Ganglioside werden auf allen Zelloberflächen von Wirbeltieren exprimiert und sind besonders häufig auf Nervenzellen vorhanden. Sie regulieren die Zellsignalisierung und die Zell-Zell-Erkennung. Dieses Protokoll führt die Gangliosidisolierung und -analyse ein.
Die Techniken wurden ausgewählt, um die Gangliosiderträge im Großen und Kleinen zu maximieren und gleichzeitig die Reinigung zu rationalisieren. Wir beschreiben auch Methoden, um relativ schnell qualitative und semiquantitative Gangliosidanalysen durchzuführen. Das Studium von Lipiden, insbesondere von polaren Lipiden wie Gangliosiden, erfordert andere Werkzeuge und Techniken als die Arbeit mit Proteinen oder Nukleinsäuren.
Dieses Video macht Sie mit der Arbeit mit diesen Molekülen vertraut. Da Lösungsmittel wie Chloroform und Tetrahydrofuran gängige Kunststoffe lösen, verwenden wir während dieser Verfahren Glasflaschen und Fläschchen mit Teflon-ausgekleideten Kappen, Glaspipetten, Glas, Edelstahl-Mikrospritzen und Teflonglas-Homogenisatoren. Andernfalls entstehen Kunststoffpolymere in den Produkten, die die Analysen stören können.
Fügen Sie zunächst 4,1 Milliliter Wasser pro Gramm Gewebenassgewicht hinzu und homogenisieren Sie es mit 10 Hüben. Fügen Sie 13 Milliliter Methanol pro Gramm Gewebe hinzu. Auf eine Umgebungstemperatur von 22 Grad Celsius übertragen und mischen.
Übertragen Sie das Gewebe in ein dickwandiges, verschraubtes Glasrohr mit einem mit PTFE ausgekleideten Schraubverschluss und mischen Sie es gründlich. Fügen Sie 6,5 Milliliter Chloroform pro Gramm Gewebe hinzu, verschließen Sie es und mischen Sie es gründlich. Zentrifen Sie bei 450 mal g für 15 Minuten.
Übertragen Sie dann den klaren Überstand auf ein frisches, verschraubtes Rohr und messen Sie das Volumen als wiedergewonnenes Extraktvolumen. Für die Partitionierung fügen Sie dem klaren Überstand das 0,173-fache des wiedergewonnenen Wasservolumens hinzu. Dann kappen Sie es.
Wirbel kräftig. Zentrifen Sie bei 450 mal g für 15 Minuten. Die obere Phase, die die Ganglioside enthält, wird in ein frisches Glasrohr mit einem mit PTFE ausgekleideten Schraubverschluss überführt.
Um eine Umkehrphasen-Kartuschenchromatographie durchzuführen, verwenden Sie eine Fünf-Milliliter-Glasspritze, um eine tC18-Festphasenextraktionskartusche mit drei Millilitern Methanol zu waschen. Dann fügen Sie drei Milliliter Chloroform-Methanol-Wasser in einem Verhältnis von zwei zu 43 zu 55 hinzu. Laden Sie die obere Phase aus dem vorherigen Schritt durch dieselbe Glasspritze auf die tC18-Kartusche.
Sammeln Sie den Durchfluss und laden Sie ihn erneut auf die Säule, um die Adsorption zu optimieren. Waschen Sie die Kartusche mit drei Millilitern Chloroform-Methanol-Wasser und dann mit drei Millilitern Methanol-Wasser. Die Ganglioside mit drei Millilitern Methanol zu einem frischen, verschraubten Schlauch eluieren.
Verdampfen Sie unter einem sanften Stickstoffstrom bei einer Temperatur von weniger als oder gleich 45 Grad Celsius bis zur Trocknung. In Methanol mit einem Milliliter pro Gramm Nassgewicht des ursprünglichen Gewebes auflösen. Geben Sie 100 Gramm graue Substanz des Gehirns in einen Mixer und fügen Sie einen Milliliter pro Gramm Gehirnnassgewicht von gekühltem, 10-millimolarem Kaliumphosphatpuffer mit einem pH-Wert von 6,8 hinzu.
Dann 20 Sekunden lang auf niedrigem Niveau homogenisieren. Fügen Sie acht Milliliter Tetrahydrofuran pro Gramm Gehirnnassgewicht hinzu und homogenisieren Sie es für 10 Sekunden auf niedrigem Niveau. In Glaszentrifugenflaschen dekantieren und 15 Minuten lang mit 5.000 x g zentrifugieren.
Sammeln Sie den Überstand, messen Sie sein Volumen und übertragen Sie ihn dann in einen Glastrichter. Fügen Sie 0,3 Milliliter Ethylether pro Milliliter des Überstands hinzu. Kräftig schütteln.
Dann lassen Sie es 30 Minuten lang ungestört sitzen, wobei sich zwei Phasen, eine obere Ätherphase und eine untere wässrige Phase, trennen. Sammeln Sie die untere Phase, die die Ganglioside enthält, in eine Glasflasche mit einem mit PTFE ausgekleideten Verschluss. Zu der oberen Ätherphase, die im Separatorentrichter verbleibt, fügen Sie 0,1 Milliliter Wasser pro Milliliter ursprünglichen Überstand aus dem vorherigen Schritt hinzu.
Kräftig schütteln. Erlauben Sie die Trennung von Phasen. Dann sammeln Sie die untere wässrige Phase und kombinieren Sie sie mit der zuvor gesammelten unteren Phase.
