Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem National Institutes of Health (AI050677, HD-051.998 und GM103433), ein Malcolm Feist Herz-Kreislauf-Forschungsstipendium und ein American Heart Association Promotionsstipendium (10PRE4200007) unterstützt.

Ein. Herstellung von Gelatine-beschichtete Deckgläser <ol><li> Ort acid-washed Deckgläschen (15 mm Durchmesser) in einem sterilen 100-mm-Schale (n). Zeigen 8-9 Deckgläser pro Gericht und sicherzustellen, dass sie nicht gegenseitig berühren oder die Seiten der Schüssel .. </li></ol> Anmerkung: Die Deckgläser, Nadeln und Pinzette müssen steril sein, um mögliche kontaminierenden Mikroorganismen sowie Endotoxine, die zellulären Funktionen, einschließlich Motilität beeinflussen eliminieren. <ol start="2"><li> Wiegen die Gelatinepulver und resuspendieren des Pulvers in entionisiertem Wasser auf eine Gelatine-Lösung mit einer Endkonzentration von 0,5 g/300 ml betrug. Weiter muss die Gelatinelösung zur autoklaviert werden. </li><li> Pipette 2-3 Tropfen Gelatine (~ 100-150 ml) auf jedes Deckglas. </li></ol> Hinweis: Achten Sie darauf, nicht zu erlauben, die Gelatine in die Schale berühren oder Sie werden nicht in der Lage, die Deckgläser aus der Schale entfernen. <ol start="4"&gt; <li> Backen die Gelatine-beschichtete Deckgläser in der 100-mm-Schale in einem Ofen bei 90 ° C für 10 min. </li><li> Entfernen Sie das überschüssige Gelatine durch vorsichtiges Pipettieren. </li><li> Trockne die Deckgläser in der 100-mm-Schale in dem Ofen bei 70 ° C für 45 min. </li><li> Einmal trocken, entfernen Sie die Deckgläser aus der 100-mm-Schale mit einer sterilen, Endotoxin-freie Nadel und Pinzette (die Nadel wird verwendet, um vorsichtig anzustossen das Deckglas zugänglich zu machen für die Pinzette vorsichtig entfernen). </li><li> Platzieren einzelner Gelatine beschichtete Deckgläser in separate Vertiefungen einer 24-Well-Platte. </li></ol> 2. Herstellung von kolloidalem Gold beschichteten Deckgläschen <ol><li> Wiegen eine entsprechende Menge an Chlorogoldsäure (Tetrachlorogoldsäure Trihydrat; HAuCl 4 · 3H 2 O) und dann in sterilem deionisiertem Wasser suspendieren, um eine endgültige 14,5 mM Lösung (giftig) vorzubereiten. Planen 1,5 ml der Lösung pro 8-9 Deckgläsern. </li></ol> Warning: Chlorogoldsäure ist harmful bei Verschlucken bewirkt schwere Verätzungen der Haut und schwere Augenschäden und kann allergische Hautreaktionen verursachen. Giftig beim Verschlucken. <ol start="2"><li> Wiegen einer geeigneten Menge Natriumcitrat (Trinatrium dihydrogen 2-hydroxypropan-1 ,2,3-tricarboxylat; Na 3 C 6 H 5 O 7) und dann das Pulver resuspendieren in entionisiertem Wasser, um eine endgültige 0,5% ige Lösung herzustellen. Planen 1 ml der Lösung pro 8-9 Deckgläsern. </li></ol> Warning: Natriumcitrat kann Augen und Haut reizen. Es kann auch die Atemwege und den Verdauungstrakt reizen. <ol start="3"><li> In einer sterilen, Endotoxin-frei kombinieren Becherglas 1,5 ml des sterilen 14,5 mM HAuCl 4-Lösung und 13,5 ml sterilem, deionisiertem Wasser, das Ergebnis sollte eine schwach gelbe Lösung erhalten wurde. Die oben genannten Mengen werden für 8-9 kolloidalem Gold Deckgläser gemacht werden können. </li><li> Unter ständigem Rühren erhitzt, die Lösung auf einer heißen Platte, bis sie zu b beginntÖl. </li></ol> Warnung: Die Erwärmung der Lösung sollte im Abzug durchgeführt werden, als Dämpfe schädlich sein kann / giftig. Die Dämpfe sind schädlich für das Gewebe der Schleimhäute und oberen Atemwege. <ol start="5"><li> Entfernen Sie das Becherglas von der Heizplatte. </li><li> Unter Rühren hinzufügen, 0,7 ml der 0,5% Natriumcitrat-Lösung. Die oben erwähnte Volumen wird für 8-9 kolloidalem Gold Deckgläser gemacht werden können. </li><li> Halten Sie das Rühren diese kombinierte Lösung für ca. 2 min (Hinweis: Die Farbe der Lösung wird allmählich von schwachen gelben verändern, zu löschen, zu grau, zu lila, Deep Purple, bevor sie schließlich erreichte einen Rotwein oder vorzugsweise Rostfarbe) . Dieses Produkt ist Ihr kolloidalem Gold Lösung. </li><li> Man kühlt die kolloidale Goldlösung in einer 10 ml Pipette für 1-2 min (in der Reihenfolge, um die Gelatine-Schicht auf dem Deckglas aus Schmelzen zu halten, wenn die kolloidale Goldlösung hinzugefügt wird) und dann Hinzufügen von 1,0 bis 2,0 ml der colloidal Gold Lösung auf jede mit