Dieses Projekt wurde von NIH-Stipendien EY025290, GM127652 und University of Rochester Anschubfinanzierung finanziert.

(1) Herstellung von BacMam Ausdruck Baculoviren
<ol><li>Legen Sie die kodierende Sequenz eines gewünschten Säugetier Bestrophin Proteins in der pEG BacMam Vektor-18 mit einer Protease erkennungssequenz Tabak Etch Virus (TEV), gefolgt von einer GLP-10 x His-Tag am C-Terminus des Proteins.</li>
	<li>Transient transfizieren Sie das expressionsplasmid in Klebstoff HEK293 Zellen19,20,21,22,23. Überprüfen Sie den Ausdruck des GFP-Fusionsproteins unter einem fluoreszierenden Mikroskop mit 10 X oder 20 X Vergrößerung, eine 488 nm Anregungsquelle und 510 nm Emission Filter (Abbildung 1A). Hinweis: Polymer-basierten Transfektion wird routinemäßig mit 1 μg von Plasmid DNA für ein 35 mm-Gericht HEK293 Zellen durchgeführt.</li>
	<li>Produzieren Sie Baculoviren in Sf9 Insektenzellen, wie zuvor beschrieben16,17. Hinweis: Die Passage 3 (P3)-Virus, das verwendet wird, um die HEK293-F-Zellen für die Proteinproduktion infizieren, kann 1 Monat bei 4 ° C gelagert werden.</li>
	<li>Bestimmen Sie der Titer (infektiöse Einheiten) von der P3-Virus durch die Plaque Bildung Assay16,17. Hinweis: Da das Protein des Interesses mit GFP markiert ist, ist eine schnellere Methode zur Überprüfung von infektiöser Einheiten Sf9 Zellen mit seriellen Verdünnungen des Virus zu infizieren und die Anzahl der fluoreszierenden Zellen nach 48 h.</li>
</ol>(2) Protein-Expression
<ol><li>Pflegen Sie die HEK293-F-Zellen in einer SUSPENSIONSKULTUR mit dem HEK293-F Ausdruck Medium in einem 37 ° C befeuchteten Inkubator mit 8 % CO2. Verwenden Sie Einweg-Kulturflaschen, die 2 - 2,5 mal größer als das kulturvolumen und die Kultur auf einer orbitalen Plattform 135 u/min drehen. Hinweis: Es wird empfohlen, die Zellen zu infizieren, wenn sie zwischen 5 und 30 Passagen sind und diese Maßnahmen im Rahmen einer Zelle Kultur Kapuze durchzuführen.</li>
	<li>24 h vor der Virusinfektion, ein 15 μl Aliquot der Zellkultur 15 μl Trypan blau hinzu, und überprüfen Sie die Zelldichte und Rentabilität mit einer Hemocytometer unter dem Mikroskop. Verdünnen Sie die Zellen auf 0.6 x 106 Zellen/mL in 2 x 2 L Flaschen jeweils mit 500 mL Medium bei 37 ° c vorgewärmt Hinweis: Abgestorbene Zellen sind blau von Trypan blau gefärbt. Die gewünschte Zellviabilität ist > 95 %.</li>
	<li>Am Tag der Infektion überprüfen Sie die Zelldichte und Lebensfähigkeit (Schritt 2.2). Hinweis: Eine hohe Zellviabilität von > 95 % ist wichtig für effiziente Infektion und Protein-Expression. Die erwarteten Zelldichte ist ~1.0 X 106 Zellen/mL (Erwachsene Übernachtung von 2 x 500 mL von 0.6 x 106 Zellen/mL Zellkultur). Die erwarteten Gesamtzahl der Zellen ist ~1.0 X 109.</li>
	<li>Die Zellen in einer Vielzahl von Infektionen (MOI) 5 P3 Baculoviren hinzufügen. Zur Bestimmung der Menge des Virus zu impfen, verwenden Sie die folgende Gleichung: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57832/57832eq1.jpg">
</li>
	<li>Schütteln Sie die Zellen auf der orbital-Plattform bei 135 u/min in einem befeuchteten 37 ° C Inkubator mit 8 % CO2 für 24 h.</li>
	<li>Die Zellkultur 10 mM Natrium Butyrat hinzufügen und weiter Inkubation für 48 h. Hinweis: Für einige Proteine, Reduzierung der Zelle Kultur Temperatur auf 30 ° C nach Natrium Butyrat Zusatz Ausdruck und Stabilität verbessern kann.</li>
	<li>Überprüfen Sie unter dem Fluoreszenzmikroskop mit 10 X oder 20 X Vergrößerung, eine 488 nm Anregungsquelle und 510 nm Emission Filter der Prozentsatz und die Helligkeit der grünen Zellen, die direkt der Proteinausbeute (Bestrophin-GLP-10xHis) (Abbildung 1 b) darstellen. Hinweis: Der Anteil der grünen Zellen ergibt sich aus: 100 x (grüne Zellen/Gesamt-Zellen). Gute proteinexpressionsgrad wird durch starke grüne Fluoreszenz unter dem Mikroskop.</li>
	<li>Ernte der Zellen durch Zentrifugieren bei 1.000 x g bei 4 ° C für 20 min. Überstands entfernen und wieder auszusetzen, die Zelle Pellets mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) zu einem Endvolumen von ca. 80 mL. Split die Zellsuspension in 2 x 50 mL konische Röhrchen und Zentrifuge bei 1.000 x g bei 4 ° C für 20 min. speichern die Zelle Pellets bei-80 ° C.</li>
</ol>(3) Proteinreinigung
<ol><li>Inkubieren Sie die konische Rohre, enthält die Zelle Pellets in einem mitreißenden Wasserbad bei Raumtemperatur für 10-15 min, damit sie auftauen. Wieder aussetzen der Zellen in 2 x (w/V) Volumen des Puffers (Tabelle 1) (z. B. 10 g Zelle Pellets in 20 mL Puffer) ergänzt mit Proteinase-Inhibitoren (Aprotinin, Leupeptin, Pepstatin A und Phenylmethylsulfonyl Fluorid) bei 0,1-1,0 mM. Pipettieren rauf und runter ausgiebig, um eine homogene Zellsuspension zu erhalten.</li>
	<li>Lösen Sie die Zellen mit einem Hochdruck-Homogenisator. Führen Sie die Zellsuspension durch Homogenisator bei 7 bis 10 MPa für eine Gesamtmenge von 3 - 4 mal vollständige Homogenisierung zu erreichen. Halten Sie die Zelle lysate, auf Eis für 2-3 Minuten zwischen den runden.</li>
	<li>Die Zelle lysate Waschmittel [z. B. 2 % w/V Sol-Klasse n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM)] hinzufügen. Inkubieren Sie mit Agitation für 1 h bei 20 ° C, die Membranproteine zu extrahieren. Hinweis: Die Art des Reinigungsmittels muss für jedes Protein Ziel18,24optimiert werden.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie bei 150.000 x g in einer Ultrazentrifuge bei 4 ° C für 1 h. Hinweis: Die folgenden Schritte sind bei 4 ° c durchgeführt.</li>
