Unser Protokoll liefert hochaktive PCD frei von nachweisbarer Nuklease, die in jeder Lösung verwendet werden kann, in der wässrige Sauerstoff ein Kontaminant ist. Die von uns verwendenden Techniken sind einfach zu replizieren und stellen sicher, dass keine Nuklease-Verunreinigungen im Produkt vorhanden sind. Kombinieren Sie zunächst einen Mikroliter pVP91A-pcaHG PCD-Expressionsplasmid und 20 Mikroliter kommerziell erhältlichen E.coli BL21 in einer Röhre.
Streichen Sie die Röhre zu mischen, und legen Sie die Röhre auf Eis für fünf Minuten. Um die Transformationsreaktion fortzusetzen, legen Sie die Röhre 30 Sekunden lang in ein Wasserbad bei 42 Grad Celsius, dann zwei Minuten auf Eis. Fügen Sie 80 Mikroliter SOC-Medien hinzu und schütteln Sie bei 225 Rpm und 37 Grad Celsius für eine Stunde.
Als nächstes gießen Sie das Transformationsreaktionsgemisch auf einen LB-Ampicillin-Agar und verwenden Sie einen Plattenstreuer, um die Mischung zu verbreiten. Bedecken Sie die Platte mit einem Deckel, und bebrüten Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für 16 bis 18 Stunden. Danach eine Kolonie von der Platte pflücken und in 50 Mikroliter LB-Ampicillin in einem 250-Milliliter-Erlenmeyerkolben impfen.
Legen Sie den Kolben auf einen Shaker bei 225 U/min, um bei 37 Grad Celsius für 16 bis 18 Stunden zu brüten. Dann 20 Milliliter der inkubierten Kultur auf einen Vierliterkolben mit einem Liter LB-Ampicillin gefüllt übertragen. Bei 225 Umdrehungen bei 37 Grad Celsius schütteln.
Zeichnen Sie jede Stunde einen Milliliter der Kultur in eine Küvette, um die optische Dichte bei 600 Nanometern auf einem Photometer zu messen. Wenn die optische Kulturdichte um 0,5 ansteigt, erhöhen Sie die Häufigkeit der Messungen auf alle 15 Minuten, bis die OD600 0,5 erreicht. Dann den Vier-Liter-Kolben in einen Mülleimer mit Eis geben.
Wirbeln Sie den Kolben im Eisbad, um die Kulturtemperatur zu reduzieren. Den Vierliterkolben bei 17 Grad Celsius und 180 U/min in einen Brutkasten geben. Überwachen Sie den OD600 alle 20 Minuten.
Bei 0,7 OD600 ipTG und Ammoniumeisensulfat Hexahydrat-Stammlösungen hinzufügen, um eine Endkonzentration von 0,5 Millimolar bzw. 10 Milligramm pro Liter zu erreichen. Schütteln Sie die Kultur bei 180 Rpm und 17 Grad Celsius für 18 Stunden. Nach der Inkubation den Kulturkolben für zwei Minuten in Eis stellen.
Ernte einen Milliliter der induzierten Zellen in einem 1,5-Milliliter Polypropylen-Mikrozentrifugenrohr für die SDS-PAGE-Analyse. Als nächstes gießen Sie die Bakterienkultur in Flaschen, 500 Milliliter pro Flasche, für die Zentrifugation. Pellet die Kultur bei vier Grad Celsius und 3.000 mal g für 20 Minuten.
Dekantieren Sie die Überstande. Pipette, um die Pellets in jeweils 12,5 Milliliterkaltem PBS wieder aufzuhängen und alle zwei Resuspensionen in einem 50-Milliliter-Konikonrohr zu kombinieren. Pellet die Zellen wieder wie zuvor.
Entsorgen Sie dann die Überstande, und verwenden Sie eine Pipette, um 10 Milliliter Lysepuffer in jedem Rohr hinzuzufügen, um die Zellen wieder auszusetzen. Nach dem Beschallung der Rohre mit induzierten Zellen, gießen Sie das bakterielle Lysat in eine vorgekühlte Polycarbonat-Flasche. Zentrifugieren Sie 60 Minuten bei 120.000 mal g und vier Grad Celsius und gießen Sie den Überstand in ein kaltes 50-Milliliter-Konikonrohr.
Nach der Vorbereitung des FPLC-Instruments mit der nickelgeladenen Harzsäule die Probe mit 0,15 Millilitern pro Minute auf die Säule laden. Waschen Sie die Säule mit 20 Milliliter Nickelpuffer bei 20-Millimolar-Imidazol. Bewahren Sie die Wäsche zur Analyse in einem 50-Milliliter-Rohr auf.
Als nächstes waschen Sie die Säule mit 15 Milliliter Nickelpuffer bei 125-Millimolar-Imidazol. Sammeln Sie die Elution in 19 Fraktionen von jeweils 0,8 Millilitern. Waschen Sie die Säule erneut mit 15 Millilitern 100% Nickelpuffer B, und sammeln Sie weitere 75 Fraktionen von jeweils 0,2 Millilitern.
Fahren Sie mit der Analyse der gesammelten Fraktionen auf 12%SDS-PAGE Gelen fort, um das Vorhandensein von PCD zu bestätigen. Fügen Sie zunächst 35 Mikroliter Reaktionspuffer zu einem 1,5-Milliliter Polypropylen-Mikrozentrifugenrohr hinzu. Kombinieren Sie in der Röhre fünf Mikroliter der Spitzenchromatographiefraktionen und 500 Nanogramm drei-Kilobase-Paar supercoiled Plasmid pXba.
