Die Autoren möchten Guido Verhoeven und Ludo Deboel, Leuven, die bei der Festlegung der Isolierung von primären Sertoli-Zellen in der Meinhardt-Labor in Gießen waren sehr hilfsbereit zu danken. Monika Fijak, Gießen, ist bekannt für ihre Hilfe bei der 1A und Beratung anerkannt. Die Studien wurden von der Deutschen Forschungsgemeinschaft durch Erteilung BH 93 / 1-1 (SB) und die Finanzierung des International Research Graduiertenkolleg JLU Gießen (Deutschland) / Monash University (Melbourne, Australien) GRK 1871 (SB) unterstützt. Unterstützung wurde auch aus einem Zuschuss des Landes Hessen im Rahmen des Programms &quot;Landes-Offensive zur Entwicklung Wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz&quot; (LOEWE) namens &quot;Männliche Infertilität bei Infektion und Entzündung&quot; (MIBIE) erhalten.

1. Tierethikerklärung Hier beschriebenen Experimente wurden für die Pflege und Verwendung von Tieren zu Versuchszwecken nach den Richtlinien des Regierungspräsidiums Gießen, Deutschland, als die Kommune und bestätigen, um den deutschen Code of Practice durchgeführt (Berechtigungs Nr.: GI 20/23 Nr A 31 / 2012). 2. Herstellung von Medien, Enzymlösungen und Tiere <ol><li> Bereiten 1% Jod Alkohol durch Auflösen von 1 g Jod in 100 ml Ethanol. </li><li> Bereiten 2x 500 ml Dulbecco&#39;s phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) ohne Ca 2+ und Mg 2+ ergänzt jeweils mit 7,5 ml D-Glucose (100 g / l) und 5 ml 100x Penicillin / Streptomycin-Stammlösung (15 mg / ml D -Glucose, 50 U / ml Penicillin und 50 ug / ml Streptomycin final). </li><li> Supplement 1x 500 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-Medium mit 5 ml 100x Penicillin / Streptomycin-Stammlösung (50 U / ml Penicillin und 50 ug / ml Streptomycin final). </li><li> Vorbereiten eines Trypsin-DNase I-Lösung (2,5 mg / ml Trypsin und 10 ug / ml DNase I) durch Zugabe von 25 mg Trypsin und 0,1 ml DNase I (1 mg / ml DNase I) auf 9,9 ml PBS. </li><li> Man löst 50 mg Trypsin-Inhibitor in 5 ml PBS für Trypsin Inhibitor eine Lösung (10 mg / ml). Man löst 25 mg Trypsin-Inhibitor in 10 ml PBS für Trypsin Inhibitor B-Lösung (2,5 mg / ml). </li><li> Für eine Collagenase-Hyaluronidase-Deoxyribonuclease I (DNase I) Lösung 10 mg Collagenase A (1 mg / ml final) aufzulösen, 10 mg Hyaluronidase (1 mg / ml final) und 0,1 ml DNase I (1 mg / ml DNase I) ( 10 ug / ml final) in 10 ml PBS. </li><li> Vorbereiten eines Hyaluronidase-DNase I-Lösung durch Zugabe von 10 mg Hyaluronidase (1 mg / ml final) und 0,1 ml DNase I-Lösung (1 mg / ml) (10 &amp; mgr; g / ml final) auf 9,9 ml PBS. </li><li> Bestellen Wistar-Ratten auf Zeit, so dass sie 19 Tage alt am Tag der Sertoli Zellisolierung sind. Hinweis: Das beschriebene Protokoll für 10 Ratten entwickelt, kann aber für mindestens 5 und maximal 20 Ratten modifiziert werden.Die Volumina aller Lösungen müssen entsprechend angepasst werden. </li><li> Bereiten Oil Red O-Stammlösung 0,35 g Oil Red O in 100 ml Isopropanol durch Auflösen. Stir O / N, filtriert durch 0,2 um und lagern bei RT für bis zu einem Jahr. </li><li> Bereiten Oil Red O Färbung Lösung durch Mischen von 6 ml Oil Red O-Stammlösung mit 4 ml Wasser (3: 2). Nach 10-20 min Filter durch 0,2 &amp; mgr; m. Verwenden Sie innerhalb der nächsten 2 Stunden. </li><li> Vorbereiten eines 4% (w / v) Formaldehyd-Lösung in einem belüfteten Haube durch Zugabe von 4 g Paraformaldehyd-Pulver (PFA) zu 80 ml 1x PBS unter leichtem Rühren. Wärme auf ~ 60 ° C, 1 ml 1 M NaOH und weiter gerührt, bis der Paraformaldehyd gelöst ist. den pH-Wert auf 7,4 mit 1 M HCl und das Volumen auf 100 ml mit 1 x PBS lassen die Lösung abgekühlt auf RT, einzustellen. Die Lösung wird filtriert (0,45 &amp; mgr; m) und verwenden frisch oder lagern bei -20 ° C für mehrere Monate. Hinweis: polymerisiertem Formaldehyd (PFA) depolymerisiert zu monomeren Formaldehyd in Wasser. Dieser Prozess istkatalysiert durch moderate Erwärmung und einem leicht alkalischen pH-Wert. Bereiten Sie alle Enzymlösungen frisch und Filter sterilisieren (0,2 uM) sie am Tag der Nutzung. Wenn eines anderen Herstellers für ein Enzym (Materials sehen / Ausrüstung Tabelle) verwendet wird, sorgfältig seine Konzentration / Aktivität einzustellen. In dem folgenden Protokoll ein &quot;Pipette&quot; steht für eine serologische Pipette. </li></ol> 3. Herstellung von Hodenkanälchen <ol><li> Anesthetize 10 männliche Wistar Ratten einzeln in einem Exsikkator mit CO 2 und einer Fließgeschwindigkeit, die mindestens 20% des Kammervolumens pro Minute versetzt. Warten Sie, bis Atemstillstand Test Anästhesie durch einen Fuß-Pad quetschen, und wenn es keine Reaktion, jede Ratte durch Genickbruch einschläfern. Lassen Sie das Blut durch Halsschlagader Schneiden und Halsschlagader (Vagina carotica) unter fließendem Wasser. Desinfizieren Sie den Bauch nach mit 70% Ethanol abwischen. </li><li> Mit einer Pinzette heben Sie die Haut von der Bauch muszeuge und geschnitten, um eine ovale Hautlappen aus, die von der Symphyse bis zum Brustbein (2A) und die Klappe nach oben auf die Brust erweitert. Als nächstes die Bauchmuskeln zu packen und eine mediale Inzision von der Symphyse bis zum Brustbein machen. <ol><li> Drücken Sie den Bauch mit den Daumen von Becken nach oben, um die Hoden aus dem unteren Becken zu schieben. Suchen Sie sich die Nebenhodenfettpolster (2B) mit einer Pinzette zum Herausziehen der Hoden weiter nach oben. Schneiden Sie den Samenstrang (2B), die Tunica albuginea intakt bleibt, und sammeln Sie alle Hoden in 20 ml PBS in einem 50 ml konischen Röhrchen (2C). </li></ol></li><li> Nachdem alle Hoden sammeln, desinfizieren sie durch ein gleiches Volumen (20 ml) von 1% Zugabe (w / v) Jod in Ethanol. Kehren Sie die Röhrchen zweimal und dekantieren sofort den Überstand. Schnell die Hoden waschen zweimal mit 25 ml PBS jeder (2D). </li><li> Übertragen Sie die Hoden in eine Petrischale enthaltening 15 ml PBS (2E). Fassen Sie jeden Hoden fest mit einer Zange an einem Ende einen kleinen Schnitt in der Tunica albuginea am entgegengesetzten Ende zu machen, und drücken Sie die Röhrchen mit geschlossenen Scherenblätter als Schaber. Anmerkung: Die Röhrchen noch eine kompakte Hoden förmigen Bündel mit nur wenigen Tubuli sich in die Lösung, um sein sollten homogene enzymatische Verdauung (2F) zu ermöglichen. </li><li> Übertragen Sie die de-verkapselte Hoden auf eine 100 ml Flasche mit Schraubverschluss mit 10 ml Trypsin-DNase I-Lösung. Führen Sie die Verdauung in einem geschüttelten Wasserbad bei 32 ° C (120 Schwingungen / min). Nach 4 bewerten min die Tubuli mit dem bloßen Auge für Dispersion von Tubuli. Sobald Tubuli in die Lösung zu dispergieren beginnen, sofort die Verdauung zu stoppen. Falls erforderlich, weiterhin Inkubation für 2 min. </li><li> Stopp Trypsinverdaus durch Zugabe von 5 ml Trypsininhibitorlösung A. Sie die Lösung gut mischen durch Auf-und Abpipettieren 3-4 Mals eine 10 ml Pipette und es zu einem 50 ml konischen Röhrchen übertragen. </li><li> Nach 5 Minuten Inkubation beobachten die Röhrchen durch die Einheit der Schwerkraft absetzen, den Überstand vorsichtig entfernen, indem das 10 ml-Pipette aus Schritt 3.6 verwendet und 10 ml B-Lösung Trypsin-Hemmstoff, um Trypsinverdaus vollständig stoppen hinzuzufügen. Resuspendieren der Tubuli durch Auf- und Abpipettieren 2-3 mal. </li><li> Um waschen jeweils die Tubuli 9 mal mit 25 ml PBS interstitiellen Zellen zu entfernen, zu kontaminieren. Resuspendieren Kanälchen in jedem Waschen durch eine 25 ml Pipette und lassen sie für 10 Minuten mit dem Gerät Schwerkraft absetzen. Verwenden Sie immer die gleichen 25 ml Pipette zum Pipettieren PBS, Aufwirbelung und Entfernung des Überstandes. </li></ol> 4. Ausbau / Isolierung von peritubulären Cells (PTC) <ol><li> Übertragen Sie alle Röhrchen in einen 100 ml Flasche mit Schraubverschluss und fügen Sie den Collagenase-Hyaluronidase-DNase I-Lösung (3A). Führen Verdauung für 10 Minuten in einem Schüttelwasserbad bei 32 ° C (120 Schwingungen / min). </li><li> Pipette ein Tropfen der Suspension auf einen Glasobjektträger und schnell die Tubuli unter einem inversen Lichtmikroskop für Routine-Zellkultur bei 100-facher Vergrößerung prüfen. Wenn die Verdauung für weitere 2 min nicht fortgeschritten genug, um weiterhin Inkubation (nicht die Zeit für die mikroskopische Kontrolle benötigt zählen). Hinweis: Bei diesem Schritt werden alle Tubuli verkürzen sich in Länge und Röhrchens Kanten sollten rau werden (3B und C). Ecken und Kanten sind für die Freisetzung von peritubulären Zellen indikativ. </li><li> Übertragen Sie die Suspension mit verdaut Tubuli zu einem 50 ml konischen Röhrchen, die 25 ml Pipette aus Schritt 3.8 verwenden. Waschen Sie die 100-ml-Flasche mit 10 ml PBS und fügen Sie ihn in der konischen Röhre zu den Tubuli. Lassen Sie die verdaut Tubuli durch Einheit Schwerkraft für 10 Minuten absetzen, und saugen Sie den Überstand vorsichtig, die PTCs enthält, mit dem 25-ml-Pipette wieder, und überträgt es auf eine neue konische Röhrchen. Zum Absaugen der letzten Milliliter mit einem 5-ml-Pipette in order jede Übertragung von Tubuli zu verhindern. </li><li> 20 ml RPMI 1640-Medium, ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS) zu den gesammelten Überständen Röhrchen, mischen und Zentrifugieren bei 300 xg für 10 min bei RT ohne die Unterbrechung mit. </li><li> Überstand vorsichtig dekantieren und die pelletierten PTCs in 20 ml RPMI 1640-Medium mit 10% hitzeinaktiviertem FBS und Samen 4 ml jeweils auf fünf T75-Kolben, die 16 ml Medium jedes ergänzt resuspendieren. Inkubieren bei 37 ° C in 5% CO 2 -Atmosphäre (4A). </li><li> Am 3. Tag der Kultur trypsinize die PTCs und teilen Sie sie 1: 2 am T75-Kolben mit 16 ml RPMI 1640-Medium mit 10% hitzeinaktiviertem FBS jeweils (Ausbeute 10 Flaschen insgesamt) (4B). Weiter Inkubation bei 37 ° C in 5% CO 2 -Atmosphäre. </li><li> Am 5. Tag der Kultur trypsinize die PTCs wieder und