Die kombinierten unteren Phasen zu einem trockenen Pulver verdampfen und wiegen. Um eine Umkehrphasenchromatographie durchzuführen, waschen Sie eine großflächige tC18-Festphasen-Extraktionskartusche vor, indem Sie 50 Milliliter Lösungsmittel mit Vakuum oder Druck für weniger als eine Minute pro Waschgang durch die Säule leiten. Laden Sie die obere Phase aus der Phasentrennung nach der Verseifung durch Vakuum oder Druck auf die Säule.
Sammeln Sie dann den Durchfluss, laden Sie ihn neu und sammeln Sie den Durchfluss erneut für die nachfolgende Analyse. Waschen Sie die Säule mit je 30 Millilitern Chloroform-Methanol-Wasser, gefolgt von Methanol-Wasser. Dann die Ganglioside mit 50 Millilitern Methanol und dann wieder mit 10 Millilitern Methanol eluieren.
Sammeln Sie jede Wäsche und Elution separat. Verwenden Sie die Dünnschichtchromatographie oder TLC, um zu bestätigen, dass Ganglioside im Durchfluss fehlen und in der ersten Elution von Methanol gewaschen und eluiert werden. Die eluierten Ganglioside zu einem trockenen Pulver verdampfen und wiegen.
Um TLC durchzuführen, gießen Sie das laufende Lösungsmittel in eine 10 x 10 Zentimeter große TLC-Glaskammer mit einer Edelstahlabdeckung, so dass die Lösungsmitteltiefe 0,5 Zentimeter beträgt. Decken Sie die Kammer ab und lassen Sie sie etwa 10 Minuten lang ausgleichen. Waschen Sie eine 10-Mikroliter-Hamilton-Spritze mit einer abgeschrägten Nadel mit Methanol.
Ziehen Sie einen Mikroliter Methanol in eine Glasspritze, um das tote Volumen der Nadel zu füllen, und dann einen Mikroliter Probe oder Standard. Setzen Sie die Probe gleichmäßig auf die fünf Millimeter, vormarkierten Linien, bis weniger als ein Mikroliter Methanollösungsmittel in der Spritze verbleibt. Lassen Sie die Platte bei 22 Grad Celsius trocknen, nachdem alle Proben gesichtet wurden.
Legen Sie die gefleckte und getrocknete Platte auf die voräquilibrierte TLC-Kammer, wobei die Unterkante in das laufende Lösungsmittel eingetaucht ist. Lassen Sie das laufende Lösungsmittel durch Kapillarwirkung die Platte hinauffahren, bis die Lösungsmittelfront innerhalb eines Zentimeters von der Oberseite der Platte reicht. Entfernen und markieren Sie die Lösungsmittelfront am Rand der Platte mit einem Bleistift.
Lassen Sie die Lösungsmittel entweder ungestört oder unter milder Luftströmung vollständig verdampfen. Legen Sie in einem chemischen Abzug die TLC-Platte mit dem aufgelösten Ganglioside-Ursprung kopfüber in einen abgeschnittenen Karton, um die Wände der Haube vor Säurespray zu schützen. Legen Sie Resorcin Sprühreagenz in ein Glas-TLC-Sprühgerät.
Befestigen Sie es an einer Druckstickstoffquelle und sprühen Sie die Platte leicht diagonal in vertikaler und horizontaler Richtung. Decken Sie die Platte sofort mit einer sauberen, trockenen Glasabdeckplatte mit den gleichen Abmessungen ab und befestigen Sie die Abdeckplatte mit Bindemittelclips. Erhitzen Sie die abgedeckte Platte bei 125 Grad Celsius für 20 Minuten.
Ganglioside erscheinen dunkelviolett vor weißem Hintergrund. Um eine Lipidfärbung durchzuführen, tauchen Sie die TLC-Platte mit der aufgelösten Gangliosid-Ursprungsseite nach unten in ein Becherglas, das die Anisaldehydfärbung enthält. Tauchen Sie für etwas mehr als zwei Sekunden in die laufende Front ein.
Lassen Sie es dann abtropfen. Erhitzen Sie die TLC-Platte auf einer heißen Platte bei niedriger Temperatur, um sich zu entwickeln. Dieses Protokoll liefert Ganglioside in ausreichender Menge und Reinheit für die qualitative und quantitative Bestimmung.
Die TLC-Auflösung von einem Mikroliter liefert reichlich Material für den Nachweis von Resorcin und löst alle wichtigen Hirnganglioside für Wildtyp- und genetisch veränderte Mäuse auf. Obwohl die hergestellten gemischten Ganglioside nicht frei von anderen Hauptlipiden sind, sind sie von ausreichender Reinheit für die massenspektrometrische Bestimmung entweder als native gereinigte Ganglioside im negativen Modus oder nach Prämethylierung im positiven Modus. Die großflächige Reinigung umfasst Extraktion, Verseifung und HPLC-Auflösung, um gereinigte Hauptganglioside des Gehirns bereitzustellen, die für biologische Experimente und für weitere chemische und enzymatische Modifikationen geeignet sind.
Es werden ein beispielhaftes HPLC-Profil und anschließende TLC-Analysen gezeigt. Eine Alkalibehandlung oder Verseifung ist notwendig, um kontaminierende Phospholipide zu hydrolysieren und zu entfernen, hydrolysiert aber auch natürliche Modifikationen von Gangliosiden wie O-Acetylierte Sialinsäuren, die in einigen Kontexten wichtig sein können. Genaue Lösungsmittelverhältnisse für die Extraktion, die Lösungsmittelverteilung und die TLC-Auflösung sind entscheidend, um die Gewinnung, Reinheit und Analyse zu verbessern.
Von Krebs über Stoffwechsel bis hin zur Gehirnfunktion sind Ganglioside physiologische Modifikatoren und therapeutische Ziele. Gangliosisolierung, -reinigung und -analyse sind Eckpfeiler für die biomedizinische Entdeckung und therapeutische Entwicklung.