	<li>Sammeln Sie die klare Zelle lysate und fließen, die es durch eine 5 mL seine Falle Ni2 +- NTA Affinität Säule equilibriert mit Puffer (Tabelle 1) voraus. Hinweis: Nach der Zentrifugierung, wird die klare Zelle lysate zwischen ein Pellet an der Unterseite und eine trübe Schicht obenauf eingeklemmt. Verwenden Sie ein 10 mL transferpipette sorgfältig sammeln die klare lysate und wechseln Sie dann in eine 1 mL pipettieren für die letzten paar Milliliter lysate. Vermeiden Sie das Pellet, das Ni2 + Spalte verstopfen kann; aber eine kleine Menge der Deckschicht ist in Ordnung oder kann mit einem 1,5 µm Filter herausgefiltert werden.</li>
	<li>Waschen Sie die Spalte mit 25 mL Puffer B und dann 40 mL Puffer C (Tabellen 2 und 3, beziehungsweise). Hinweis: Dies ist ein guter Ort für eine Pause, da total Reinigung bis zu 12 Std. dauern kann und das Protein stabil bleiben kann, während die Spalte über Nacht angeschlossen.</li>
	<li>Legen Sie die Spalte auf ein schnelles Protein Flüssigkeitschromatographie (FPLC) System und eluieren Sie das Protein von der Säule mit 13 mL Puffer D (Tabelle 3) mit Fraktionierung. Sammeln Sie die Protein-angereicherte Fraktionen nach der UV-Absorption-Anzeige. Hinweis: The FPLC Bedingungen lauten wie folgt: eine 1,0 mL Bruchteil Größe, ein Pre-Spalte Druck Alarm auf 0,3 MPa und einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 mL/min eingestellt.</li>
	<li>Messen Sie die eluierten Proteinkonzentration Produkt auf einem Microvolume Spektralphotometer. Lesen Sie die Absorption bei 280 nm.</li>
	<li>(Optional) Um die GLP-10xHis-Tag entfernen, Hinzufügen der TEV-Protease in einem Massenverhältnis von 1:1 und bei 4 ° C für 30 min inkubieren. Hinweis: Die Beschriftung kann oder beeinträchtigen nicht die Funktion oder Struktur des gereinigten Kanals. Die TEV berechnen von Volumen und Konzentration des Proteins von Schritten 3.7-3.8 gesammelt. Zum Beispiel, wenn 10 mL der Elution Produkt erfasst und bei 0,1 mg/mL, die Gesamt-Protein gemessen Masse ist 10 x 0,1 = 1 mg und 1 mg von TEV für Verdauung verwendet werden.</li>
	<li>Das Protein mit einer zentrifugalen 15 mL (50 oder 100 kDa) konzentrieren Filtereinheit von Spinnen bei 4.000 x g bei 4 ° C zu einem Endvolumen von 400-500 μL (für eine 2 mL probenbeladung Schleife auf FPLC). Hinweis: Die sandbacken Zeit für Konzentration hängt von der Konzentration und der Größe des Proteins. Um übermäßige Konzentration zu vermeiden, kann die verursachen Proteinfällung, spin für 10 min auf den ersten, dann das restliche Volumen zu beobachten und schätzen Sie die Zeit für einen weiteren Spin (z. B. 2-5 min), und so weiter, um das endgültige Volumen zu erhalten. Pipettieren zwischen den Spins, das Protein zu zerstreuen, die an der Unterseite des Filters gezogen wird.</li>
	<li>Übertragen Sie das konzentrierte Protein um eine neue 1,5 mL tube und jedem Niederschlag oder Luftblasen aus dem konzentrierten Produkt entfernen. Mit drehen > 12.000 x g für 5-10 min bei 4 ° C und Sammeln der Überstand in ein neues 1,5 mL-Tube.</li>
	<li>Laden Sie das fertige Produkt mit einer 1 mL Spritze und eine Runde Spitze Nadel auf einem FPLC-System für die Größe-Ausschluss-Chromatographie mit einer Größe-Ausschluss-Spalte vor equilibriert mit Puffer E (Tabelle 5). Hinweis: The FPLC Bedingungen lauten wie folgt: eine 0,5 mL Bruchteil Größe, ein Pre-Spalte Druck Alarm eingestellt bis 2,50 MPa, ein Volumenstrom eingestellt auf 30 mL des Puffers E (Tabelle 5), und eine Durchflussmenge auf 0,5 mL/min eingestellt.</li>
	<li>Beachten Sie, dass brav Proteine als einzige Spitze (Abbildung 2A) laufen und sammeln die Protein-Fraktion(en) entspricht, dass Peak (Abbildung 2A).</li>
	<li>Das Protein mit 4 mL bzw. 0,5 mL zentrifugale Filter-Einheit (der das gleiche Molekulargewicht Cut-Off wie bei Schritt 3.10) und Spin bei 4.000 x g bei 4 ° C, eine Endkonzentration von 5-10 μg/μL zu konzentrieren. Verwenden Sie das Spektrophotometer um das Endprodukt Konzentration (Schritt 3,8). Hinweis: Zentrifugation Zeit variiert, da das Endprodukt Volumen zwischen Reinigung Studien unterschiedlich sein kann. Zentrifugation dauert in der Regel 10-20 min. Es wird empfohlen, pipettieren zwischen den Spins, das Protein zu zerstreuen, die an der Unterseite des Filters gezogen wird.</li>
	<li>Übertragen Sie das konzentrierte Protein auf eine neue 1,5 mL Tube. Entfernen Sie alle Niederschlag durch Zentrifugieren bei > 12.000 x g für 5-10 min bei 4 ° C. Übertragen Sie den überstand auf eine neue 1,5 mL Tube. 10 μl-Aliquots für die Lagerung bei-80 ° C und speichern Sie einer 2-5 μL kleine aliquoten auf ein 4-15 % Steigung SDS-PAGE Gel mit 9 V/cm (Abb. 2 b) ausgeführt.</li>
	<li>Bestätigen Sie die Identität des gereinigten Proteins durch Massenspektrometrie8. Hinweis: In-vitro- Analyse der Funktion und Struktur des gereinigten Proteins können durch planare Lipid Bilayer und Röntgen-Kristallographie, jeweils5,8durchgeführt werden.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Dieses Protokoll beschreibt eine nützliche Pipeline für Ausdruck und Reinigung von Säugetieren Bestrophin Ionenkanäle für zukünftige in-vitro- Analysen verwendet werden. Während das FPLC-Gerät für die Größe-Ausschluss Chromatographie erforderlich ist, genügt eine Spritzenpumpe für alle Schritte der Affinitätschromatographie einschließlich verbindlich, Waschen und eluierenden. Wenn Sie eine Spritzenpumpe, Push-Lösungen (in einer Spritze) durch eine Spalte verwenden, gilt es die Frühling-Seite zur...

