><td> 0,025 </td></tr><tr><td> IFN-α14 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0,25 </td><td> 0,025 </td></tr><tr><td> IFN-α16 </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0,25 </td></tr><tr><td> IFN-α17 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0,25 </td><td> 0,025 </td></tr><tr><td> IFN-α21 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0,25 </td><td> 0,025 </td></tr><tr><td> IFN-λ1 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0,25 </td><td> 0,025 </td></tr><tr><td> IFN-λ2 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0,25 </td><td> 0,025 </td></tr><tr><td> IFN-λ3 </td><td>250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0,25 </td></tr><tr><td> IFN-β </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0,25 </td><td> 0,025 </td></tr><tr><td> IFN-ω </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0,25 </td></tr></tbody></table> Tabelle 3: Standardverdünnung Satz Konzentration Informationen. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> IFN Pr / Pb-Sets hinzugefügt </td><td> Wassermenge aufgenommen (ml) </td></tr><tr><td> NTC 1 </td><td> IFN-β, -ω, -λ3 </td><td> 85,7 </td></tr><tr><td> NTC 2 </td><td> IFN-α1, -α5 </td><td> 100,0 </td></tr><tr><td> NTC 3 </td><td> IFN-α2 </td><td> 114,3 </td></tr><tr><td> NTC 4 </td><td> IFN-α4 </td><td> 114,3 </td></tr><tr><td> NTC 5 </td><td> IFN-α7 </td><td> 114,3 </td></tr><tr><td>NTC 6 </td><td> IFN-α6, -α8, -α10 </td><td> 85,7 </td></tr><tr><td> NTC 7 </td><td> IFN-α14, -α16 </td><td> 100,0 </td></tr><tr><td> NTC 8 </td><td> IFN-α17 </td><td> 114,3 </td></tr><tr><td> NTC 9 </td><td> IFN-α21, -λ1 </td><td> 100,0 </td></tr><tr><td> NTC 10 </td><td> IFN-λ2 </td><td> 114,3 </td></tr></tbody></table> Tabelle 4: NTC Arbeits Lager mischt Informationen.

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High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

Hochdurchsatz-quantitative Echtzeit-RT-PCR-Assay zur Bestimmung Expressionsprofile der Typen I und III Interferon-Formationsglieder

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

high-throughput-quantitative-real-time-rt-pcr-assay-for-determining

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.2K Aufrufe.  US Food and Drug Administration. This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible. 

Serie: High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

Quantitative High-throughput Single-cell Zytotoxizitätstest für T-Zellen

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to extrapolate viral replication fitness, ranging from the number of viral particles per infectious unit, growth rate in cell culture, and relative fitness derived from multiple-cycle growth competition assays. Growth competition assays provide a particularly sensitive measurement of fitness since the viruses are competing for cellular targets under identical growth conditions. There are several experimental factors to consider when conducting growth competition assays, including the multiplicity of infection (MOI), sampling times, and viral detection and fitness calculation methods. Each factor can affect the end result and hence must be considered carefully during the experimental design. The protocol presented here includes steps from constructing a new recombinant HIV-1 clone to performing growth competition assays and analyzing the experimental results. This protocol utilizes experimental parameter values previously shown to yield consistent and robust results. Alternatives are discussed, as some parameters need to be adjusted according to the cell type and viruses being studied. The protocol contains two alternative viral detection methods to provide flexibility as the availability of instruments, reagents and expertise varies between laboratories.

Growth competition between nearly isogenic viruses provides a sensitive measurement for determining relative replication fitness. The protocols described here include the construction of recombinant HIV-1 clones, virus propagation and growth competition and analysis methods optimized to yield sensitive and consistent results.

Paarweise Wachstum Wettbewerb Assay zur Bestimmung der Replication Fitness von Human Immunodeficiency Viruses