platten sie auf 6-Loch-oder 24-Well-Platten je nach Experiment(Eine T75-Flasche pro Platte). Experimente können am Tag 6 durchgeführt werden. </li></ol> 5. Isolierung von Sertoli-Zellen (SCs) <ol><li> Resuspendieren der siedelt Tubuli aus Schritt 4.3 gründlich in 25 ml PBS durch eine 25 ml Pipette und lassen sie für 12 min mit dem Gerät Schwerkraft absetzen. Verwenden Sie die gleiche 25 ml Pipette zum Pipettieren PBS, Aufwirbelung von Tubuli und das Entfernen von Überständen. Wiederholen Sie die Wäsche 3-mal (4 wäscht insgesamt). </li><li> Nach dem letzten Wasch die verdaut Tubuli zu weiteren 100 ml Flasche mit Schraubverschluss, die das Hyaluronidase-DNase I-Lösung übertragen. Führen Sie die Verdauung in einem geschüttelten Wasserbad bei 32 ° C (120 Schwingungen / min). </li><li> Nach 5 Minuten noch einmal überprüfen die Tubuli durch lichtmikroskopische Prüfung bei 100-facher Vergrößerung in Schritt 4.2 beschrieben. Hinweis: Kurze Röhren, röhrenförmige Aggregate und freigesetzten Zellen sichtbar sein soll (3D). <ol><li> Lassen Sie die Rohr Aggregate für 10 Minuten absetzen, und den Überstand aspirieren unsing eine 25 ml Pipette. Waschaggregate 4 mal 25 ml PBS und einer Sedimentationszeit von 10 min für jeden Waschschritt (3E). </li></ol></li><li> In 20 ml RPMI 1640-Medium, und übergeben Sie die Suspension 10-mal durch eine 18 G-Nadel an einer Spritze 20 ml montiert. Vermeiden Sie Luftblasen. Hinweis: Ziehen der Suspension in und durch die Nadel als einem Durchgang betrachtet wird. Die Unterbrechung und Homogenisierung von Zellen durch hydrodynamische Scher ist eine Standardtechnik bei der Herstellung von Zellen, die zur Aggregation neigen. Die Weitergabe von Zellen durch eine Injektionsnadel von kleinen Innendurchmesser ist unwahrscheinlich, einen Einfluss auf ihre funktionellen Eigenschaften zu haben 25. 5C und D die normale Ultrastruktur von gereinigtem Sertoli-Zellen an Tag 4 der Kultur zeigt. <ol><li> Pipette ein Tropfen der Suspension auf einen Glasobjektträger und lassen schnell die Tubuli unter einem umgekehrten Lichtmikroskop für Routine-Zellkultur bei 10-facher Vergrößerung, wenn die aggRegates sind alle (3F) dispergiert. Filtern der Zellsuspension durch ein 70 &amp; mgr; m Zellsieb, um eine reine Einzelzellsuspension in dem Filtrat zu erhalten. </li></ol></li><li> Zentrifuge das Filtrat aus Schritt 5.4 bei 200 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur ohne die Pause verwenden. Überstand vorsichtig absaugen, eine 25 ml-Pipette und die Sertoli-Zellen in 40 ml RPMI 1640-Medium (Serum-freien) resuspendieren. </li><li> Mischen Sie 100 ul Zellsuspension mit 100 ul Trypanblau Stain und zählen Zellen mit einer Neubauer Improved Kammer. Stellen Sie die Zellkonzentration auf 3 x 10 6 Zellen / ml nach dem Zählergebnis. Seed 1 ml pro Vertiefung auf einer Platte mit 6 Vertiefungen (= 1 Tag). Wenn ein Oil Red-O-Färbung (Schritt 6) ist geplant, legte ein Deckglas in einem oder wenigen Brunnen vor Sertoli-Zellen Aussaat. Anmerkung: Sertoli Zellen in Suspension absetzen schnell, so daß das Rohr kurz jedes Mal, bevor ein Aliquot Zell geschüttelt werden mit der Pipette entnommen. Bis Tag 4 sie fest attACH dem Substrat. </li><li> Um schwimmenden oder haftenden Keimzellen an Tag 4 (4C) waschen jede Vertiefung der 6-Well-Platten für die Beschichtung isoliert Sertoli-Zellen (Schritt 5.6) mit PBS (4D) verwendet zu entfernen. Saugen Sie das Medium, fügen Sie 1-2 ml PBS in jede Vertiefung und schütteln Sie die 6-Well-Platten horizontal auf einem Tisch kräftig, aber ohne PBS verschütten. Wiederholen Sie die 3 x waschen und führen die gleiche Waschverfahren am Tag 5 und 6 (4E). Hinweis: Am Tag 4 Sertoli-Zellen fest angebracht sind und zeigen eine Kopfsteinpflaster wie Muster unter dem umgekehrten Lichtmikroskop (4C). Experimente können von Tag 7 weiter durchgeführt werden. <ol><li> (Alternative für Schritt 5.7) Für die Entfernung von schwimmenden und haftende Keimzellen führen eine hypotonischen Schock 3 Tage nach der auf 6-Well-Platten Aussaat. Entfernen Sie das Medium und 1 ml 20 mM Tris pH 7,5 direkt aus dem Kühlschrank genommen. Absaugen Tris-Puffer nach 90 bis 120 sec, jedoch nichtspäter. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und 2 ml RPMI 1640-Medium (Serum-frei). Optional führen am nächsten Tag Experimente. Hinweis: Je länger die Dauer des hypotonischen Schock ist die weitere Keimzellen aber je mehr Sertoli-Zellen entfernt werden kann und verloren gehen. Der erste PBS waschen sollte schnell, aber mit Sorgfalt erfolgen, um keine Sertoli-Zellen zu verdrängen. Direkt nach dem hypotonischer Behandlung zahlreicher Vakuolen unterschiedlicher Größe im Cytoplasma durch Phasenkontrastmikroskopie beobachtet werden. Vakuolen verschwinden innerhalb von ein paar Stunden nach der hypotonischer Behandlung. </li></ol></li></ol> 6. Oil Red O Färbung <ol><li> Führen Sie alle Schritte bei Raumtemperatur. Am Tag 7 Wasch Sertoli-Zellen auf einem Deckglas (Schritt 5.6) mit PBS zweimal und fixieren Sie diese mit 10% Formalin in PBS gewachsen. Nach 10 Minuten Formalin mit frischer Lösung ersetzen und weiterhin Fixierung für weitere 60 min. Anmerkung: Alle Lösungen werden hinzugefügt, um die (S) mit einem Deckglas und vor dem nächsten Schritt abgesaugt. </li&gt; <li> Saugen Formalin, waschen Sie die Zellen zweimal mit Wasser und 60% Isopropanol hinzu. Nach 5 min erlauben Zellen an der Luft trocknen für ein paar Minuten. </li><li> 1 ml Oil Red O Färbung Lösung pro Vertiefung und Inkubation für 10 min. Saugen Sie die Lösung, und waschen Sie die Zellen sofort 4-mal mit Wasser und montieren Deckgläser in Glycerin-PBS (9: 1). Nehmen Sie Hellfeld-Bilder mit einer Routine Lichtmikroskop (4F). </li></ol> 7. Immunfluoreszenzfärbung <ol><li> Waschen Sie PTCs (aus Schritt 4.5) oder Sertoli-Zellen (aus Schritt 5.5) auf einem Deckgläschen gewachsen zweimal mit PBS und fixieren Sie diese mit 4% PFA für 10 min bei RT. </li><li> Inkubieren mit 5% BSA in PBS für 1 h bei RT. Entsorgen Sie die BSA-PBS-Lösung und fügen frische BSA-PBS-Lösung Aktin (glatte Muskulatur) enthält (PTC) oder Vimentin (für Sertoli-Zellen) primärer Antikörper (Verdünnung 1: 100 für beide Antikörper) und Inkubation bei 4 ° CO / N. Anmerkung: Die Inkubation mit BSA blockiert unspezifischen Bindung des primären Antikörpers. </li><li> Wash Deckgläser 3-mal für 5 min in PBS-0,1% Tween 20 und Inkubation mit grün-fluoreszierenden Farbstoff konjugiertem Ziege anti-Maus Sekundär-Antikörper (Verdünnung 1: 1000) bei RT für 1 h in der Dunkelheit. </li><li> Wash Deckgläschen 3 mal 5 min in PBS-0,1% Tween 20 und montieren sie in DAPI Eindeckmediums. </li></ol> 8. Ultrastrukturelle Analyse <ol><li> Wash Sertoli-Zellen (aus Stufe 5.6) mit PBS auf eine 6 cm Zellkulturplatte gezüchtet und in einer Mischung aus 2,5% Glutaraldehyd, 2,5% Paraformaldehyd und 0,05% Pikrinsäure in 67 mM Cacodylat-Puffer bei 4 ° C für 2 h FIX ( pH 7,4) nach Ito und Karnovsky 26. </li><li> Führen Postfixierung in 1% Osmiumtetroxid, gefolgt von einer O / N Inkubation in 0,3% Uranylacetat in 50 mM gelöst Maleat-Puffer (pH 5). Einbetten Proben Medien nach Standardverfahren in einzubetten. Schneiden Sie dünne Schnitte, kontrastieren sie mit Bleizitrat und untersuchen mit einem Elektronenmikroskop. </li></ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Andrology.+Male+Reproductive+Health+and+Dysfunction%22">Andrology. Male Reproductive Health and Dysfunction</a>. Nieschlag, E., Behre, H., Nieschlag, S. , 3rd ed, Springer. (2010).</li>
<li>Esaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%C3%9Cber+Kulturen+des+Hodengewebes+der+S%C3%A4ugetiere+und+%C3%BCber+die+Natur+des+interstitiellen+Hodengewebes+und+der+Zwischenzellen%5BTitle%5D)+AND+%22Z.+Mikrosk.+Anat.+Forsch%22%5BJournal%5D)">Über Kulturen des Hodengewebes der Säugetiere und über die Natur des interstitiellen Hodengewebes und der Zwischenzellen.</a> Z. Mikrosk. Anat. Forsch. 15, 368-404 (1928).</li>
<li>Hall, P. F., Irby, D. C., De Kretser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+cholesterol+to+androgens+by+rat+testes%3A+comparison+of+interstitial+cells+and+seminiferous+tubules%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Conversion of cholesterol to androgens by rat testes: comparison of interstitial cells and seminiferous tubules.</a> Endocrinology. 84, 488-496 (1969).</li>
<li>Welsh, M. J., Wiebe, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+sertoli+cells%3A+a+rapid+method+for+obtaining+viable+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Rat sertoli cells: a rapid method for obtaining viable cells.</a> Endocrinology. 96, 618-624 (1975).</li>
<li>Vitale, R., Fawcett, D. W., Dym, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+normal+development+of+the+blood-testis+barrier+and+the+effects+of+clomiphene+and+estrogen+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec%22%5BJournal%5D)">The normal development of the blood-testis barrier and the effects of clomiphene and estrogen treatment.</a> Anat. Rec. 176, 331-344 (1973).</li>
<li>Dorrington, J. H., Roller, N. F., Fritz, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+follicle-stimulating+hormone+on+cultures+of+Sertoli+cell+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Effects of follicle-stimulating hormone on cultures of Sertoli cell preparations.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 3, 57-70 (1975).</li>
<li>Tung, P. S., Skinner, M. K., Fritz, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+synthesis+is+a+marker+for+peritubular+cell+contaminants+in+Sertoli+cell-enriched+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Fibronectin synthesis is a marker for peritubular cell contaminants in Sertoli cell-enriched cultures.</a> Biol. Reprod. 30, 199-211 (1984).</li>