Bestrophins sind eine Familie von Ionenkanälen konserviert durch Arten variierend von Bakterien auf Menschen1. Beim Menschen kodiert das BEST1 -Gen liegt auf Chromosom 11q12.3 das Membranprotein Bestrophin-1 (BEST1), die überwiegend in der basolateralen Membran des retinalen Pigmentepithels (RPE) Pigmentzellen der Augen2,3 ausgedrückt wird ,4. BEST1 fungiert bestehend aus 585 Aminosäuren, die ersten ~ 350 davon sind hoch konserviert zwischen den Arten und die transmembranen Bereich enthalten, ein CaCC Menschen1,5,6. Darüber hinaus funktionieren die homologe BEST1 bei Hühnern und Klebsiella Pneumoniae als Homopentamers7,8, was auf ein hohes Maß an Schutz im Laufe der Evolution.
Beim Menschen wurden über 200 Mutationen im gen BEST1 klinisch zu einer Gruppe von Netzhautdegeneration Krankheiten genannt Bestrophinopathies1,9verbunden. Fünf spezifische Bestrophinopathies wurden berichtet, einschließlich beste Krankheit, Altersdiabetes vitelliforme Dystrophie, autosomal dominante Vitreoretinochoroidopathy, autosomal rezessive Bestrophinopathy und Retinitis Pigmentosa3,4, ,10,11,12,13,14. Diese Krankheiten, die zu verminderter Sehkraft und sogar Blindheit führen, sind derzeit nicht behandelbar. Um therapeutische Behandlungen und potenziell personalisierte Medizin zu entwickeln, ist es wichtig zu verstehen, wie diese BEST1 krankheitsverursachende Mutationen beeinflussen die Funktion und Struktur der BEST1 Kanal15. Für diese Zwecke müssen Forscher erhalten gereinigte Bestrophin (Wildtyp und/oder Mutanten) Kanäle und Durchführung von in-vitro- Analysen5,8.
Der erste wichtige Schritt ist die Expression von Bestrophin Kanäle aus höheren Arten in Säugerzellen. Wie Baculovirus Transduktion von HEK293-F-Zellen (BacMam System) eine leistungsfähige Methode Membran Proteine16,17heterologously zum Ausdruck zu bringen ist, dieses Protokoll nutzt einen optimierte BacMam-Vektor (pEG BacMam) für robuste Ausdruck der Ziel Protein18, die in diesem Fall ein Säugetier Bestrophin Homolog ist. Dieser Vektor wurde für den Ausdruck von verschiedenen Membranproteinen, einschließlich G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, Kernrezeptoren und andere Ionen-Kanäle18verwendet. Es gibt auch Hinweise, dass die produzierten Proteine für Kristallographie18geeignet. Mit hohen Ebenen des Ausdrucks in HEK293-F-Zellen können die Proteine dann mit Chromatographie gereinigt werden; insbesondere können im Falle von Bestrophins, Affinität und Größe-Ausschluss Chromatographie verwendet werden.
Sobald dieses Protokoll für einen Bestrophin-Kanal abgestimmt ist, kann das gereinigte Protein dann für seine Funktion und Struktur durch planare Lipid Bilayer und Röntgen-Kristallographie, jeweils5,8analysiert werden. Insgesamt stellen diese Techniken eine mächtige Pipeline für funktionelle und strukturelle Untersuchungen von Bestrophins und anderen Ionenkanälen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="680">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:148px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AC327265000&#160;</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AC446212500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">G33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Imidazole</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AC301870010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">MgCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AC197530010&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TCEP</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AA4058704&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Aprotinin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AAJ63039MA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leupeptin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AAJ61188MB&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pepstatin A</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AAJ20037MB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AC215740050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DDM sol-grade</td>
			<td style="width:148px;">Anatrace</td>
			<td style="width:119px;">D310S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DDM anagrade</td>
			<td style="width:148px;">Anatrace</td>
			<td style="width:119px;">D310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sf-900 II SFM</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">10902179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FreeStyle medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">12338018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoDrop spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">High pressure homogenizer</td>
			<td style="width:148px;">Avestin</td>
			<td style="width:119px;">Emulsiflex-C5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HisTrap column</td>
			<td style="width:148px;">GE</td>
			<td>17-5248-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superdex-200 column</td>
			<td style="width:148px;">GE</td>
			<td style="width:119px;">28990944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AKTA Pure</td>
			<td style="width:148px;">GE</td>
			<td style="width:119px;">29018224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ultra-15 centrifugal filter units</td>
			<td style="width:148px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">UFC910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ultra-4 centrifugal filter units</td>
			<td style="width:148px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">UFC810024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ultra-0.5 centrifugal filter units</td>
			<td style="width:148px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">UFC505024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Optima XE-90 Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:148px;">Beckman Coulter</td>
			<td>A94471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mini-PROTEAN Tetra Cell</td>
			<td style="width:148px;">Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mini-PROTEAN precast gel</td>
			<td style="width:148px;">Bio-Rad</td>
			<td>4561084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T100 Thermal Cycler</td>
			<td style="width:148px;">Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PolyJet transfection reagent</td>
			<td style="width:148px;">SignaGen</td>
			<td>SL100688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pEG BacMam vector</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Obtained from the Gouaux lab at Vollum Institute</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression and purification of mammalian bestrophin ion channels