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require several additional experimental steps prior to readout, such as cell lysis, colony forming unit determination, or reagent addition. When performing thousands of assays, for example, during high-throughput screening, the downstream effort required for these types of assays is considerable. Therefore, to facilitate high-throughput antimicrobial discovery, we developed a real-time assay to simultaneously identify inhibitors of intracellular bacterial growth and assess eukaryotic cell cytotoxicity. Specifically, real-time intracellular bacterial growth detection was enabled by marking bacterial screening strains with either a bacterial lux operon (1st generation assay) or fluorescent protein reporters (2nd generation, orthogonal assay). A non-toxic, cell membrane-impermeant, nucleic acid-binding dye was also added during initial infection of macrophages. These dyes are excluded from viable cells. However, non-viable host cells lose membrane integrity permitting entry and fluorescent labeling of nuclear DNA (deoxyribonucleic acid). Notably, DNA binding is associated with a large increase in fluorescent quantum yield that provides a solution-based readout of host cell death. We have used this combined assay to perform a high-throughput screen in microplate format, and to assess intracellular growth and cytotoxicity by microscopy. Notably, antimicrobials may demonstrate synergy in which the combined effect of two or more antimicrobials when applied together is greater than when applied separately. Testing for in vitro synergy against intracellular pathogens is normally a prodigious task as combinatorial permutations of antibiotics at different concentrations must be assessed. However, we found that our real-time assay combined with automated, digital dispensing technology permitted facile synergy testing. Using these approaches, we were able to systematically survey action of a large number of antimicrobials alone and in combination against the intracellular pathogen, Legionella pneumophila.

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

Hoher Durchsatz, Echtzeit, Doppel-Ausleseprüfung intrazellulärer antimikrobieller Aktivität und eukaryotischen Zelle Zytotoxizität

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

Ein Fluoreszenz-basierte Lymphocyte Assay geeignet für Hochdurchsatz-Screening von kleinen Molekülen

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

Bead Based Multiplex Assay for Analysis of Tear Cytokine Profiles

Tear film is a complex mixture of lipids, proteins and minerals which covers the external surface of the eye, thereby providing lubrication, nutrition and protection to the underlying cells. Analysis of tears is an emerging area for the identification of biomarkers for the prediction, diagnosis, and prognosis of various ocular diseases. Tears are easily accessible and their collection is non-invasive. Therefore, advancing technologies are gaining prominence for identification of multiple analytes in tears to study changes in protein or metabolite composition and its association with pathological conditions. Tear cytokines are ideal biomarkers for studying the health of the ocular surface and also help in understanding the mechanisms of different ocular surface disorders like dry eye disease and vernal conjunctivitis. Bead based multiplex assays have the capability of detecting multiple analytes in a small amount of sample with a higher sensitivity. Here we describe a standardized protocol of tear sample collection, extraction and analysis of cytokine profiling using a bead based multiplex assay.

Analysis of tear film cytokines helps in studying various ocular diseases. Bead based multiplex assays are simple and sensitive and enable the testing of multiple targets in samples with small volumes. Here we describe a protocol for tear film cytokine profiling a using bead based multiplex assay.

Wulst basierte Multiplex-Assays für die Analyse der Träne Cytokine Profile

Tear film is a complex mixture of lipids, proteins and minerals which covers the external surface of the eye, thereby providing lubrication, nutrition and ...

Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning

We describe here a protocol for the label-free identification of lymphocyte subtypes using quantitative phase imaging and machine learning. Identification of lymphocyte subtypes is important for the study of immunology as well as diagnosis and treatment of various diseases. Currently, standard methods for classifying lymphocyte types rely on labeling specific membrane proteins via antigen-antibody reactions. However, these labeling techniques carry the potential risks of altering cellular functions. The protocol described here overcomes these challenges by exploiting intrinsic optical contrasts measured by 3D quantitative phase imaging and a machine learning algorithm. Measurement of 3D refractive index (RI) tomograms of lymphocytes provides quantitative information about 3D morphology and phenotypes of individual cells. The biophysical parameters extracted from the measured 3D RI tomograms are then quantitatively analyzed with a machine learning algorithm, enabling label-free identification of lymphocyte types at a single-cell level. We measure the 3D RI tomograms of B, CD4+ T, and CD8+ T lymphocytes and identified their cell types with over 80% accuracy. In this protocol, we describe the detailed steps for lymphocyte isolation, 3D quantitative phase imaging, and machine learning for identifying lymphocyte types.

We describe a protocol for the label-free identification of lymphocyte subtypes using quantitative phase imaging and a machine learning algorithm. Measurements of 3D refractive index tomograms of lymphocytes present 3D morphological and biochemical information for individual cells, which is then analyzed with a machine-learning algorithm for identification of cell types.