Gelatine beschichteten Deckgläschen zuvor in einer 24-Well-Platte (n) (die Menge der kolloidalen Goldlösung, dass sie zu den Gelatine-beschichtete Deckgläser hinzuzufügen abhängig, wie gut die Goldpartikel präzipitiert in der Lösung angeordnet - siehe Anmerkungen unten). </li></ol> Hinweis: Da es Unterschiede in der Effizienz der Goldpartikel Niederschläge sein könnte, ist es ratsam, zuerst hinzufügen 0,5-1 ml von kolloidalem Gold Lösung der Gelatine-beschichteten Deckgläsern und dann die 24-Well-Platte in den Inkubator für 0,5 h . Nach dieser Inkubationszeit sollten die Deckgläser unter dem Lichtmikroskop auf die entsprechende Dichte der Goldpartikel auf den Deckgläschen überprüft werden. Siehe Abbildung 1 für 20x Mikroskopiebilder von Beispielen zu niedrig und eine zu hohe Konzentration von Goldpartikeln. Siehe Abbildung 2 für 40x Mikroskopiebilder eines idealen Konzentration von Goldpartikeln (mindestens für die Verwendung mit Monozyten). Die optimal Dichte der Goldnanopartikel auf der Folie sollte experimentell für jeden Zelltyp bestimmt werden, da die Eigenschaften der verschiedenen Zellen ihre Festigkeit Bewegung auf den Deckgläschen diktieren. Wenn die Konzentration von Goldpartikeln unzureichend ist, eine zusätzliche 0,5-1 ml des kolloidalen Goldlösung den Gelatine-beschichtete Deckgläser. Abhängig von der Größe der Zellen, können die entsprechenden Konzentrationen von Goldpartikeln variieren und damit letztlich von der Größe der Zelle für Motilität untersucht abhängen. Beispielsweise mit humanen Monozyten wobei klein bemessenen Zellen (~ 10-20 um 28) wurde eine höhere Konzentration von Goldpartikeln in die Analysen benötigt. Die geeignete Verteilung von Goldnanopartikeln stellt dem Forscher die Fähigkeit, leicht und effizient Unterscheidung der Kanten der zellulären Spuren. Eine Konzentration von Goldpartikeln, die zu hoch ist behindert die Fähigkeit von Zellen zu bewegen und somit die genaue Messungihre Beweglichkeit, während eine Konzentration von Goldpartikeln, die zu niedrig Grenzen eine Fähigkeit, einen genauen Überblick über Motilität abzugrenzen ist. Wichtiger Hinweis: Wenn die Synthese von Gold-Nanopartikeln ist problematisch sind synthetisiert Gold-Nanopartikeln kommerziell erhältlich in den Größen von 5 nm bis 400 nm auf. Zusätzlich haben fluoreszierenden Mikrosphären auch in Studien der Zellmotilität 29 verwendet worden. Jedoch erfordert die Verwendung dieser Mikrokugeln eines Fluoreszenzmikroskops für die Analyse der Zellmigration. <ol start="9"><li> Legen Sie die 24-Well-Platte mit kolloidalem Gold bedeckten Deckgläschen in einem Brutschrank bei 37 ° C und inkubieren von 1 h bis über Nacht. </li><li> Nach Inkubation spülen / Entfernen ungebundenen Gold durch Eintauchen der Deckgläser (3x) in steriler Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS, pH 7,4). </li><li> Legen Sie diese kolloidalem Gold beschichteten Deckgläsern in einem sauberen 12-Well-Platte (n) mit PBS. </li><li> Bewahren Sie diese Deckgläser bei 4 ° C bis zumverwenden (Parafilm die Platte, bevor sie in einem Kühlschrank). </li></ol> Wichtiger Hinweis: Halten Sie die kolloidalem Gold beschichteten Deckgläsern in irgendeine Art von Flüssigkeit / Medien als die Goldpartikel kann abplatzen von den Deckgläsern, wenn trocknen gelassen. Die kolloidalem Gold Deckgläser sollte innerhalb von 2-3 Monaten ab dem Zeitpunkt, als sie getätigt wurden verwendet werden. Qualitätskontrolle: In einer einzigen Spur phagokinetic Motilität Assay, ist es kritisch, Deckgläschen, die durch eine ähnliche Konzentration von Goldpartikeln gekennzeichnet verwenden. Diese einfache Punkt wird für die quantitativen Unterschiede im zellulären Motilität zwischen Proben zu ermöglichen, allein aufgrund der Art der Behandlung und nicht die physikalischen Eigenschaften der kolloidalem Gold beschichteten Deckgläsern. Wir bevorzugen Verwendung nur Deckgläser gleichzeitig in einzelnen Versuche gemacht, obwohl wir gezeigt, dass, solange die Dichte der Goldnanopartikel gleich sind haben, die Verwendung von Deckgläsernaus verschiedenen Präparate geeignet ist. 3. Analyse zellulärer Motilität <ol><li> Platzieren Sie die Goldkolloid-beschichtete Deckgläser in einem geeigneten zellulären für die Zellen von Interesse. </li><li> Übertragen entsprechend behandelten Zellen auf die kolloidale Gold-beschichteten