Das menschliche Genom kodiert vier Bestrophin Paralogs, BEST1, BEST2, BEST3 und BEST4. BEST1, kodiert durch das gen BEST1 ist eine Ca2 +-aktiviert Cl– Kanal (CaCC) überwiegend in retinalen Pigmentepithels (RPE) ausgedrückt. Die physiologische und pathologische Bedeutung der BEST1 wird durch die Tatsache hervorgehoben, dass über 200 verschiedene Mutationen im gen BEST1 genetisch mit einem Spektrum von mindestens fünf retinalen degenerative Erkrankungen, wie Best vitelliforme verknüpft wurden Macular Dystrophie (beste Krankheit). Daher hält das Verständnis der Biophysik der Bestrophin Kanäle der Ebene der Einzelmolekül-enorme Bedeutung. Gereinigte Säugetier-Ionenkanäle zu erhalten ist jedoch oft eine große Herausforderung. Hier berichten wir über ein Protokoll für den Ausdruck von Säugetieren Bestrophin Proteine mit BacMam Baculovirus gen-Transfer-System und ihre Reinigung durch Affinität und Größe-Ausschluss-Chromatographie. Der gereinigten Proteine haben das Potenzial, in nachfolgenden funktionellen und strukturellen Analysen wie elektrophysiologische Aufnahmen im Lipid Bilayer und Kristallographie genutzt werden. Wichtig ist, kann diese Pipeline zur Untersuchung der Funktionen und Strukturen von anderen Ionenkanälen angepasst werden.