<li>Verhoeven, G., Cailleau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testicular+peritubular+cells+secrete+a+protein+under+androgen+control+that+inhibits+induction+of+aromatase+activity+in+Sertoli+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Testicular peritubular cells secrete a protein under androgen control that inhibits induction of aromatase activity in Sertoli cells.</a> Endocrinology. 123, 2100-2110 (1988).</li>
<li>Tung, P. S., Dorrington, J. H., Fritz, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+changes+induced+by+follicle-stimulating+hormone+or+dibutyryl+cyclic+AMP+on+presumptive+Sertoli+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Structural changes induced by follicle-stimulating hormone or dibutyryl cyclic AMP on presumptive Sertoli cells in culture.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 72, 1838-1842 (1975).</li>
<li>Teng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+adult+Sertoli+cells+and+their+effects+on+the+function+of+co-cultured+allogeneic+islets+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Chin.+Med.+J.+%28Engl.%29%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of adult Sertoli cells and their effects on the function of co-cultured allogeneic islets in vitro.</a> Chin. Med. J. (Engl.). 118, 1857-1862 (2005).</li>
<li>Kohno, S., Ziparo, E., Marek, L. F., Tung, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+Sertoli+cells%3A+major+histocompatibility+antigens+and+glycoconjugates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Murine Sertoli cells: major histocompatibility antigens and glycoconjugates.</a> J. Reprod. Immunol. 5, 339-350 (1983).</li>
<li>Dufour, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sertoli+cell+line+lacks+the+immunoprotective+properties+associated+with+primary+Sertoli+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Sertoli cell line lacks the immunoprotective properties associated with primary Sertoli cells.</a> Cell Transplant. 17, 525-534 (2008).</li>
<li>Majumdar, S. S., Tsuruta, J., Griswold, M. D., Bartke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+Sertoli+cells+from+the+testes+of+adult+Siberian+hamsters%3A+analysis+of+proteins+synthesized+and+secreted+by+Sertoli+cells+cultured+from+hamsters+raised+in+a+long+or+a+short+photoperiod%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of Sertoli cells from the testes of adult Siberian hamsters: analysis of proteins synthesized and secreted by Sertoli cells cultured from hamsters raised in a long or a short photoperiod.</a> Biol. Reprod. 52, 658-666 (1995).</li>
<li>Zhang, H., Liu, B., Qiu, Y., Fan, J., Yu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pure+cultures+and+characterization+of+yak+Sertoli+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Cell%22%5BJournal%5D)">Pure cultures and characterization of yak Sertoli cells.</a> Tissue Cell. 45, 414-420 (2013).</li>
<li>Ziparo, E., Geremia, R., Russo, M. A., Stefanini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+interaction+in+vitro+between+Sertoli+cells+and+germ+cells+at+different+stages+of+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Surface interaction in vitro between Sertoli cells and germ cells at different stages of spermatogenesis.</a> Am. J. Anat. 159, 385-388 (1980).</li>
<li>Anway, M. D., Folmer, J., Wright, W. W., Zirkin, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Sertoli+cells+from+adult+rat+testes%3A+an+approach+to+ex+vivo+studies+of+Sertoli+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Isolation of Sertoli cells from adult rat testes: an approach to ex vivo studies of Sertoli cell function.</a> Biol. Reprod. 68, 996-1002 (2003).</li>
<li>Scarpino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+of+Sertoli+cell+isolation+by+DSA+lectin%2C+allowing+mitotic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">A rapid method of Sertoli cell isolation by DSA lectin, allowing mitotic analyses.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 146, 121-127 (1998).</li>
<li>Mather, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+two+distinct+mouse+testicular+epithelial+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of two distinct mouse testicular epithelial cell lines.</a> Biol. Reprod. 23, 243-252 (1980).</li>
<li>Korbutt, G. S., Elliott, J. F., Rajotte, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotransplantation+of+allogeneic+islets+with+allogeneic+testicular+cell+aggregates+allows+long-term+graft+survival+without+systemic+immunosuppression%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Cotransplantation of allogeneic islets with allogeneic testicular cell aggregates allows long-term graft survival without systemic immunosuppression.</a> Diabetes. 46, 317-322 (1997).</li>
<li>Fritz, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+cell-germ+cell+relationships+in+mammalian+testes+during+development+and+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Ciba+Found.+Symp%22%5BJournal%5D)">Somatic cell-germ cell relationships in mammalian testes during development and spermatogenesis.</a> Ciba Found. Symp. 182, 271-281 (1994).</li>
<li>Whaley, P. D., Chaudhary, J., Cupp, A., Skinner, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+specific+response+elements+of+the+c-fos+promoter+and+involvement+of+intermediate+transcription+factor%28s%29+in+the+induction+of+Sertoli+cell+differentiation+%28transferrin+promoter+activation%29+by+the+testicular+paracrine+factor+PModS%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Role of specific response elements of the c-fos promoter and involvement of intermediate transcription factor(s) in the induction of Sertoli cell differentiation (transferrin promoter activation) by the testicular paracrine factor PModS.</a> Endocrinology. 136, 3046-3053 (1995).</li>
<li>Bhushan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uropathogenic+Escherichia+coli+block+MyD88-dependent+and+activate+MyD88-independent+signaling+pathways+in+rat+testicular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Uropathogenic Escherichia coli block MyD88-dependent and activate MyD88-independent signaling pathways in rat testicular cells.</a> J. Immunol. 180, 5537-5547 (2008).</li>
<li>Meinhardt, A., Hedger, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological%2C+paracrine+and+endocrine+aspects+of+testicular+immune+privilege%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Immunological, paracrine and endocrine aspects of testicular immune privilege.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 335, 60-68 (2011).</li>
<li>Fijak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+Testosterone+on+Inflammatory+Response+in+Testicular+Cells+and+Expression+of+Transcription+Factor+Foxp3+in+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Reprod.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Influence of Testosterone on Inflammatory Response in Testicular Cells and Expression of Transcription Factor Foxp3 in T Cells.</a> Am. J. Reprod. Immunol. , 12-25 (2015).</li>
<li>Mamidi, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+passing+mesenchymal+stem+cells+through+smaller+bore+size+needles+for+subsequent+use+in+patients+for+clinical+or+cosmetic+indications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Impact of passing mesenchymal stem cells through smaller bore size needles for subsequent use in patients for clinical or cosmetic indications.</a> J. Transl. Med. 10, 229(2012).</li>
<li>Ito, S., Karnovsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde-glutaraldehyde+fixatives+containing+trinitro+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde-glutaraldehyde fixatives containing trinitro compounds.</a> J. Cell. Biol. 39, 168-169 (1968).</li>
<li>Galdieri, M., Ziparo, E., Palombi, F., Russo, M. A., Stefanini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pure+Sertoli+cell+cultures%3A+a+new+model+for+the+study+of+somatic-germ+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Androl%22%5BJournal%5D)">Pure Sertoli cell cultures: a new model for the study of somatic-germ cell interactions.</a> J. Androl. 5, 249-254 (1981).</li>
<li>Fijak, M., Meinhardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+testis+in+immune+privilege%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The testis in immune privilege.</a> Immunol. Rev. 213, 66-81 (2006).</li>
<li>Jegou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sertoli+cell+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">The Sertoli cell in vivo and in vitro.</a> Cell Biol. Toxicol. 8, 49-54 (1992).</li>
<li>Pineau, C., Le Magueresse, B., Courtens, J. L., Jegou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+in+vitro+the+phagocytic+function+of+Sertoli+cells+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Study in vitro the phagocytic function of Sertoli cells in the rat.</a> Cell Tissue Res. 264, 589-598 (1991).</li>
<li>Ren, Y., Savill, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%3A+the+importance+of+being+eaten%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Apoptosis: the importance of being eaten.</a> Cell Death Differ. 5, 563-568 (1998).</li>
<li>Ducray, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+mouse+Sertoli+cell+line+producing+rat+androgen-binding+protein+%28ABP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Steroids%22%5BJournal%5D)">Establishment of a mouse Sertoli cell line producing rat androgen-binding protein (ABP).</a> Steroids. 63, 285-287 (1998).</li>
<li>Konrad, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+Sertoli+cells+express+epithelial+but+also+mesenchymal+genes+after+immortalization+with+SV40%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Rat Sertoli cells express epithelial but also mesenchymal genes after immortalization with SV40.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1722, 6-14 (2005).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