Markierungsfreie Identifikation von Lymphozyten-Subtypen mit dreidimensionale Quantitative Phase Bildgebung und maschinelles lernen

We describe here a protocol for the label-free identification of lymphocyte subtypes using quantitative phase imaging and machine learning. Identification ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

Ein High-Throughput- Shigella-spezifischen bakterizide Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR for Rabies Diagnosis

Molecular assays are rapid, sensitive and specific, and have become central to diagnosing rabies. PCR based assays have been utilized for decades to confirm rabies diagnosis but have only recently been accepted by the OIE (World Organisation for Animal Health) as a primary method to detect rabies infection. Real-time RT-PCR assays provide real-time data, and are closed-tube systems, minimizing the risk of contamination during setup. DNA intercalating fluorochrome real-time RT-PCR assays do not require expensive probes, minimizing the cost per sample, and when the primers are designed in conserved regions, assays that are specific across virus genera rather than specific to just one virus species are possible. Here we describe a pan-lyssavirus SYBR real-time RT-PCR assay that detects lyssaviruses across the Lyssavirus genus, including the most divergent viruses IKOV, WCBV and LLEBV. In conjunction with dissociation curve analysis, this assay is sensitive and specific, with the advantage of detecting all lyssavirus species. The assay has been adopted in many diagnostic laboratories with quality assured environments, enabling robust, rapid, sensitive diagnosis of animal and human rabies cases.

This real-time RT-PCR using dsDNA intercalating dye is suitable to diagnose lyssavirus infections. The method begins with RNA extracted from rabies suspected ante-mortem or post-mortem samples, detailing master mix preparation, RNA addition, setup of the real-time machine and correct interpretation of results.

Pan-lyssavirus Echtzeit RT-PCR für Tollwut-Diagnose

Molecular assays are rapid, sensitive and specific, and have become central to diagnosing rabies. PCR based assays have been utilized for decades to ...

High Throughput Co-culture Assays for the Investigation of Microbial Interactions

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many approaches used for the study of microbial interactions require specialized equipment and are expensive and time intensive. This paper presents a protocol for co-culture interaction assays that are inexpensive, scalable to large sample numbers, and easily adaptable to numerous experimental designs. Microorganisms are cultured together, with each well representing one pairwise combination of microorganisms. A test organism is cultured on one side of each well and first incubated in monoculture. Subsequently, target organisms are simultaneously inoculated onto the opposite side of each well using a 3D-printed inoculation stamp. After co-culture, the completed assays are scored for visual phenotypes, such as growth or inhibition. These assays can be used to confirm phenotypes or identify patterns among isolates of interest. Using this simple and effective method, users can analyze combinations of microorganisms rapidly and efficiently. This co-culture approach is applicable to antibiotic discovery as well as culture-based microbiome research and has already been successfully applied to both applications.

The co-culture interaction assays presented in this protocol are inexpensive, high throughput, and simple. These assays can be used to observe microbial interactions in co-culture, identify interaction patterns, and characterize the inhibitory potential of a microbial strain of interest against human and environmental pathogens.

High Throughput Co-Culture Assays für die Untersuchung mikrobieller Wechselwirkungen

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many ...

High-Throughput Transcriptome Analysis for Investigating Host-Pathogen Interactions

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of the disease.&#160;To study such processes, researchers can use high-throughput sequencing techniques (RNA-seq) that measure the dynamic changes of the host transcriptome at different stages of infection, clinical outcomes, or disease severity.This investigation can lead to a better understanding of the diseases, as well as uncovering potential drug targets and treatments. The protocol presented here describes a complete pipeline to analyze RNA-sequencing data from raw reads to functional analysis. The pipeline is divided into five steps: (1) quality control of the data; (2) mapping and annotation of genes; (3) statistical analysis to identify differentially expressed genes and co-expressed genes; (4) determination of the molecular degree of the perturbation of samples; and (5) functional analysis. Step 1 removes technical artifacts that may impact the quality of downstream analyses. In step 2, genes are mapped and annotated according to standard library protocols.&#160;The statistical analysis in step 3 identifies genes that are differentially expressed or co-expressed in infected samples, in comparison with non-infected ones. Sample variability and the presence of potential biological outliers are verified using the molecular degree of perturbation approach in step 4. Finally, the functional analysis in step 5 reveals the pathways associated with the disease phenotype. The presented pipeline aims to support researchers through the RNA-seq data analysis from host-pathogen interaction studies and drive future&#160;in vitro or in vivo experiments, that are essential to understand the molecular mechanism of infections.

The protocol presented here describes a complete pipeline to analyze RNA-sequencing transcriptome data from raw reads to functional analysis, including quality control and preprocessing steps to advanced statistical analytical approaches.

Hochdurchsatz-Transkriptomanalyse zur Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of ...