Deckgläschen in einer 24-Well-Platte (n) platziert </li></ol> Anmerkung: Die Anzahl von Zellen transferiert zum Einzelwell muss bestimmt für jeden Zelltyp studiert werden. Idealerweise sollten Zellen gleichmäßig auf der kolloidalem Gold beschichteten Deckgläschen, die wiederum für die statistische Analyse von nur Spuren von einer einzigen Zelle erstellt ermöglichen verteilt werden. Wenn Zellen mit zu hoher Konzentration plattiert sind, wird es sehr wahrscheinlich, dass überlappende Spuren mehrerer Zellen gesehen wird. Überlappenden Spuren nicht genau quantifiziert werden, und somit können sie keine Berücksichtigung in der endgültigen Analyse der Bewegung der getesteten Zellen aufgenommen werden. Überlappenden Spuren durchdie Einbeziehung mehrerer Zellen werden üblicherweise leicht beobachtet; als fusionierte oder Spuren (im Bereich der Analyse), in der zwei oder mehr Zellen in der gleichen angrenzenden freigemachten Fläche beobachtet werden kann gekreuzt. <ol start="3"><li> Bei 37 ° C / 5% CO 2 für 24 Stunden (oder aus einem geeigneten Zeitpunkt, zB Monozyten wir Motilität analysierten zwischen 6 h ​​und 24 h nach der Behandlung und Endothelzellen nach 12 h nach der Behandlung). Die optimale Zeitspanne zur Bestimmung und Messung zelluläre Motilität variieren mit dem Zelltyp untersucht und somit sollte experimentell für jeden Zelltyp (ein guter Ausgangspunkt jedoch beträgt 6 - 12 Stunden nach Behandlung) bestimmt werden. </li></ol> Anmerkung: Wenn experimentellen kolloidalem Gold beschichteten Deckgläschen zu speichernden und / oder zu einem späteren Zeitpunkt analysiert, benötigen die Zellen und Gold-Nanopartikel auf die Deckgläser fixiert werden. Um diese Fixierung Schritt zu erreichen; folgenden Schritt 3,3, Deckgläser ersten Waschen sorgfältig 2 mal mit 1xPBS (Eintauchen Deckgläser ist vorzuziehen, da eine Entnahme von Gold-Nanopartikeln aus Deckgläser müssen vermieden werden), dann verwenden Sie ein Standard Zellfixierung Methode, wie Inkubation mit Raumtemperatur 3% Paraformaldehyd. Nach einer 15-minütigen Inkubation sollte die 3% Paraformaldehyd entfernt werden und die Deckgläser sorgfältig gewaschen 3 mal mit PBS 1x. Die festen Deckgläser in einem Kühlschrank aufbewahrt werden. <ol start="4"><li> Verwendung eines Lichtmikroskops, die Aufnahmen der Schienen von einem einzigen beweglichen Zelle (Anmerkung: Die Vergrößerung verwendet werden, Bilder von zellulären Spuren sicher ergreifen je nach Zelltyp zu untersuchenden) erstellt. Beispiele für zelluläre Titel von unbeweglichen und beweglichen Zellen auf kolloidalem Gold beschichteten Deckgläsern erstellt sind in Abbildung 2 gezeigt. </li></ol> Anmerkung: Die Gold-Nanoteilchen von der Größe in der Spur phagokinetic Motilität Assay verwendet wurde gefunden, daß völlig ungiftig für Zellen 30. NotfallsKann die Lebensfähigkeit der untersuchten Zellen durch Anfärben mit Trypanblau beurteilt oder geprüft für andere Marker der zellulären Lebensfähigkeit. Man müsste berücksichtigt die Notwendigkeit für die Fixierung, die Art der Fixierung, etc., wenn dieser Schritt muss durchgeführt werden. <ol start="5"><li> Mit der frei verfügbaren Software, wie ImageJ Software ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) oder NIH Image ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/nih-image/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/nih-image/</a> ), beide an der Entwicklung National Institutes of Health, oder ImageTool ( <a href="http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/itdesc.html" target="_blank">http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/itdesc.html</a> ) an der University of Texas Health Science Center in San Antonio, die durchschnittliche Fläche (in willkürlichen Einheiten) von kolloidalem Gold gelöscht entwickelt von 10-20 oder mehr Zellen (pro Probe) wird für jeden experimentellen Arm aus den aufgenommenen Bildern bestimmt. Statistiken können dann auf t durchgeführt werdener sammelte Ergebnisse. Zum Beispiel können die Ergebnisse aufgetragen als Mittel werden ± Standardfehler des Mittels (SEM) mit dem Student-t-Tests durchgeführt, und einem P-Wert &lt;0,05 als Maß der statistische Signifikanz zwischen Proben verwendet. Abbildungen 3 und 4 zeigen Schritte in der Analyse des Bereichs von kolloidalem Gold durch die Zelle gelöscht. </li></ol>