Die Fluoreszenzintensität in vorübergehend transfiziert Klebstoff HEK293 Zellen (Abbildung 1A) ist ein guter Indikator für die geplante proteinexpressionsgrad in Suspension-f HEK293 Zellen (Abbildung 1 b). Wenn das Zielprotein nicht gut ausgedrückt ist oder MIS nach Transiente Transfektion in HEK293 Zellen lokalisiert ist, es ist empfehlenswert, das Konstrukt Ausdruck ändern (zB., die Veränderung der Position des G...

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Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Ausdruck und Reinigung von Säugetieren Bestrophin Ionenkanäle

Die Reinigung von Ionenkanälen ist oft eine Herausforderung, aber einmal erreicht, kann es möglicherweise erlauben, in-vitro- Untersuchungen der Funktionen und Strukturen der Kanäle. Hier beschreiben wir die schrittweisen Verfahren für den Ausdruck und die Reinigung von Säugetieren Bestrophin Proteine, eine Familie von Ca2 +-Cl– Kanäle aktiviert.

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

expression-and-purification-of-mammalian-bestrophin-ion-channels

Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.3K Aufrufe.  University of Rochester, School of Medicine and Dentistry. Die Reinigung von Ionenkanälen ist oft eine Herausforderung, aber einmal erreicht, kann es möglicherweise erlauben, in-vitro- Untersuchungen der Funktionen und Strukturen der Kanäle. Hier beschreiben wir die schrittweisen Verfahren für den Ausdruck und die Reinigung von Säugetieren Bestrophin Proteine, eine Familie von Ca2 +-Cl– Kanäle aktiviert.

Serie: Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug used to treat depression and anxiety by binding to the serotonin transporter with high-affinity, blocking serotonin reuptake. Here we report an efficient procedure and a set of tools to stabilize, express, purify, and crystallize serotonin transporter-antibody complexes bound to S-citalopram and other antidepressants. Mutations which stabilize the serotonin transporter were identified using an S-citalopram binding assay. Serotonin transporter expressed in baculovirus-transduced HEK293S GnTI- cells, was reconstituted into proteoliposomes and used to raise high-affinity antibodies. We have developed a strategy to discover antibodies that are useful for structural studies. A straightforward approach for the expression of antibody fragments in Sf9 cells has also been established. Transporter-antibody complexes purified using this procedure are well-behaved and readily crystallize, producing complexes with S-citalopram that diffract X-rays to 3-4 &#197; resolution. The strategies developed here can be utilized to determine the structure of other challenging membrane proteins.