The seminiferous tubules are bounded by a circular layer of peritubular cells and a basal lamina on the luminal side. Sertoli cells are resting on the basal lamina, establish the blood testis barrier through formation of occluding junctions between adjacent cells and provide the structural framework for the organisation of the seminiferous epithelium. Sertoli cells and adjacent spermatogenic cells maintain intimate contacts throughout germ cell development providing physical contact and communication alike. Therefore, wh...

Hoden produzieren männlichen Gameten und Sexualhormone, also Androgene. Die Orgel ist aus zwei Kammern besteht. In den Zwischenraum repräsentiert, dass etwa 10-12% der gesamten Hoden Band 1, Steroidbildung findet innerhalb der Leydigzellen. Die röhrenförmige Kammer entspricht etwa 60-80% des Hodenvolumen 1 und enthält Keimzellen und zwei Typen von somatischen Zellen - peritubulären Zellen und Sertoli-Zellen. Der Hoden wird durch Bindegewebssepten in 250-300 Läppchen unterteilt, die jeweils mit 1-3 stark gewundene Hodenkanälchen. Diese Röhren werden durch eine Basalmembran, ein Blatt von Kollagen eingeschlossen und einer umlaufenden Schicht aus peritubulären Zellen (1A). Keimepithels auf der luminalen Seite der Basalmembran liegt. Sertoli-Zellen sind groß länglichen Zellen, die die gesamte Keimepithels von der Basalmembran zum Lumen erstrecken. Sie sind stark attschmerzte zu der Basalmembran und eine kontinuierliche Zell Blatt durch basolaterale organisiert tight junctions bilden, die das Keimepithel aus dem Interstitium verschließt und stellt die Blut-Hoden-Schranke. Sertoli-Zellen haben prominente zytoplasmatische Projektionen und Konsequenzen, die es ihnen ermöglichen, mit einer artspezifischen aber konstante Anzahl von Keimzellen in enge morphologische und funktionelle Verbindung zu setzen. Diploiden Keim Stammzellen vermehren und differenzieren sich in Spermatogonien. Während der Meiose I kurzlebig tetraploiden Spermatozyten erzeugt werden, die wiederum in vier haploiden Spermatiden während der Meiose II entwickeln. Alle Keimzellen werden durch zytoplasmatische Brücken miteinander verbunden, so dass sie ein zellulares Netz bilden. Das Hauptereignis während der Reifung der Spermatiden ist die Extrusion von großen Teilen des Cytoplasmas, Bildung Restkörper in einem Verfahren Spermiogenese bezeichnet. Restkörper durch Sertoli Zellen phagozytiert. Später Spermatiden werden dann veröffentlicht inTubuluslumen und in den Nebenhoden zur weiteren Reifung gebracht. Spermatogenese topographisch und funktionell erscheinen Sertoli-Zellen und Keimzellen gegenseitig koordinieren. Erstellung von individuellen Hodenzelltypen begann vor fast einem Jahrhundert als kleine Hodenstücke kultiviert wurden und Zelltypen durch Mikroskopie 2 identifiziert. Durch sorgfältige Präparation der Röhrchen nach der Tunica albuginea Öffnung mit feinen bestückten Zange war es später möglich Rohr und interstitielle Fächer 3 zu trennen. 1975 eingeführt Welsh und Wiebe eine Kollagenasebehandlung, um die Tubuli von anhaftenden Zwischengewebe und Pankreatin Behandlung zur Entfernung des äußeren peritubulären Zellschicht 4 zu befreien. Schon früh junge, unreife Ratten (ca. 20 Tage alt) hatte, in denen verwendet umfassen die Sertoli-Zellen einen großen Teil des rohrförmigen Zellpopulation weil Spermatogenese noch nicht begonnen hat. In diesem Alter Ratte SertOli Zellen aufhören zu unterteilen, und tight junctions zwischen benachbarten Zellen bilden, so daß die Blut-Hoden-Schranke 5 hergestellt ist. Unabhängig von Welsh und Wiebe Dorrington et al. Führte eine Kombination von Trypsin und Desoxyribonuklase durch soybeen Trypsin-Inhibitor und Collagenase-Behandlung anschließen, die im selben Jahr 6 veröffentlicht wurde. Beide Gruppen auch mechanische Kraft (Zeichnung der verdauten Rohrbruchstücke immer wieder durch eine Spritzennadel oder einer Pasteur-Pipette jeweils), um eine homogene Zellsuspension für die Beschichtung zu erzeugen, enthält etwa 70% Sertoli-Zellen verwendet. Nach 3 Tagen in Kultur unter Verwendung eines Mediums, das serumfrei ist, erhöht sich der Anteil der Sertoli-Zellen auf etwa 90%. Dies könnte zum größten Teil auf den Tod zugeschrieben Keimzellen kontaminieren. Rest peritubulären Zellen (PTC), jedoch bleiben fest über ihre extrazelluläre Matrix gebunden. PTCs, aber nicht Sertoli-Zellen, sind dafür bekannt, zu produzierenFibronektin, die als Markerprotein für die Schätzung Kontamination mit PTCs dienen kann. Daher Tung et al. begründete, dass eine zusätzliche Hyaluronidase Behandlung kann die Reinheit des 7-Fraktion Sertoli Zelle verbessern. Tatsächlich könnten sie zeigen, dass eine zusätzliche Behandlung zur Verringerung der Kontaminierung konnte durch PTCs etwa 20-fach, was besonders deutlich wird, wenn ein Vergleich in serumhaltigem Medium zur Kultivierung gereinigt Sertoli-Zellen verwendet wird. Von da an dem verbesserten Verfahren von Tung et al. wurde die vorherrschende Protokoll und wurde von anderen Hauptgruppen im Bereich 8 (1B) intensiv genutzt. Während Kollagenasebehandlung die Mehrheit der PTCs freigegeben und kann parallel zu Sertoli-Zellen isoliert werden. Während energisch die PTCs vermehren und reagieren nicht auf Follikel-stimulierendes Hormon (FSH), Sertoli-Zellen durchlaufen nicht Mitose mehr und von charakteristischen morphologischen Veränderungen zu reagieren FSHund eine Zunahme in zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP) -Konzentration 9. Sehr ähnlich enzymatische Verdauung Protokolle können zur Isolierung von primären Sertoli-Zellen von anderen Tieren wie Menschen 10, Maus 11,12, Sibirische Hamster 13 oder Yak 14 verwendet werden. Für die Entfernung von großen Mengen an Keimzellen einen hypotonischen Schock verunreinigen können am Ende des Isolierungsprozedur 15 verwendet werden. Dies ermöglicht auch die effiziente Isolierung von Sertoli-Zellen aus erwachsenen Ratte 16 Hoden. Ein angereichert Sertoli Zellsuspension kann auch mit Stechapfel Agglutinin 17 beschichtet durch Plattierung der Suspension auf Lektin Gerichte aus Keimzellen getrennt werden. Nur Sertoli-Zellen und ein paar Rest PTCs sich an die Lektin-Platten. Primäre Sertoli-Zellkulturen, vor allem aus der Ratte, wurden ursprünglich für die Untersuchung von Reaktionsfähigkeit auf Hormone oder Festlegung Zelllinien wie die Maus Sertoli Zellen Li verwendetne TM4 18. Diese Zelllinie wurde in mehr als hundert Studien bis heute untersucht. In einem translationalen Ansatz haben Sertoli-Zellen wurden für Immunschutz von Co-kultivierten Zellen und Geweben, wie in der co-Transplantation von allogenen oder xeno- Pankreasinseln für langfristige Überleben des Transplantats ohne systemische Immunsuppression 19 verwendet. Und somatische Keimzelle (Sertoli cells - Keimzellen) -Wechselwirkungen 20, 21 - isoliert Sertoli-Zellen wurden auch in Co-Kultur-Experimente zur Untersuchung der epithelial-mesenchymalen (PTCC Sertoli-Zellen) verwendet. Kürzlich primären Sertoli-Zellen wurden zur Untersuchung der Expression von Toll-like-Rezeptoren und die Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen wie auch die Signalketten, die zu Cytokin-Expression nach Infektion mit nicht-pathogenen und uropathogene E. beschäftigt coli 22. Andere neuere Untersuchungen wurden mit Sertoli-Zellen für Hodenimmun p Studiumrivilege 23 und gezeigt, dass Testosteron-Vorbehandlung unterdrückt die LPS-induzierte Entzündungsreaktion 24.