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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+suppressor+DAPK+inhibits+cell+motility+by+blocking+the+integrin-mediated+polarity+pathway.">The tumor suppressor DAPK inhibits cell motility by blocking the integrin-mediated polarity pathway.</a> J. Cell Biol. 172, 619-631 (2006).</li><li>Benazeraf, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+random+cell+motility+gradient+downstream+of+FGF+controls+elongation+of+an+amniote+embryo.">A random cell motility gradient downstream of FGF controls elongation of an amniote embryo.</a> Nature. 466, 248-252 (2010).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die phagokinetic Spur Motilität Assay in diesem Artikel vorgestellt ist eine einfache und sehr effektive Methode zur quantitativen Analyse von Zellmigration. Da mehrere Zelltypen 9-17 analysiert werden kann, hat diese Methode das Potenzial breiten Einsatz über mehrere Disziplinen. Die Verwendung von kolloidalem Gold beschichteten Deckgläsern erlaubt die Messung einer Gleisbereich durch einen sich bewegenden Zelle gelöscht. Der Assay kann den Effekt verschiedener Stimuli (zB Wachstumsfaktoren, Lig...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Deckgläschen (15 mm) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-545-83 </td><td></td></tr><tr><td> Gelatine 300 Bloom </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-1890 </td><td></td></tr><tr><td> Tetrachlorogoldsäure Trihydrate </td><td> Fisher Chemical </td><td> G54-1 </td><td> 14,5 mM (a Endbearbeitung Lösung) </td></tr><tr><td> Sodium Citrate </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP327-500 </td><td> 0,5% (a Endbearbeitung Lösung) </td></tr><tr><td> Paraformaldehyd </td><td> Fisher Scientific </td><td> O4042 </td><td> 3% (a Endbearbeitung Lösung) </td></tr><tr><td> 100 mm Gewebekulturschale </td><td> Sarstedt </td><td> 83,1802 </td><td></td></tr><tr><td> 12-Well-Platten </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-772-29 </td><td></td></tr><tr><td> 24-Well-Platten </td><td> Fisher Scientific </td><td> 07-200-84 </td><td></td></tr><tr><td> Techne Backofen Hybridiser HB-1D </td><td> LabPlanet </td><td> 2040500 </td><td> Der Standard Laborofen genügt </td></tr><tr><td> 10 ml Serologische Pipetten </td><td> Sarstedt </td><td> 86.1254.001 </td><td></td></tr><tr><td> Pipet-Aid Filler / Dispenser </td><td> Drummond </td><td> 13-681-15 </td><td></td></tr><tr><td> P200 Single-Channel Manuelle Pipette </td><td> Rainin </td><td> PR-200 </td><td></td></tr><tr><td> 200 ml Barrier Tips </td><td> CLP </td><td> BT200 </td><td></td></tr><tr><td> ImageJ Software </td><td> <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">htt</a>p :/ / rsb.info.nih.gov / ij / </td><td></td><td> Lizenz: Public Domain </td></tr><tr><td> Nikon Eclipse TE300 mit einem photometrics CoolSNAPfx monochrom 12-Bit-CCD-Kamera </td><td> Nikon </td><td></td><td> Eingestellt; Die meisten vergleichbaren Spezifikation hat Nikon Eclipse Ti, aber ein unteres Ende Nikon 80i wird ebenso geeignet. Andere Marken bieten auch vergleichbare Mikroskope. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Hinweis: Die Reagenzien und Geräte unten aufgeführten wurden von uns in unseren verschiedenen Studien eingesetzt. Andere Lieferungen, Lieferanten, Reagenzien und Geräte können verwendet werden, solange sie ähnliche Spezifikationen haben. </td></tr></tbody></table>