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

This manuscript describes how to screen for thermostabilizing mutations, purify the human serotonin transporter, generate high affinity antibodies, and crystallize the serotonin transporter-antibody complex bound to the antidepressant drug S-citalopram. This protocol can be adapted to the study of other challenging membrane transporters, receptors, and channels.

Thermostabilization, Expression, Reinigung und Kristallisation des menschlichen Serotonin-Transporter-Bound<em&gt; S</em&gt; -Citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Forschung

Biochemie

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some S100 proteins have the capacity to bind transition metals with high affinity and effectively sequester them away from invading microbial pathogens in a process that is termed "nutritional immunity". S100A12 (EN-RAGE) binds both zinc and copper and is highly abundant in innate immune cells such as macrophages and neutrophils. We report a refined method for the expression, enrichment and purification of S100A12 in its active, metal-binding configuration. Utilization of this protein in bacterial growth and viability analyses reveals that S100A12 has antimicrobial activity against the bacterial pathogen, Helicobacter pylori. The antimicrobial activity is predicated on the zinc-binding activity of S100A12, which chelates nutrient zinc, thereby starving H. pylori which requires zinc for growth and proliferation.

Here, we present a method to express and purify S100A12 (calgranulin C). We describe a protocol to measure its antimicrobial activity against the human pathogen H. pylori.

Expression, Reinigung und antimikrobielle Aktivität von S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow

Fluid flow is an important environmental stimulus that controls many physiological and pathological processes, such as fluid flow-induced vasodilation. Although the molecular mechanisms for the biological responses to fluid flow/shear force are not fully understood, fluid flow-mediated regulation of ion channel gating may contribute critically. Therefore, fluid flow/shear force sensitivity of ion channels has been studied using the patch-clamp technique. However, depending on the experimental protocol, the outcomes and interpretation of data can be erroneous. Here, we present experimental and theoretical evidence for fluid flow-related errors and provide methods for estimating, preventing, and correcting these errors. Changes in junction potential between the Ag/AgCl reference electrode and bathing fluid were measured with an open pipette filled with 3 M KCl. Fluid flow could then shift the liquid/metal junction potential to approximately 7 mV. Conversely, by measuring the voltage shift induced by fluid flow, we estimated the ion concentration in the unstirred boundary layer. In the static condition, the real ion concentrations adjacent to the Ag/AgCl reference electrode or ion channel inlet at the cell-membrane surface can reach as low as approximately 30% of that in the flow condition. Placing an agarose 3 M KCl bridge between the bathing fluid and reference electrode may have prevented this problem of junction potential shifting. However, the unstirred layer effect adjacent to the cell membrane surface could not be fixed in this way. Here, we provide a method for measuring real ion concentrations in the unstirred boundary layer with an open patch-clamp pipette, emphasizing the importance of using an agarose salt-bridge while studying fluid flow-induced regulation of ion currents. Therefore, this novel approach, which takes into consideration the real concentrations of ions in the unstirred boundary layer, may provide useful insight on the experimental design and data interpretation related to fluid shear stress regulation of ion channels.

Mechanosensitive ion channels are often studied in terms of fluid flow/shear force sensitivity with patch-clamp recording. However, depending on the experimental protocol, the outcome on fluid flow-regulations of ion channels can be erroneous. Here, we provide methods for preventing and correcting such errors with a theoretical basis.

Messung der Konzentration der Ionen in der ungerührte Grenzschicht mit offenen Patch-Clamp-Pipette: Auswirkungen auf die Kontrolle der Ionenkanäle durch Flüssigkeit fließen

Fluid flow is an important environmental stimulus that controls many physiological and pathological processes, such as fluid flow-induced vasodilation. ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium homeostasis, particularly store-operated calcium entry, which is critical to maintaining proper function of synaptic vesicle release and intracellular signaling pathways. Accordingly, TRPC channels have been implicated in a variety of human diseases including cardiovascular disorders such as cardiac hypertrophy, neurodegenerative disorders such as Parkinson&#39;s disease, and neurologic disorders such as spinocerebellar ataxia. Therefore, TRPC channels represent a potential pharmacologic target in human diseases. However, the molecular mechanisms of gating in these channels are still unclear. The difficulty in obtaining large quantities of stable, homogeneous, and purified protein has been a limiting factor in structure determination studies, particularly for mammalian membrane proteins such as the TRPC ion channels. Here, we present a protocol for the large-scale expression of mammalian ion channel membrane proteins using a modified baculovirus gene transfer system and the purification of these proteins by affinity and size-exclusion chromatography. We further present a protocol to collect single-particle cryo-electron microscopy images from purified protein and to use these images to determine the protein structure. Structure determination is a powerful method for understanding the mechanisms of gating and function in ion channels.