<table><tbody><tr><td>Actin (smooth muscle) antibody clone 1A4</td><td>Dako</td><td>M0851</td><td>Monoclonal mouse anti human antibody.&lt;br/&gt; Use 1:100 dilution for immunofluorescence.</td></tr><tr><td>Albumin bovine fraction V&lt;br/&gt; Standard grade, lyophilized</td><td>Serva</td><td>11930.04</td><td>Filter (0.45 &amp;micro;m) BSA solutions used for immunofluorescence.</td></tr><tr><td>Corning Cell Strainers 70&amp;nbsp;&amp;micro;m</td><td>Corning</td><td>431751</td><td>White color</td></tr><tr><td>Collagenase A from&lt;em&gt; Clostridium histolyticum&lt;/em&gt;</td><td>Roche</td><td>10103586001</td><td></td></tr><tr><td>DAPI mountant ProLong Gold Antifade</td><td>Life technologies</td><td>P-36931</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma</td><td>G8644</td><td>100 g/L</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;acute;s PBS without Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Electron microscope</td><td>Zeiss</td><td>EM 109S</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence microscope</td><td>Zeiss</td><td>Axioplan 2</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase from bovine testis</td><td>Sigma</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>Inverted light microscope</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td>Routine cell culture microscope</td></tr><tr><td>Mouse IgG / IgM (H+L) polyclonal&lt;br/&gt; secondary Antibody&amp;nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>A-10684</td><td>Alexa Fluor 488 conjugate</td></tr><tr><td>Oil Red O</td><td>Sigma</td><td>O0625</td><td>Has replaced Sudan III and Sudan IV because of brighter color.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin (5,000&amp;nbsp;U/ml)/&lt;br/&gt; Streptomycin (5,000 &amp;micro;g/ml)</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td>100x solution</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>21875-034</td><td>Contains 300 mg/L L-glutamine</td></tr><tr><td>Trypsin from porcine pancreas</td><td>Sigma</td><td>T5266</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain (0.4%)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin inhibitor from soybean</td><td>Sigma</td><td>T6522</td><td>The Sigma product is considerably cheaper than the previously used&lt;br/&gt; BPTI (Aprotinin) from Roche.</td></tr><tr><td>Vimentin antibody (V9)</td><td>Sigma</td><td>V6630</td><td>Monoclonal mouse anti pig vimentin antibody.&amp;nbsp; Use 1:100 dilution for immunofluorescence.</td></tr><tr><td>Wistar WU rats</td><td>Charles River</td><td></td><td>Should be 19 days old on day of experiment.</td></tr></tbody></table>