a quantitative evaluation of cell migration by the phagokinetic track motility assay

Cellular Motilität ist ein wichtiger biologischer Prozess für beide einzelligen und mehrzelligen Organismen. Es ist wichtig für die Bewegung der einzelligen Organismen zu einer Quelle von Nährstoffen oder weg von ungeeigneten Bedingungen, als auch in vielzelligen Organismen für Tissue Entwicklung, Immunüberwachung und Wundheilung, nur um ein paar Rollen 1,2,3 erwähnen. Deregulierung dieses Prozesses kann zu schweren neurologischen, Herz-Kreislauf-und immunologischen Erkrankungen, sowie verschärfte Tumorbildung führen und zu verbreiten 4,5. Molekular sind Aktin-Polymerisation und Rezeptor-Recycling erwiesen wichtige Rollen bei der Schaffung zellulären Verlängerungen (Lamellipodien), die die Vorwärtsbewegung der Zelle 6,7,8 anzutreiben spielen. Allerdings bleiben viele biologische Fragen zu Zellmigration unbeantwortet. Die zentrale Rolle für die zelluläre Motilität menschlicher Gesundheit und Erkrankungen unterstreicht die Bedeutung des Verständnisses der spezifischen mechanisms an diesem Prozess beteiligt und macht genaue Methoden zur Bewertung Zellmotilität besonders wichtig. Mikroskope werden üblicherweise verwendet, um die Bewegung von Zellen visualisieren. Allerdings bewegen Zellen eher langsam, so dass die quantitative Messung der Zellmigration eine Ressource langwieriger Prozess erfordern teure Kameras und Software, um quantitative Zeitraffer Filme von beweglichen Zellen zu schaffen. Daher ist die Fähigkeit, eine quantitative Messung der Zellmigration, die kostengünstige, nicht mühsam, und daß nutzt gemeinsamen Laborgeräten ist ausführen ein großer Bedarf für viele Forscher. Die Spur phagokinetic Motilität Assay nutzt die Fähigkeit einer Zelle zu bewegenden Goldpartikel aus seiner Bahn zu löschen, um eine Spur auf einer messbaren kolloidalem Gold beschichteten Deckgläschen 9,10 erstellen. Mit dem Einsatz von frei verfügbarer Software, können mehrere Spuren für jede Behandlung, die statistischen Anforderungen erfüllen ausgewertet werden. Der Assay kann verwendet werden, um zu beurteilenMotilität von vielen Zelltypen, wie Krebszellen 11,12, Fibroblasten 9, Neutrophilen 13, Skelettmuskelzellen 14, Keratinozyten 15, Trophoblasten 16, 17 Endothelzellen und Monozyten 10,18-22. Das Protokoll beinhaltet die Erzeugung von Folien mit Gold-Nanopartikeln (Au °), die durch eine Reduktion von Chlorgoldsäure (Au 3 +) durch Natriumcitrat erzeugt beschichtet sind. Diese Methode wurde von Turkevich et al. Im Jahr 1951 23 und dann verbesserte sich in den 1970er Jahren von Frens et al. 24,25. Als Ergebnis dieser chemischen Reduktionsschritt auszufällen Goldpartikel (10 bis 20 nm Durchmesser) aus der Reaktionsmischung und kann auf Deckgläschen, die dann bereit für die Verwendung in Zellwanderung Analysen 9,26,27 aufgebracht werden. Im Allgemeinen ist die Spur phagokinetic Motilität Assay eine schnelle, quantitative und einfache Maßnahme zellulärer Motilität. Darüber hinaus ist eskann als einfache Hochdurchsatz-Assay verwendet werden, zur Verwendung mit Zelltypen, die nicht zugänglich sind Zeitraffer Bildgebung, sowie andere Anwendungen in Abhängigkeit von den Bedürfnissen der Forscher. Zusammen, die Fähigkeit, quantitativ zu messen zellulären Motilität von mehreren Zelltypen, ohne die Notwendigkeit für teure Mikroskope und Software, zusammen mit der Verwendung von gemeinsamen Laborgeräte und Chemikalien machen den phagokinetic Spur Motilität Assay eine gute Wahl für die Wissenschaftler mit einem Interesse für das Verständnis zellulärer Motilität.

Ist ein Beispiel der Bilder unter einem Lichtmikroskop, die einen Gleisbereich durch eine einzige Zelle (a Monozyt aus unseren Experimenten ist in Abbildung 2 gezeigt) gelöscht entnommen. Unbeweglichen Zellen zu schaffen charakteristischen kleinen, ovalen oder kreisförmigen Bahnen um sich herum, die einen niedrigen Grundniveau der Bewegung für diesen stimulierten Zellen (2A und 2B). Im Gegensatz dazu sind hoch beweglichen Zellen [in unserem System, humanen Cytomegalovirus (HCMV)-infi...

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A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

Die Motilität phagokinetic Spur Assay ist ein Verfahren verwendet, um die Bewegung von Zellen beurteilen. Insbesondere misst der Test Chemokinese (random Zellmotilität) über die Zeit in einer quantitativen Weise. Der Assay nutzt die Fähigkeit von Zellen, um eine messbare Spur ihrer Bewegung auf kolloidalem Gold beschichteten Deckgläsern erstellen.

Eine quantitative Auswertung der Zellmigration durch die Phagokinetic Spur Motilität Assay

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

a-quantitative-evaluation-cell-migration-phagokinetic-track-motility

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.8K Aufrufe.  Louisiana State University Health Sciences Center. Die Motilität phagokinetic Spur Assay ist ein Verfahren verwendet, um die Bewegung von Zellen beurteilen. Insbesondere misst der Test Chemokinese (random Zellmotilität) über die Zeit in einer quantitativen Weise. Der Assay nutzt die Fähigkeit von Zellen, um eine messbare Spur ihrer Bewegung auf kolloidalem Gold beschichteten Deckgläsern erstellen.

Serie: A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true quantitative analysis of cellular inflammation. Flow cytometry is a quick alternative method to quantify immune cells in the injured brain or spinal cord tissue. Historically, flow cytometry has been used to quantify immune cells collected from blood or dissociated spleen or thymus, and only a few studies have attempted to quantify immune cells in the injured spinal cord by flow cytometry using fresh dissociated cord tissue. However, the dissociated spinal cord tissue is concentrated with myelin debris that can be mistaken for cells and reduce cell count reliability obtained by the flow cytometer. We have advanced a cell preparation method using the OptiPrep gradient system to effectively separate lipid/myelin debris from cells, providing sensitive and reliable quantifications of cellular inflammation in the injured spinal cord by flow cytometry. As described in our recent study (Beck &amp; Nguyen et al., Brain. 2010 Feb; 133 (Pt 2): 433-47), the OptiPrep cell preparation had increased sensitivity to detect cellular inflammation in the injured spinal cord, with counts of specific cell types correlating with injury severity. Critically, novel usage of this method provided the first characterization of acute and chronic cellular inflammation after SCI to include a complete time course for polymorphonuclear leukocytes (PMNs, neutrophils), macrophages/microglia, and T-cells over a period ranging from 2 hours to 180 days post-injury (dpi), identifying a surprising novel second phase of cellular inflammation. Thorough characterization of cellular inflammation using this method may provide a better understanding of neuroinflammation in the injured CNS, and reveal an important multiphasic component of neuroinflammation that may be critical for the design and implementation of rational therapeutic treatment strategies, including both cell-based and pharmacological interventions for SCI.

Quantification of cellular inflammation in the injured/pathological CNS by flow cytometry is complicated by lipid/myelin debris that can have similar size and granulation to cells, decreasing sensitivity/accuracy. We have advanced a cell preparation method to remove myelin debris and improve cell detection by flow cytometry in the injured spinal cord.

Quantitative Beurteilung der Immunzellen in das verletzte Rückenmark Tissue mittels Durchflusszytometrie: eine neue Verwendung für eine Zelle Reinigungsverfahren

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

Quantitative Analysen aller Influenza Typ A Viral Hämagglutininen und Neuraminidasen mit Universal Antikörper in Einfache Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many of these viruses have intensified in their endemic ranges and expanded to new territories, necessitating effective surveillance and control programs to respond to these threats. One strategy to monitor virus activity involves collecting large numbers of mosquitoes from endemic sites and testing them for viral infection. In this article, we describe how to handle, process, and screen field-collected mosquitoes for infectious virus by Vero cell culture assay. Mosquitoes are sorted by trap location and species, and grouped into pools containing &le;50 individuals. Pooled specimens are homogenized in buffered saline using a mixer-mill and the aqueous phase is inoculated onto confluent Vero cell cultures (Clone E6). Cell cultures are monitored for cytopathic effect from days 3-7 post-inoculation and any viruses grown in cell culture are identified by the appropriate diagnostic assays. By utilizing this approach, we have isolated 9 different viruses from mosquitoes collected in Connecticut, USA, and among these, 5 are known to cause human disease. Three of these viruses (West Nile virus, Potosi virus, and La Crosse virus) represent new records for North America or the New England region since 1999. The ability to detect a wide diversity of viruses is critical to monitoring both established and newly emerging viruses in the mosquito population.

We describe a method to process and screen field-collected mosquitoes for a diversity of viruses by Vero cell culture assay. By employing this technique, we have detected 9 different viruses from 4 taxonomic families in mosquitoes collected in Connecticut.

Nachweis von infektiösen Viren aus Field-gesammelt Moskitos von Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

Quantitative High-throughput Single-cell Zytotoxizitätstest für T-Zellen

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Continuous advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) have greatly improved our ability to study physiological or pathological processes in living organisms. MRI is also proving to be a valuable tool for capturing transplanted cells in vivo. Initial cell labeling strategies for MRI made use of contrast agents that influence the MR relaxation times (T1, T2, T2*) and lead to an enhancement (T1) or depletion (T2*) of signal where labeled cells are present. T2* enhancement agents such as ultrasmall iron oxide agents (USPIO) have been employed to study cell migration and some have also been approved by the FDA for clinical application. A drawback of T2* agents is the difficulty to distinguish the signal extinction created by the labeled cells from other artifacts such as blood clots, micro bleeds or air bubbles. In this article, we describe an emerging technique for tracking cells in vivo that is based on labeling the cells with fluorine (19F)-rich particles. These particles are prepared by emulsifying perfluorocarbon (PFC) compounds and then used to label cells, which subsequently can be imaged by 19F MRI. Important advantages of PFCs for cell tracking in vivo include (i) the absence of carbon-bound 19F in vivo, which then yields background-free images and complete cell selectivityand(ii) the possibility to quantify the cell signal by 19F MR spectroscopy.

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Tracking of cells using MRI has gained remarkable attention in the past years. This protocol describes the labeling of dendritic cells with fluorine (19F)-rich particles, the in vivo application of these cells, and monitoring the extent of their migration to the draining lymph node with 19F/1H MRI and 19F MRS.

Überwachung dendritische Zellen mit Migration<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H Magnetic Resonance Imaging

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to the infiltration of tissues with migrating inflammatory cells, primarily neutrophils.&#160;This process has the potential to be destructive to tissues if excessive or held in an unresolved state.&#160; Cocultured in vitro models can be utilized to study the unique molecular mechanisms involved in pathogen induced neutrophil trans-epithelial migration.&#160;This type of model provides versatility in experimental design with opportunity for controlled manipulation of the pathogen, epithelial barrier, or neutrophil.&#160;Pathogenic infection of the apical surface of polarized epithelial monolayers grown on permeable transwell filters instigates physiologically relevant basolateral to apical trans-epithelial migration of neutrophils applied to the basolateral surface.&#160;The in vitro model described herein demonstrates the multiple steps necessary for demonstrating neutrophil migration across a polarized lung epithelial monolayer that has been infected with pathogenic P. aeruginosa (PAO1).&#160;Seeding and culturing of permeable transwells with human derived lung epithelial cells is described, along with isolation of neutrophils from whole human blood and culturing of PAO1 and nonpathogenic K12 E. coli (MC1000).&#160; The emigrational process and quantitative analysis of successfully migrated neutrophils that have been mobilized in response to pathogenic infection is shown with representative data, including positive and negative controls.&#160;This in vitro model system can be manipulated and applied to other mucosal surfaces.&#160;Inflammatory responses that involve excessive neutrophil infiltration can be destructive to host tissues and can occur in the absence of pathogenic infections.&#160;A better understanding of the molecular mechanisms that promote neutrophil trans-epithelial migration through experimental manipulation of the in vitro coculture assay system described herein has significant potential to identify novel therapeutic targets for a range of mucosal infectious as well as inflammatory diseases.

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Neutrophil trans-epithelial migration in response to mucosal bacterial infection contributes to epithelial injury and clinical disease.&#160;An in vitro model has been developed that combines pathogen, human neutrophils, and polarized human epithelial cell layers grown on transwell filters to facilitate investigations towards unraveling the molecular mechanisms orchestrating this phenomenon.

In vitro Coculture Assay zur Bewertung pathogeninduzierter Neutrophiler Transepithelmigration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. During infection of the urinary bladder, polymorphonuclear leukocytes (PMN; neutrophils) migrate from the bloodstream and traverse the bladder epithelium. Failure to resolve infection in the absence of a neutrophilic response demonstrates the importance of PMN in bladder defense. To facilitate colonization of the bladder epithelium, uropathogenic Escherichia coli (UPEC), the causative agent of the majority of urinary tract infections (UTIs), dampen the acute inflammatory response using a variety of partially defined mechanisms. To further investigate the interplay between host and bacterial pathogen, we developed an in vitro model of this aspect of the innate immune response to UPEC. In the transuroepithelial neutrophil migration assay, a variation on the Boyden chamber, cultured bladder epithelial cells are grown to confluence on the underside of a permeable support. PMN are isolated from human venous blood and are applied to the basolateral side of the bladder epithelial cell layers. PMN migration representing the physiologically relevant basolateral-to-apical direction in response to bacterial infection or chemoattractant molecules is enumerated using a hemocytometer. This model can be used to investigate interactions between UPEC and eukaryotic cells as well as to interrogate the molecular requirements for the traversal of bladder epithelia by PMN. The transuroepithelial neutrophil migration model will further our understanding of the initial inflammatory response to UPEC in the bladder.

We developed an in vitro model that mimics an important component of the acute inflammatory response during infection of the bladder with uropathogenic Escherichia coli. The transuroepithelial neutrophil migration assay enables quantitative assessment of human neutrophil migration across bladder epithelia, cultured on permeable supports, in response to bacterial infection or chemoattractant substances.

Quantitative Bewertung der humanen neutrophilen Migration Über eine Zucht Blasenepithel

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

Konformationsänderungen Auswertung der HIV-1-Trimeric Hüllglycoproteine ​​mit eine Handy-basierte ELISA-Test

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

Hochdurchsatz-quantitative Echtzeit-RT-PCR-Assay zur Bestimmung Expressionsprofile der Typen I und III Interferon-Formationsglieder

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

Qualitative und quantitative Assays zur Detektion und Charakterisierung von Protein Antimikrobielle

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...