This protocol describes techniques used to determine ion channel structures by cryo-electron microscopy, including a baculovirus system used to efficiently express genes in mammalian cells with minimum effort and toxicity, protein extraction, purification, and quality checking, sample grid preparation and screening, as well as data collection and processing.

Ausdruck und Reinigung des menschlichen Lipid-Sensitive kation Kanal TRPC3 für die Strukturaufklärung von Single-Teilchen Kryo-Elektronenmikroskopie

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also known as Band 3), the most abundant membrane protein in the red blood cells. The SLC4 family is homologous with borate transporters, which have been characterized in plants and fungi. It remains a significant technical challenge to express and purify membrane transport proteins to homogeneity in quantities suitable for&#160;structural or functional studies. Here we describe detailed procedures for the overexpression of borate transporters in Saccharomyces cerevisiae, isolation of yeast membranes, solubilization of protein by detergent, and purification of borate transporter homologs from S. cerevisiae, Arabidopsis thaliana, and Oryza sativa. We also detail a glutaraldehyde cross-linking experiment to assay multimerization of homomeric transporters. Our generalized procedures can be applied to all three proteins and have been optimized for efficacy. Many of the strategies developed here can be utilized for the study of other challenging membrane proteins.

Here we present a protocol to express, solubilize, and purify several eukaryotic borate transporters with homology to the SLC4 transporter family using yeast. We also describe a chemical cross-linking assay to assess the purified homomeric proteins for multimeric assembly. These protocols can be adapted for other challenging membrane proteins.

Ausdruck, Solubilisierung und Reinigung der eukaryotischen Borat-Transporter

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, fluorophores are prone to loss of signal via photobleaching by dissolved oxygen (O2). To prevent photobleaching and extend the fluorophore lifetime, oxygen scavenging systems (OSS) are employed to reduce O2. Commercially available OSS may be contaminated by nucleases that damage or degrade nucleic acids, confounding interpretation of experimental results. Here we detail a protocol for the expression and purification of highly active Pseudomonas putida protocatechuate-3,4-dioxygenase (PCD) with no detectable nuclease contamination. PCD can efficiently remove reactive O2 species by conversion of the substrate protocatechuic acid (PCA) to 3-carboxy-cis,cis-muconic acid. This method can be used in any aqueous system where O2 plays a detrimental role in data acquisition. This method is effective in producing highly active, nuclease free PCD in comparison with commercially available PCD.

Protocatechuate 3,4-dioxygenase (PCD) can enzymatically remove free diatomic oxygen from an aqueous system using its substrate protocatechuic acid (PCA). This protocol describes the expression, purification, and activity analysis of this oxygen scavenging enzyme.

Expression und Reinigung von Nuklease-freier Sauerstofffänger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this superfamily generally display multi-functionality, involving mainly hydrolase and decarboxylase mechanisms. This article presents a series of consecutive methods for the expression and purification of FAHD proteins, mainly FAHD protein 1 (FAHD1) orthologues among species (human, mouse, nematodes, plants, etc.). Covered methods are protein expression in E. coli, affinity chromatography, ion exchange chromatography, preparative and analytical gel filtration, crystallization, X-ray diffraction, and photometric assays. Concentrated protein of high levels of purity (&#62;98%) may be employed for crystallization or antibody production. Proteins of similar or lower quality may be employed in enzyme assays or used as antigens in detection systems (Western-Blot, ELISA). In the discussion of this work, the identified enzymatic mechanisms of FAHD1 are outlined to describe its hydrolase and decarboxylase bi-functionality in more detail.

Expression and purification of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins is described with examples (expression in E. coli, FPLC). Purified proteins are used for crystallization and antibody production and employed for enzyme assays. Selected photometric assays are presented to display the multi-functionality of FAHD1 as oxaloacetate decarboxylase and acylpyruvate hydrolase.

Expression, Reinigung, Kristallisation und Enzym-Assays von Fumarylacetoacetat-Hydrolase-Domänen-haltigen Proteinen