isolation of sertoli cells and peritubular cells from rat testes

Der Hoden, insbesondere der männlichen Gameten, fordert das Immunsystem in einer einzigartigen Art und Weise, weil differenziert Spermien zuerst zum Zeitpunkt der Pubertät erscheinen - mehr als zehn Jahre nach der Gründung der systemischen Immuntoleranz. Spermatogenen Zellen exprimieren eine Reihe von Proteinen, die vom Immunsystem als nicht-selbst gesehen werden. Der Hoden muss dann in der Lage sein, Toleranz auf der einen Seite auf diese Neo-Antigene herzustellen, aber immer noch selbst zu schützen können vor Infektionen und Tumorentwicklung auf der anderen Seite. Daher ist die Hoden eines der wenigen Immun privilegierten Stellen im Körper, die ohne evozieren eine schädliche entzündliche Immunantwort fremde Antigene tolerieren. Sertoli-Zellen spielen eine Schlüsselrolle für die Pflege dieser Immun privilegierten Umgebung der Hoden und auch das Überleben von cotransplanted Zellen in einer fremden Umgebung zu verlängern. Daher Primär sind Sertoli-Zellen ein wichtiges Instrument für die Immunprivileg des Hodens studieren, die nicht E sein kannasily von etablierten Zelllinien oder andere zelluläre Modelle ersetzt. Hier präsentieren wir eine detaillierte und umfassende Protokoll zur Isolierung von Sertoli-Zellen - und peritubulären Zellen, falls gewünscht - von der Ratte Hoden innerhalb eines einzigen Tages.

Das beschriebene Verfahren ermöglicht die Isolierung von ca. 12 x 10 7 Sertoli-Zellen aus 10 Ratte Hoden. SO 3 x 10 6 Zellen pro Vertiefung auf einer Platte mit 6 Vertiefungen plattiert, dass sechs bis sieben Platten mit 6 Vertiefungen für Experimente zur Verfügung stehen 7. Die Trypsin-DNase I-Verdau der wichtigste Schritt bei der Sertoli Zellisolierung ist. Wenn Verdauung an dieser Stelle zu weit voran, erhöht sich das Verhältnis von Keimzellen / Sertoli Zell...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Sertoli Cells and Peritubular Cells from Rat Testes at JoVE.com

Isolation of Sertoli Cells and Peritubular Cells from Rat Testes

Primäre Sertoli-Zellen sind für das Studium Hoden-Immun-Privileg, Signaltransduktion während der Entzündung oder Infektion und Nutzung ihrer immun Eigenschaften erforderlich. Hier beschreiben wir ein Enzym-basiertes Protokoll für die Isolierung von hoch gereinigten primären Sertoli-Zellen und peritubulären Zellen aus Rattenhoden.

Isolierung von Sertoli-Zellen und peritubulären Zellen aus Ratte Hoden

The testis, and in particular the male gamete, challenges the immune system in a unique way because differentiated sperm first appear at the time of ...

isolation-of-sertoli-cells-and-peritubular-cells-from-rat-testes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

22.4K Aufrufe.  Justus-Liebig-Universität Gießen.  Primäre Sertoli-Zellen sind für das Studium Hoden-Immun-Privileg, Signaltransduktion während der Entzündung oder Infektion und Nutzung ihrer immun Eigenschaften erforderlich. Hier beschreiben wir ein Enzym-basiertes Protokoll für die Isolierung von hoch gereinigten primären Sertoli-Zellen und peritubulären Zellen aus Rattenhoden. 

Serie: Isolation of Sertoli Cells and Peritubular Cells from Rat Testes

Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types that are distinct not only in molecular and morphological features but also in physiological properties. These differences reflect their diverse functions, which together establish the necessary microenvironment for the post-testicular sperm development in the epididymal lumen. The understanding of the biophysical properties of the epididymal epithelial cells is critical for revealing their functions in sperm and reproductive health, under both physiological and pathophysiological conditions. While their functional properties have yet to be fully elucidated, the epididymal epithelial cells can be studied using the patch-clamp technique, a tool for measuring the cellular events and the membrane properties of single cells. Here, we describe the methods of cell isolation and whole-cell patch-clamp recording to measure the electrical properties of primary dissociated epithelial cells from the rat cauda epididymides.

We present a protocol that combines cell isolation and whole-cell patch-clamp recording to measure the electrical properties of the primary dissociated epithelial cells from the rat cauda epididymides. This protocol allows for investigation of the functional properties of primary epididymal epithelial cells to further elucidate the physiological role of the epididymis.

Ganzzellige Patch-Clamp Aufnahmen von isolierten primären Epithelzellen aus dem Epididymis

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during meiosis can lead to infertility, pregnancy loss or genetic defects. Commencing at the onset of puberty and continuing throughout adulthood, continuous semi-synchronous waves of spermatocytes undergo spermatogenesis and ultimately form haploid sperm. The first wave of mouse spermatocytes undergoing meiotic initiation appear at day 10 post-partum (10 dpp) and are released into the lumen of seminiferous tubules as mature sperm at 35 dpp. Therefore, it is advantageous to utilize mice within this developmental time-window in order to obtain highly enriched populations of interest. Analysis of rare cell stages is more difficult in older mice due to the contribution of successive spermatogenic waves, which increase the diversity of the cellular populations within the tubules. The method described here is an easily implemented technique for the cytological evaluation of the cells found within the seminiferous tubules of mice, including spermatogonia, spermatocytes, and spermatids. The tubule squash technique maintains the integrity of isolated male germ cells and allows examination of cellular structures that are not easily visualized with other techniques. To demonstrate the possible applications of this tubule squash technique, spindle assembly was monitored in spermatocytes progressing through the prophase to metaphase I transition (G2/MI transition). In addition, centrosome duplication, meiotic sex chromosome inactivation (MSCI), and chromosome bouquet formation were assessed as examples of the cytological structures that can be observed using this tubule squash method. This technique can be used to pinpoint specific defects during spermatogenesis that are caused by mutation or exogenous perturbation, and thus, contributes to our molecular understanding of spermatogenesis.

The goal of this tubule squash technique is to rapidly assess cytological features of developing mouse spermatocytes while preserving cellular integrity. This method allows for the study of all stages of spermatogenesis, and can be easily implemented alongside other biochemical and molecular biological approaches for the study of mouse meiosis.

Eine Seminiferous Röhrchen-Squash-Technik für die zytologische Analyse der Spermatogenese mit dem Maus-Modell

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by Sertoli cell junctions at the blood-testis barrier (BTB), which is the tightest tissue barrier in the mammalian body and segregates the seminiferous epithelium into two compartments, a basal and an adluminal. The BTB creates a unique microenvironment for germ cells in meiosis I/II and for the development of postmeiotic spermatids into spermatozoa via spermiogenesis. Here, we describe a reliable assay to monitor BTB integrity of mouse testis in vivo. An intact BTB blocks the diffusion of FITC-conjugated inulin from the basal to the apical compartment of the seminiferous tubules. This technique is suitable for studying gene candidates, viruses, or environmental toxicants that may affect BTB function or integrity, with an easy procedure and a minimal requirement of surgical skills compared to alternative methods.

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Here, we present a protocol to assess the blood-testis barrier integrity by injecting inulin-FITC into testes. This is an efficient in vivo method to study blood-testis barrier integrity that can be compromised by genetic and environmental elements.

Eine In-Vivo -Methode, um die Maus Blut-Hoden-Schranke Integrität zu studieren

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

Enrichment of Pachytene Spermatocytes and Spermatids from Mouse Testes Using Standard Laboratory Equipment

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete populations is challenging, because the adult testis contains a complex mix of germ cells from all steps of spermatogenesis along with certain populations of somatic cells. Over the past few decades, different techniques such as centrifugal elutriation, fluorescence-activated cell sorting (FACS), and STA-PUT have been successfully applied to the isolation of germ cells. A drawback is that they all require dedicated devices and specialized training. Following principles underlying the STA-PUT method, a simple protocol has been developed for the isolation of pachytene spermatocytes, round spermatids, and elongating spermatids from mouse testes. After preparing a single cell suspension of testicular cells, specific cell populations are enriched by gravity sedimentation through a discontinuous bovine serum albumin (BSA) density gradient. The cell fractions are then manually collected and microscopically analysed. This modified density gradient for round spermatids (MDR) sedimentation protocol can be widely applied, because it requires only standard laboratory equipment. Furthermore, the protocol requires minimal starting materials, reducing its cost and use of laboratory animals.

Presented here is a protocol for enriching pachytene spermatocytes, round spermatids, and elongating spermatids from adult mouse testes using a discontinuous bovine serum albumin density gradient with standard laboratory equipment.

Anreicherung von Pachyten-Spermatozyten und Spermatien aus Maushoden mit Standard-Laborgeräten

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete ...

Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed in order to create testicular organoids. Many of these methods rely upon extracellular matrix (ECM) to promote de novo tissue assembly, however, there are differences between methods in terms of biomimetic morphology and function of tissues. Moreover, there are few direct comparisons of published methods. Here, a direct comparison is made by studying differences in organoid generation protocols, with provided outcomes. Four archetypal generation methods: (1) 2D ECM-free, (2) 2D ECM, (3) 3D ECM-free, and (4) 3D ECM culture are described. Three primary benchmarks were used to assess the testicular organoid generation. These are cellular self-assembly, inclusion of major cell types (Sertoli, Leydig, germ, and peritubular cells), and appropriately compartmentalized tissue architecture. Of the four environments tested, 2D ECM and 3D ECM-free cultures generated organoids with internal morphologies most similar to native testes, including the de novo compartmentalization of tubular versus interstitial cell types, the development of tubule-like-structures, and an established long-term endocrine function. All methods studied utilized unsorted, primary murine testicular cell suspensions and used commonly accessible culture resources. These testicular organoid generation techniques provide a highly accessible and reproducible toolkit for research initiatives into testicular organogenesis and physiology in vitro.

Here, four methods for generating testicular organoids from primary neonatal murine testicular cells are described i.e., extracellular matrix (ECM) and ECM-free 2D and 3D culture environments. These techniques have multiple research applications and are especially useful for studying testicular development and physiology in vitro.

Extra Cellular Matrix-Based und Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Hodenorganoide

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed ...

Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established cell isolation protocols using Hoechst 33342 staining in combination with fluorescence-activated cell sorting, it requires cell sorters equipped with an ultraviolet laser. Here we describe a cell isolation protocol using the DyeCycle Violet (DCV) stain, a low cytotoxicity DNA binding dye structurally similar to Hoechst 33342. DCV can be excited by both ultraviolet and violet lasers, which improves the flexibility of equipment choice, including a cell sorter not equipped with an ultraviolet laser. Using this protocol, one can isolate three live-cell subpopulations in meiotic prophase I, including leptotene/zygotene, pachytene, and diplotene spermatocytes, as well as post-meiotic round spermatids. We also describe a protocol to prepare single-cell suspension from mouse testes. Overall, the procedure requires a short time to complete (4-5 hours depending on the number of needed cells), which facilitates many downstream applications.

Here we present a simple and efficient method to isolate live meiotic and post-meiotic germ cells from adult mouse testes. Using a low-cytotoxicity, violet-excited DNA binding dye and fluorescence-activated cell sorting, one can isolate highly enriched spermatogenic cell populations for many downstream applications.

Isolierung von murinen Spermatogenic Cells mit einem violett-erregten Zellpermeable DNA Binding Dye

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established ...

Germ Cell Transplantation and Testis Tissue Xenografting in Mice

Germ cell transplantation was developed by Dr. Ralph Brinster and colleagues at the University of Pennsylvania in 19941,2. These ground-breaking studies showed that microinjection of germ cells from fertile donor mice into the seminiferous tubules of infertile recipient mice results in donor-derived spermatogenesis and sperm production by the recipient animal2. The use of donor males carrying the bacterial &beta;-galactosidase gene allowed identification of donor-derived spermatogenesis and transmission of the donor haplotype to the offspring by recipient animals1. Surprisingly, after transplantation into the lumen of the seminiferous tubules, transplanted germ cells were able to move from the luminal compartment to the basement membrane where spermatogonia are located3. It is generally accepted that only SSCs are able to colonize the niche and re-establish spermatogenesis in the recipient testis. Therefore, germ cell transplantation provides a functional approach to study the stem cell niche in the testis and to characterize putative spermatogonial stem cells. To date, germ cell transplantation is used to elucidate basic stem cell biology, to produce transgenic animals through genetic manipulation of germ cells prior to transplantation4,5, to study Sertoli cell-germ cell interaction6,7, SSC homing and colonization3,8, as well as SSC self-renewal and differentiation9,10.
Germ cell transplantation is also feasible in large species11. In these, the main applications are preservation of fertility, dissemination of elite genetics in animal populations, and generation of transgenic animals as the study of spermatogenesis and SSC biology with this technique is logistically more difficult and expensive than in rodents. Transplantation of germ cells from large species into the seminiferous tubules of mice results in colonization of donor cells and spermatogonial expansion, but not in their full differentiation presumably due to incompatibility of the recipient somatic cell compartment with the germ cells from phylogenetically distant species12. An alternative approach is transplantation of germ cells from large species together with their surrounding somatic compartment. We first reported in 2002, that small fragments of testis tissue from immature males transplanted under the dorsal skin of immunodeficient mice are able to survive and undergo full development with the production of fertilization competent sperm13. Since then testis tissue xenografting has been shown to be successful in many species and emerged as a valuable alternative to study testis development and spermatogenesis of large animals in mice14.

Protocols for germ cell transplantation and testis tissue xenografting are described. Germ cell transplantation results in donor-derived spermatogenesis in recipient testes and represents a functional reconstitution assay for identification of spermatogonial stem cells (SSCs). Testis tissue xenografting reproduces testis development and spermatogenesis of various donor species in recipient mice.

Germ Cell Transplantation und Hodengewebe in Mäusen Xenografting

Germ cell transplantation was developed by Dr. Ralph Brinster and colleagues at the University of Pennsylvania in 19941,2. These ground-breaking studies ...

Biologie

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells (SSCs) in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly the lifetime of the animal. While the precise mechanisms that govern self-renewal and differentiation in vivo are challenging to study, various systems have been developed previously to propagate murine SSCs in vitro using a combination of specialized culture media and feeder cells1-3.
Most in vitro forays into the biology of SSCs have derived cell lines from neonates, possibly due to the difficulty in obtaining adult cell lines4. However, the testis continues to mature up until ~5 weeks of age in most mouse strains. In the early post-natal period, dramatic changes occur in the architecture of the testis and in the biology of both somatic and spermatogenic cells, including alterations in expression levels of numerous stem cell-related genes. Therefore, neonatally-derived SSC lines may not fully recapitulate the biology of adult SSCs that persist after the adult testis has reached a steady state.
Several factors have hindered the production of adult SSC lines historically. First, the proportion of functional stem cells may decrease during adulthood, either due to intrinsic or extrinsic factors5,6. Furthermore, as with other adult stem cells, it has been difficult to enrich SSCs sufficiently from total adult testicular cells without using a combination of immunoselection or other sorting strategies7. Commonly employed strategies include the use of cryptorchid mice as a source of donor cells due to a higher ratio of stem cells to other cell types8. Based on the hypothesis that removal of somatic cells from the initial culture disrupts interactions with the stem cell niche that are essential for SSC survival, we previously developed methods to derive adult lines that do not require immunoselection or cryptorchid donors but rather employ serial enrichment of SSCs in culture, referred to hereafter as SESC2,3.
The method described below entails a simple procedure for deriving adult SSC lines by dissociating adult donor seminiferous tubules, followed by plating of cells on feeders comprised of a testicular stromal cell line (JK1)3. Through serial passaging, strongly adherent, contaminating non-germ cells are depleted from the culture with concomitant enrichment of SSCs. Cultures produced in this manner contain a mixture of spermatogonia at different stages of differentiation, which contain SSCs, based on long-term self renewal capability. The crux of the SESC method is that it enables SSCs to make the difficult transition from self-renewal in vivo to long-term self-renewal in vitro in a radically different microenvironment, produces long-term SSC lines, free of contaminating somatic cells, and thereby enables subsequent experimental manipulation of SSCs.

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells SSCs in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

A simple method to derive and maintain spermatogonial stem and progenitor cell lines from adult mice is presented here. The method utilizes feeder cells originating from the somatic cell compartment of the adult mouse testis. This technique is applicable to common mouse strains, including transgenic, knock-out, and knock-in mice.

Serielle Anreicherung von Spermatogonien Stamm-und Progenitorzellen (SSC) in der Kultur für die Ableitung des langfristigen adulten Maus SSC Linien

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly ...

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline cells. This heterogeneity is an important drawback concerning the study of the bases of mammalian spermatogenesis, as pure or enriched cell populations in certain stages of sperm development are needed for most molecular analyses1.
 Various strategies such as Staput2,3, centrifugal elutriation1, and flow cytometry (FC)4,5 have been employed to obtain enriched or purified testicular cell populations in order to enable differential gene expression studies. 
It is required that cells are in suspension for most enrichment/ purification approaches. Ideally, the cell suspension will be representative of the original tissue, have a high proportion of viable cells and few multinucleates - which tend to form because of the syncytial nature of the seminiferous epithelium6,7 - and lack cell clumps1 . Previous reports had evidenced that testicular cell suspensions prepared by an exclusively mechanical method clumped more easily than trypsinized ones1 . On the other hand, enzymatic treatments with RNAses and/or disaggregating enzymes like trypsin and collagenase lead to specific macromolecules degradation, which is undesirable for certain downstream applications. The ideal process should be as short as possible and involve minimal manipulation, so as to achieve a good preservation of macromolecules of interest such as mRNAs. Current protocols for the preparation of cell suspensions from solid tissues are usually time-consuming, highly operator-dependent, and may selectively damage certain cell types1,8 . 
	The protocol presented here combines the advantages of a highly reproducible and extremely brief mechanical disaggregation with the absence of enzymatic treatment, leading to good quality cell suspensions that can be used for flow cytometric analysis and sorting4, and ulterior gene expression studies9 .

A novel protocol for the mechanical preparation of testicular cell suspensions from rodent material, avoiding enzymes and detergents, is described. The method is very simple, fast, reproducible, and renders good quality cell suspensions, which are suitable for flow sorting and RNA extraction.

Einfache und effiziente Technik zur Herstellung von Hodenkrebs Zellsuspensionen

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation

Mammalian spermatogenesis is a complex differentiation process that occurs in several stages in the seminiferous tubules of the testes. Currently, there is no reliable cell culture system allowing for spermatogenic differentiation in vitro, and most biological studies of spermatogenic cells require tissue harvest from animal models like the mouse and rat. Because the testis contains numerous cell types - both non-spermatogenic (Leydig, Sertoli, myeloid, and epithelial cells) and spermatogenic (spermatogonia, spermatocytes, round spermatids, condensing spermatids and spermatozoa) - studies of the biological mechanisms involved in spermatogenesis require the isolation and enrichment of these different cell types. The STA-PUT method allows for the separation of a heterogeneous population of cells - in this case, from the testes - through a linear BSA gradient. Individual cell types sediment with different sedimentation velocity according to cell size, and fractions enriched for different cell types can be collected and utilized in further analyses. While the STA-PUT method does not result in highly pure fractions of cell types, e.g. as can be obtained with certain cell sorting methods, it does provide a much higher yield of total cells in each fraction (~1 x 108 cells/spermatogenic cell type from a starting population of 7-8 x 108 cells). This high yield method requires only specialized glassware and can be performed in any cold room or large refrigerator, making it an ideal method for labs that have limited access to specialized equipment like a fluorescence activated cell sorter (FACS) or elutriator.

The STA-PUT method allows for the separation of different populations of spermatogenic cells based on size and density.

Die Trennung der Spermatogenese Zelltypen Mit STA-PUT Velocity Sedimentation

Mammalian spermatogenesis is a complex  differentiation process that occurs in several stages in the seminiferous  tubules of the testes. Currently, there ...