Legen Sie die Röhre in ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius für eine Stunde. Nach der Zubereitung von Agarose-Gel nach dem Manuskript, fügen Sie 30 Mikroliter jeder Reaktion in Brunnen im Gel. Elektrophorese bei 10 Volt pro Zentimeter bei Umgebungstemperatur für etwa eine Stunde.
Nun hat der orange G Farbstoff das Ende des Gels erreicht. Verwenden Sie sofort einen Fluoreszenzscanner, um das Ethidiumbromidsignal des Gels abzubilden. Bestimmen Sie mit der Funktion der Intensität und der Bildpixelgröße das Pixelvolumen der verschiedenen DNA-Arten, z. B. übergewickelte, lineare und genickte Kreise.
Um den Prozentsatz jeder DNA-Art zu bestimmen, dividieren Sie das Pixelvolumen einer einzelnen DNA-Spezies durch das Gesamtpixelvolumen für alle einzelnen Arten. Die SDS-PAGE-Analyse zeigt, dass der zweite Elutionspeak eine minimale Proteinkontamination enthält, die nahezu reinen PCD-Heterodimer und eine minimale bis nicht nachweisbare Nukleaseaktivität darstellt. Kombinieren Sie also diese 10 Fraktionen aus der zweiten PCD-Elution in einem Fünf-Milliliter-Konusrohr zur weiteren Analyse.
Nach größenausschlusschromatographiereinigung von PCD, in einem Vier-Grad-Celsius-Kälteraum, kombinieren in einem Mikrozentrifugenrohr geeignetes Volumen von Natriumchlorid, Trishydrochlorid, Magnesiumchlorid, Dithiothreitol, PCA und supercoiled Plasmid pXba, um einen 5X-Bestand zu machen. Legen Sie eine 96-Well-Flachbodenplatte auf Eis und übertragen Sie 10 Mikroliter der kombinierten 5X-Lösung auf die Brunnen. Unmittelbar vor der Analyse zu jedem Brunnen 10 Mikroliter der einzelnen PCD SEC-Fraktionen hinzufügen.
Stellen Sie den Plattenleser auf eine Innentemperatur von 37 Grad Celsius ein und übertragen Sie die 96-Well-Platte auf den Plattenhalter. Ziehen Sie den Plattenhalter in das Gerät ein und messen Sie die Absorption in 290 Nanometern in 20-Sekunden-Intervallen für eine Stunde. Stellen Sie das Instrument fünf Sekunden vor jeder Lesung ein, um die Platte zu schütteln.
Nach einer Stunde 10 Mikroliter Stop-Lösung zu jedem Brunnen hinzufügen, um die Reaktionen zu beenden. Führen Sie die Gelelektrophorese für die PCD SEC-Fraktionen durch. Wählen Sie Fraktionen mit der meisten PCA-Oxidationsaktivität, die durch verminderte Absorption und keine beobachtete Nukleasekontamination angezeigt wird.
Messen Sie die Absorption bei 280 Nanometern und berechnen Sie die gesamte PCD-Konzentration basierend auf der Absorption und dem Aussterbekoeffizienten. Bewahren Sie die ausgewählten Fraktionen für die Langzeitlagerung bei minus 80 Grad Celsius auf. In diesem Experiment wurde festgestellt, dass rekombinante PCD, ein Heterodimer von Hexahistidin mit dem Tag pcaH und pcaG, in E.coli exprimiert wurde.
Der Heterodimer wurde zunächst durch Nickelaffinitätschromatographie gereinigt. Die Absorption wird blau und die prozentuale Konzentration des Nickelpuffers B rot dargestellt. Der Durchfluss zeigt die löslichen bakteriellen Proteine, die nicht an das Nickelharz gebunden sind.
Einige PCD eluiert in Gegenwart von 125-Millimolar Imidazol, aber die Mehrheit des Proteins eluiert in 250-Millimolar Imidazol. Repräsentative SDS-PAGE-Analyse zeigt, dass die Fraktionen aus dem Elutionsschritt frei von Verunreinigungen waren. Agarose-Gel des Nuklease-Assays zeigt Kontamination durch Vergleich mit der Negativkontrolle ohne zugesetztes Protein und eine positive Kontrolle, die mit einer DNA-Nuklease kontaminiert ist.
Die Quantifizierung der verschiedenen DNA-Arten, die im Agarose-Gel-Nuklease-Assay beobachtet wurden, zeigt, dass die Fraktionen 29 bis 38 eine geringe Nukleaseaktivität hatten, die ausgewählt wurde, um von der SEC kombiniert, konzentriert und weiter gereinigt zu werden. Daten aus drei repräsentativen SEC-Fraktionen zeigten, dass die gereinigte PCD die Absorption auf 290 Nanometer reduzierte, was auf eine Oxidation von PCA hindeutet. Anschließend kann die gereinigte PCD im gewünschten Sauerstoffaufräumsystem eingesetzt und optimiert werden.
Dadurch wird die genaue Menge an PCD bestimmt, die für das System erforderlich ist. Diese Technik wurde verwendet, um die Lebensdauer von Fluorophoren in Einzelmolekülmikroskopie-Experimenten zu verlängern, was längere Zeiträume der Datenerfassung ermöglicht hat. Die verwendete Ultrazentrifuge ist gefährlich.
Achten Sie darauf, dass die Zentrifugen vor dem Spinnen richtig ausbalanciert sind. Ethidiumbromid ist ein gefährliches Reagenz. Vermeiden Sie den Kontakt, indem Sie persönliche Schutzausrüstung tragen, und entsorgen Sie sie entsprechend.