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Cholesterol enrichment of mammalian tissues and cells, including Xenopus oocytes used for studying cell function, can be accomplished using a variety of methods. Here, we describe two important approaches used for this purpose. First, we describe how to enrich tissues and cells with cholesterol using cyclodextrin saturated with cholesterol using cerebral arteries (tissues) and hippocampal neurons (cells) as examples. This approach can be used for any type of tissue, cells, or cell lines. An alternative approach for cholesterol enrichment involves the use of low-density lipoprotein (LDL). The advantage of this approach is that it uses part of the natural cholesterol homeostasis machinery of the cell. However, whereas the cyclodextrin approach can be applied to enrich any cell type of interest with cholesterol, the LDL approach is limited to cells that express LDL receptors (e.g., liver cells, bone marrow-derived cells such as blood leukocytes and tissue macrophages), and the level of enrichment depends on the concentration and the mobility of the LDL receptor. Furthermore, LDL particles include other lipids, so cholesterol delivery is nonspecific. Second, we describe how to enrich Xenopus oocytes with cholesterol using a phospholipid-based dispersion (i.e., liposomes) that includes cholesterol. Xenopus oocytes constitute a popular heterologous expression system used for studying cell and protein function. For both the cyclodextrin-based cholesterol enrichment approach of mammalian tissue (cerebral arteries) and for the phospholipid-based cholesterol enrichment approach of Xenopus oocytes, we demonstrate that cholesterol levels reach a maximum following 5 min of incubation. This level of cholesterol remains constant during extended periods of incubation (e.g., 60 min). Together, these data provide the basis for optimized temporal conditions for cholesterol enrichment of tissues, cells, and Xenopus oocytes for functional studies aimed at interrogating the impact of cholesterol enrichment.

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Two methods of cholesterol enrichment are presented: the application of cyclodextrin saturated with cholesterol to enrich mammalian tissues and cells, and the use of cholesterol-enriched phospholipid-based dispersions (liposomes) to enrich Xenopus oocytes. These methods are instrumental for determining the impact of elevated cholesterol levels in molecular, cellular, and organ function.

Anreicherung von Säugetiergeweben und Xenopus-Oozyten mit Cholesterin

Cholesterol enrichment of mammalian tissues and cells, including Xenopus oocytes used for studying cell function, can be accomplished using a variety of ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand its catalytic mechanism, allosteric behavior, and details of the enzymatic transformation of substrate to product in PLP-dependent enzymes. In this work, a novel expression system to produce the isolated &#945;- and isolated &#946;-subunit allowed the purification of high amounts of pure subunits and &#945;2&#946;2 StTS complex from the isolated subunits within 2 days. Purification was carried out by affinity chromatography followed by cleavage of the affinity tag, ammonium sulfate precipitation, and size exclusion chromatography (SEC). To better understand the role of key residues at the enzyme &#946;-site, site-direct mutagenesis was performed in prior structural studies. Another protocol was created to purify the wild type and mutant &#945;2&#946;2 StTS complexes. A simple, fast and efficient protocol using ammonium sulfate fractionation and SEC allowed purification of &#945;2&#946;2 StTS complex in a single day. Both purification protocols described in this work have considerable advantages when compared with previous protocols to purify the same complex using PEG 8000 and spermine to crystalize the &#945;2&#946;2 StTS complex along the purification protocol. Crystallization of wild type and some mutant forms occurs under slightly different conditions, impairing the purification of some mutants using PEG 8000 and spermine. To prepare crystals suitable for x-ray crystallographic studies several efforts were made to optimize crystallization, crystal quality and cryoprotection. The methods presented here should be generally applicable for purification of tryptophan synthase subunits and wild type and mutant &#945;2&#946;2 StTS complexes.

This article presents a series of consecutive methods for the expression and purification of Salmonella typhimurium tryptophan synthase comp this protocol a rapid system to purify the protein complex in a day. Covered methods are site-directed mutagenesis, protein expression in Escherichia coli, affinity chromatography, gel filtration chromatography, and crystallization.

PCR-Mutagenese, Klonierung, Expression, schnelle Proteinreinigungsprotokolle und Kristallisation des Wildtyps und der mutierten Formen der Tryptophan-Synthase

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...

Ganglioside Extraction, Purification and Profiling

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially abundant in the brain. Expressed primarily on the outer leaflet of the plasma membranes of cells, they modulate the activities of cell surface proteins via lateral association, act as receptors in cell-cell interactions and are targets for pathogens and toxins. Genetic dysregulation of ganglioside biosynthesis in humans results in severe congenital nervous system disorders. Because of their amphipathic nature, extraction, purification, and analysis of gangliosides require techniques that have been optimized by many investigators in the 80 years since their discovery. Here, we describe bench-level methods for the extraction, purification, and preliminary qualitative and quantitative analyses of major gangliosides from tissues and cells that can be completed in a few hours. We also describe methods for larger scale isolation and purification of major ganglioside species from brain. Together, these methods provide analytical and preparative scale access to this class of bioactive molecules.

Gangliosides are sialic acid-bearing glycosphingolipids that are particularly abundant in the brain. Their amphipathic nature requires organic/aqueous extraction and purification techniques to ensure optimal recovery and accurate analyses. This article provides overviews of analytic and preparative scale ganglioside extraction, purification, and thin layer chromatography analysis.

Gangliosidextraktion, -reinigung und -profilierung

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially ...