Diese Forschung wurde von der Abteilung für Veteranen Angelegenheiten Karriere Entwicklung Award 1IK2BX001701, CTSA Award UL1TR000445 aus dem National Center for Advancing Translational Sciences, die National Science Foundation Award Nummern 1547757 und 1400969 und NIH Grant GM05551 unterstützt. Ihr Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt offizielle Ansichten des Nationalen Zentrums für die Förderung der Translationswissenschaften oder der National Institutes of Health dar.

1. Ausdruck von S100A12 <ol><li> Transformieren Sie kompetente BL21 DE3-Zellen mit einem pGEMEX-S100a12-Plasmid unter Verwendung eines Standard-Hitzeschock-Protokolls 18 . Füge 1 bis 5 μl Plasmid zu 50 μl Bakterien in einem Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis hinzu. Inkubieren für 20 min. </li><li> Schütteln Sie die Zellen bei 42 ° C für 30 s. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen auf Eis für 2 min. </li><li> Füge 500 μl SOC-Medium zu den Zellen hinzu. Inkubieren bei 37 ° C unter Schütteln bei 250 U / min auf einem Orbitalschüttler für 1 h. </li><li> Plättchen 150 μl der Transformationsreaktion auf LB-Agar-Medium (ergänzt mit 100 μg / ml Ampicillin). Inkubieren für 12-16 h bei 37 ° C. </li><li> Wähle eine Kolonie. Inokulieren Sie 2 ml LB (ergänzt mit 100 μg / ml Ampicillin). </li><li> Inkubieren für 4-6 h bei 37 ° C auf einem Orbitalschüttler (300 U / min). Die OD 600 sollte zwischen 1-3 Absorptionseinheiten lesen. </li><li> Füge 500 μl Starterkultur zu 50 ml ZYM-5052 Autoindu hinzuCtion media 26, ergänzt mit 100 μg / ml Ampicillin. Für eine optimale Belüftung und maximale Expression verwenden Sie einen 250 mL verwirrten Erlenmeyerkolben. Schütteln Sie (300 U / min) für 24 h bei 37 ° C. </li><li> Bakteriensuspension in ein Zentrifugenröhrchen überführen. Pellet die Zellen durch Zentrifugation (4.000 xg, 10 min) bei 4 ° C. </li><li> Dekantieren Sie das Medium, protokollieren Sie Probe und speichern Sie Zellpaste bei -80 ° C. Die Probe ist seit Jahren stabil. </li></ol> 2. Reinigung von S100A12 unter Verwendung von Niederdruckchromatographie <ol><li> Resuspendieren von Zellen in 30 ml 20 mM Tris, pH 8,0. </li><li> Sonate die Suspension auf Eis, um Zellen zu lysieren. Verwenden Sie ~ 20 W Ausgang, 5 s und 5 s aus Zyklus für 5 min. </li><li> Übertragen Sie die Lösung auf Hochgeschwindigkeitszentrifugenröhrchen. Klären Sie das Zelllysat durch Zentrifugation, 20.000 xg für 30 min bei 4 ° C. </li><li> Den Überstand dekantieren und auf einen sauberen 100 ml Polypropylen-Becher überführen. Kühlen Sie die Lösung ab, indem Sie den Becher auf Eis legen. Rührei hinzufügenR und fügen langsam 11,20 g Ammoniumsulfat hinzu. Lassen Sie die Lösung auf Eis für weitere 1 h rühren. Dies wird eine 60% ige Lösung von Ammoniumsulfat schaffen und die meisten der E. coli endogenen Proteine ​​präzipitieren. S100A12 bleibt löslich. </li><li> Die Lösung bei 4 ° C, 20.000 xg für 20 min zentrifugieren, um das ausgefällte Protein zu pelletieren. </li><li> Den Überstand dekantieren und auf Dialyseschlauch übertragen (MWCO 3.500 kDa). Dialyse gegen 1 l 20 mM Tris, pH 8,0 bei 4 ° C. Ändern Sie den Dialysepuffer zweimal. Erlaube 4 Stunden zwischen den Änderungen. </li><li> Anionenaustauschchromatographie <ol><li> Führen Sie die Chromatographie auf einem Niederdrucksystem durch. Die typische Durchflussmenge beträgt 1 mL / min. </li><li> Äquilibrieren einer 5 ml Sepharose-Säule mit 10 ml 20 mM Tris, pH 8,0. </li><li> Laden Sie die ~ 40 ml S100A12-Lösung mit der Probenpumpe (sammeln Sie den Durchfluss). </li><li> Die Säule mit 10 ml 20 mM Tris, pH 8, waschen. </li><li> Entwickeln Sie die Säule mit einem 0-30% Gradienten (BuFfer B ist 20 mM Tris, pH 8,0, 1 M NaCl) über 19 Säulenvolumina (CV, 95 ml). Sammle 5 ml Fraktionen. </li><li> Nehmen Sie ein 10 μl Aliquot jeder Fraktion und analysieren Sie mit MES SDS PAGE mit Coomassie Färbung. Gel mit konstanter Spannung (20 V / cm) für 30 min laufen lassen. </li><li> Poolfraktionen mit S100A12. S100A12 läuft bei ~ 10 kDa Protein auf einem denaturierenden Gel. </li><li> Konzentrieren Sie die Fraktionen auf 5 ml unter Verwendung einer Ultrafiltrationsvorrichtung (MWCO 10 kDa). Zentrifuge bei 3.000 xg für ~ 8 min. Nehmen Sie den Spitzenbruch. </li></ol></li><li> Größenausschlusschromatographie <ol><li> Äquilibrieren Sie die S75-Säule mit 1 CV (120 ml) 20 mM Tris pH 8, 100 mM NaCl. </li><li> Injizieren Sie &lt;5 ml konzentrierte S100A12-Fraktionen (aus der Ionenaustauschchromatographie). </li><li> Die Säule mit einer Durchflussmenge von 1 mL / m über 120 mL entwickeln. Sammle 5 ml Fraktionen. </li><li> Nehmen Sie ein 10 μl Aliquot jeder Fraktion und analysieren Sie mit SDS PAGE mit Coomassie Färbung. Validieren Sie die Proteinidentität mitWestern-Blot oder Massenspektrometrie (berechnete Molekülmasse der monomeren Untereinheit 10.575.0 Da, gemessen 10575.4 Da). </li></ol></li><li> Poolfraktionen <ol><li> Messen Sie die Extinktion des Proteins A 280 mit einem Spektrophotometer. Verwenden Sie den SEC-Puffer als Leerzeichen. Der berechnete Extinktionskoeffizient für S100A12-Homodimer beträgt 5960 M -1 cm -1 . HINWEIS: Typische Ausbeuten sind 35-45 mg S100A12 pro 50 ml Kultur. </li><li> Aliquot S100A12 in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen (1 mg / Röhrchen) einfrieren, in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei -80 ° C aufbewahren. </li></ol></li></ol> 3. Antimikrobielle Aktivität Assays <ol><li> Streifen H. pylori- Stamm G27 auf tryptische Soja-Agarplatten, ergänzt mit 5% Schafblut (Blut-Agar-Platten). Wachsen 2-3 Tage bei 37 ° C in Raumluft, ergänzt mit 5% Kohlendioxid. </li><li> Hacken Sie H. pylori in Brucella Brühe, ergänzt mit 1x Cholesterin. Kultur überNachtschütteln (250 U / min) bei 37 ° C in Raumluft, ergänzt mit 5% Kohlendioxid. </li><li> Verdünnen Sie H. pylori 1:10 in 50% Brucella-Bouillon, 50% Calprotectin-Puffer plus 1x Cholesterin und Kultur im Medium allein oder ergänzt mit 100 μM Zinkchlorid plus 0, 100 oder 1000 μg / ml gereinigtem S100A12. Kultur über Nacht schütteln (250 U / min) bei 37 ° C in Raumluft, ergänzt mit 5% Kohlendioxid. </li><li> Am nächsten Tag führen Sie serielle Verdünnungen und Platten auf Blut-Agar-Platten. Bakterienkolonien für 2-3 Tage bei 37 ° C in Raumluft wachsen lassen, ergänzt mit 5% Kohlendioxid. Aufzählen der koloniebildenden Einheiten zur Berechnung des Bakterienwachstums in Gegenwart oder Abwesenheit von S100A12 und / oder exogenem Zink. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Es wird ein effizientes Protokoll für die Expression und Reinigung von humanem S100A12 vorgestellt. Das E. coli- Expressionssystem ist das häufigste Mittel, das für die Herstellung von rekombinanten Proteinen verwendet wird, insbesondere wenn mg-Mengen für biochemische und biophysikalische Studien erforderlich sind. Eine Schlüsselverbesserung des hier beschriebenen Verfahrens ist die Verwendung von Autoinduktionsmedien 26 , die die Ausbeute an gereinigtem Protein um einen Faktor von...

S100-Proteine ​​sind eine Klasse der EF-Hand-Familie von Calcium-bindenden Proteinen mit einer Vielzahl von Funktionen 1 . Sie werden in einer gewebe- und zellspezifischen Weise exprimiert und regeln ein breites Spektrum an zellulären Funktionen 2 , 3 . Einzigartige Calcium-bindende Proteine, S100-Proteine ​​zeigen sowohl intrazelluläre als auch extrazelluläre Funktionen 4 , 5 . Innerhalb der Zelle induziert die Ca 2+ -Bindung eine Konformationsänderung, die eine hydrophobe Oberfläche aussetzt, die spezifisch auf Proteinbindungspartner 6 abzielt. Dieser intrazelluläre Mechanismus reguliert wichtige Prozesse wie Zellproliferation, Differenzierung und Energiestoffwechsel. Im extrazellulären Milieu zeigen S100-Proteine ​​zwei Funktionen 7 . In einem, sie fungieren als Schmerz assoziierte molekulare Muster (DAMP) Proteine ​​und initiieren einen Pro-inflammAtory Immunantwort durch Interaktion mit Mustererkennungsrezeptoren 8 , 9 . Zusätzlich sind mehrere Mitglieder der S100-Protein-Klassen-Sequester-Übergangsmetalle, eine Funktion, die dazu dient, mikrobielle Pathogene in einem Prozess zu verhungern, der als Ernährungsstörung 10 , 11 bezeichnet wird . S100A12 (auch bekannt als Calgranulin C und EN-RAGE) wird in Makrophagen und Neutrophilen stark exprimiert und als potentieller Biomarker für entzündliche Erkrankungen identifiziert 12 , 13 . Zusätzlich zu dem Binden von Calcium an seinen EF-Hand-Stellen hat S100A12 zwei hochaffine Übergangsmetall-Bindungsstellen, die sich an gegenüberliegenden Enden der Dimer-Grenzfläche 14 , 15 befinden . Jede Bindungsstelle besteht aus drei Histidinresten und einem Asparaginsäurerest und kann Zink oder Kupfer chelatierenSup class = &quot;xref&quot;&gt; 16 , 17 . In letzter Zeit haben wir berichtet, dass S100A12-abhängiger Zink-Hunger bei der Regulierung des Helicobacter pylori -Wachstums und der Aktivität der entzündlichen Virulenzfaktoren wichtig ist. H. pylori infiziert den Magen von etwa der Hälfte der menschlichen Bevölkerung der Welt; Es ist wohl einer der erfolgreichsten bakteriellen Pathogene 19 . Infektion mit H. pylori kann zu signifikanten Magen-Krankheit Ergebnisse einschließlich Gastritis, Magen-und Zwölffingerdarm-Geschwür, Schleimhaut assoziierten lymphatischen Gewebe (MALT) Lymphom und invasiven Magen-Adenokarzinom (Magenkrebs) führen. Magenkrebs ist die führende Ursache für Nicht-Cardia-Krebs-assoziierten Tod in der Welt, und der einzige größte assoziierte Risikofaktor für Magenkrebs ist Infektion mit H. pylori . H. pylori bleibt in der Magen-Nische trotz einer robuEine Immunantwort auf den Erreger und unterstreicht die Notwendigkeit eines besseren Verständnisses von Immunmechanismen zur Bekämpfung dieser bakteriellen Infektion 20 , 21 , 22 , 23 . H. pylori- assoziierte Entzündungen zeichnen sich durch eine tiefe Infiltration von polymorphonuklearen Zellen oder Neutrophilen aus, die ein Repertoire antimikrobieller Proteine, einschließlich S100A12, an der Stelle der Infektion 18 , 24 , 25 ablagern. In dem Bemühen, den komplexen Dialog zwischen Host und Pathogen zu verstehen, suchten wir die Technik zu verfeinern, um S100A12 zu reinigen und es zu verwenden, um die antimikrobielle Wirkung zu untersuchen, die sie auf diesen medizinisch relevanten Erreger ausübt. Das Protokoll unten beschreibt eine verbesserte Technik für die S100A12-Reinigung in ihrem biologisch aktiven Zustand; Fähig, Nährstoffmetalle mit hohem Affini zu bindenTy und chelatisieren sie weg von eindringenden Mikroorganismen. Darüber hinaus unterstreichen die nachstehenden Methoden die Nützlichkeit dieses Proteins als kritisches Reagenz, um den Mechanismus zu untersuchen, durch den angeborene antimikrobielle Moleküle das Wachstum von bakteriellen Pathogenen einschränken. S100A-Familie Proteine ​​haben Anerkennung als eine wichtige Gruppe von angeborenen Immunsystem Moleküle gewonnen, die an der Immunsignalisierung sowie Host Verteidigung teilnehmen 27 . Das am meisten untersuchte ist Calprotectin (MRP-8/14, Calgranulin A / B, S100A8 / A9) 28 , 29 , 30 . Calprotectin ist ein Neutrophil-assoziiertes Protein, das ein Heterodimer der S100A8- und S100A9-Untereinheiten bildet, die Übergangsmetalle an der Dimer-Grenzfläche 31 bindet. Es wurde gezeigt, dass Calprotektin zwei Metallbindungsstellen besitzt: Standort 1 kann Zn 2+ , Mn 2+ oder Fe 2+ binden und Standort 2 können<html> Binden Zn 2+ 31 , 32 . Zahlreiche Berichte haben gezeigt, dass Calprotektin antimikrobielle Aktivitäten gegen verschiedene Pathogene wie Staphylococcus aureus , Candida albicans , Acinetobacter baumannii , Klebsiella pneumoniae , Escherichia coli und H. pylori aufweist und dass die hemmenden Wirkungen auf die Metallchelataktivität von Calprotectin 25 , 28 zurückzuführen sind , 29 . Bisherige Arbeiten zeigten, dass Calprotektin zahlreiche Aktivitäten auf H. pylori ausübt, einschließlich der Veränderung der Lipid-A-Struktur in der äußeren Membran und unterdrückt das Cag-Typ IV-Sekretionssystem (das ein wichtiger proinflammatorischer Virulenzfaktor innerhalb von H. pylori ist ), wodurch die Biofilmbildung und die Unterdrückung induziert wird H. pylori Wachstum und Lebensfähigkeit in einer dosisabhängigen WeiseClass = &quot;xref&quot;&gt; 25 , 33 . Darüber hinaus zeigten genetische und biochemische Assays die antibakterielle Aktivität von Calprotectin gegen H. pylori wurde weitgehend aus seiner Fähigkeit, Nährstoff Zink 25 zu binden abgeleitet. H. pylori erfordert Zink, wie es bei früheren Untersuchungen bestimmt wurde, die ein chemisch definiertes Medium nutzten, um die Mikronährstoffanforderungen für dieses Pathogen zu ermitteln, um zu wachsen und zu vermehren 34 . Zusätzlich war Calprotectin in H. pylori- infizierten Geweben sehr reichlich vorhanden und mit neutrophilen Infiltraten assoziiert, was anzeigt, dass der Wirt Calprotektin als antimikrobielle Strategie während der Infektion und nachfolgende Entzündung 25 , 35 einsetzen kann . Der jüngste Beweis von den unvoreingenommenen Proteomik-Screening-Techniken deutet darauf hin, dass unter Bedingungen, bei denen reaktive Sauerstoffspezies reichlich vorhanden sind, calprotecZinn unterliegt posttranslationalen Modifikationen, die die Hexa-Histidin-Bindungsstelle verändern und dadurch die Metallbindungsaktivität des Proteins 36 hemmen. Als solches haben wir vermutet, dass andere S100A-Familienproteine ​​unter dem breiten Repertoire dieser Moleküle potentiell als Hilfsmetall-Chelatoren wirken könnten. Wir haben S100A12 für eine weitere Studie ausgewählt, weil es in dem oben erwähnten Screen für die posttranslationale Modifikation nicht identifiziert wurde, es hat die Fähigkeit, Zink zu binden, und es ist sehr reich an menschlichen Geweben, die von H. pylori- infizierten Individuen stammen. Unsere Arbeit zeigt, dass S100A12 H. pylori Wachstum und Lebensfähigkeit in einer dosisabhängigen Weise im G27-Stamm von H. pylori hemmen kann und dass die antimikrobielle Aktivität dieses Proteins durch die Zugabe von überschüssigem Nährstoff-Zink umgekehrt werden kann. Diese Arbeit ergänzt unsere bisherige Arbeit, die darauf hinweist, dass S100A12 antimikrobielle Aktivität gegen PMSS1 und 7.1 ausübt3-Stämme von H. pylori , die ihre breite antibakterielle Wirkung gegen zahlreiche klinische Isolate und Labor-adaptierte Stämme von H. pylori 18 zeigen . Gemeinsam bestätigen diese Ergebnisse die Bedeutung von S100A12 als Mechanismus zur Kontrolle des Bakterienwachstums und der Proliferation durch Ernährungsunempfindlichkeit. Zukünftige Untersuchungen dieser wichtigen Wirtsbakterien-Interaktion könnten die Ausnutzung der Aktivität von S100A12 zur Verringerung der Bakterienbelastung innerhalb von Wirtsgeweben oder die Bestimmung des Beitrags dieses Proteins zur Immunsignalisierung im Kontext der H. pylori- Infektion umfassen.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;S100A12 Expression&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Expression cells&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BL 21 (DE3) competent cells</td><td>New England Biolabs</td><td>C25271</td><td></td></tr><tr><td>Autoinduction medium components</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yeast Extract</td><td>Research Products International</td><td>Y20020-250.0</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Research Products International</td><td>S23020-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Research Products International</td><td>T60060-250.0</td><td></td></tr><tr><td>FeCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2877</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Research Products International</td><td>M65240-100.0</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Research Products International</td><td>S23100-500.0</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Research Products International</td><td>P41200-500.0</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Research Products International</td><td>A20424-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Research Products International</td><td>S25150-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Research Products International</td><td>G22020-1.0</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Research Products International</td><td>G32040-500.0</td><td></td></tr><tr><td>lactose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2643</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Selection agent&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ampicillin</td><td>Research Products International</td><td>A40040-5.0</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;S100A12 Purification&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AKTA Start Chromatography System</td><td>GE</td><td>29-220-94</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap Q Sepharaose Fast Flow</td><td>GE</td><td>17-5156-01</td><td></td></tr><tr><td>HiPrep 16/60 S-200 HR</td><td>GE</td><td>17-1166-01</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop lite spectrophotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-LITE</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Research Products International</td><td>T60040-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;H. pylori &lt;/em&gt;Culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blood agar plates</td><td>Lab Supply Company</td><td>BBL221261</td><td></td></tr><tr><td>Brucella broth</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3051</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol (250x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12531018</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793566</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Zinc Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>229997</td><td></td></tr></tbody></table>

expression, purification, and antimicrobial activity of s100a12

Calgranulin-Proteine ​​sind wichtige Mediatoren der angeborenen Immunität und sind Mitglieder der S100-Klasse der EF-Hand-Familie von Calcium-bindenden Proteinen. Einige S100-Proteine ​​haben die Fähigkeit, Übergangsmetalle mit hoher Affinität zu binden und sie effektiv von eindringenden mikrobiellen Pathogenen in einem Prozess abzuscheiden, der als &quot;ernährungsbedingte Immunität&quot; bezeichnet wird. S100A12 (EN-RAGE) bindet sowohl Zink als auch Kupfer und ist in angeborenen Immunzellen wie Makrophagen und Neutrophilen sehr reichlich vorhanden. Wir berichten über eine verfeinerte Methode für die Expression, Anreicherung und Reinigung von S100A12 in ihrer aktiven, metallbindenden Konfiguration. Die Verwendung dieses Proteins in Bakterienwachstums- und Lebensfähigkeitsanalysen zeigt, dass S100A12 eine antimikrobielle Wirkung gegen den bakteriellen Pathogen, Helicobacter pylori, aufweist . Die antimikrobielle Aktivität beruht auf der Zinkbindungsaktivität von S100A12, die Nährstoffzink chelatisiert und dadurch H. pylori verhungert, was Zink für Wachstum und p erfordertRolltation

S100A12 Expression und Reinigung Eine dreistufige Reinigung ergab 40 mg rekombinantes S100A12 aus 50 ml Bakterienkultur. Der erste Schritt war eine Ammoniumsulfat-Präzipitation von endogenen E. coli- Proteinen. Dieser Stufe folgte eine Anionenaustauschchromatographie (Abbildung 1A ). Das Protein wird von einer SDS-PAGE verfolgt, die mit Coomassie Brilliant Blue gefärbt ist (Abbildung 1B</strong...

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Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Hier stellen wir eine Methode zur Expression und Reinigung von S100A12 (Calgranulin C) vor. Wir beschreiben ein Protokoll zur Messung seiner antimikrobiellen Aktivität gegen den menschlichen Pathogen H. pylori .

Expression, Reinigung und antimikrobielle Aktivität von S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

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Serie: Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Bacterial Expression and Purification of Human Matrix Metalloproteinase-3 using Affinity Chromatography

Matrix metalloproteinases (MMPs) belong to the family of metzincin proteases with central roles in extracellular matrix (ECM) degradation and remodeling, as well as interactions with several growth factors and cytokines. Overexpression of specific MMPs is responsible in several diseases such as cancer, neurodegenerative diseases, and cardiovascular disease. MMPs have been the center of attention recently as targets to develop therapeutics that can treat diseases correlated to MMP overexpression.
To study the MMP mechanism in solution, more facile and robust recombinant protein expression and purification methods are needed for the production of active, soluble MMPs. However, the catalytic domain of most MMPs cannot be expressed in Escherichia coli (E. coli) in soluble form due to lack of posttranslational machinery, whereas mammalian expression systems are usually costly and have lower yields. MMP inclusion bodies must undergo the tedious and laborious process of extensive purification and refolding, significantly reducing the yield of MMPs in native conformation. This paper presents a protocol using Rosetta2(DE3)pLysS (hereafter referred to as R2DP) cells to produce matrix metalloproteinase-3 catalytic domain (MMP-3cd), which contains an N-terminal His-tag followed by pro-domain (Hisx6-pro-MMP-3cd) for use in affinity purification. R2DP cells enhance the expression of eukaryotic proteins through a chloramphenicol-resistant plasmid containing codons normally rare in bacterial expression systems. Compared to the traditional cell line of choice for recombinant protein expression, BL21(DE3), purification using this new strain improved the yield of purified Hisx6-pro-MMP-3cd. Upon activation and desalting, the pro domain is cleaved along with the N-terminal His-tag, providing active MMP-3cd for immediate use in countless in vitro applications. This method does not require expensive equipment or complex fusion proteins and describes rapid production of recombinant human MMPs in bacteria.

His-tag purification, dialysis, and activation are employed to increase yields of soluble, active matrix metalloproteinase-3 catalytic domain protein expression in bacteria. Protein fractions are analyzed via SDS-PAGE gels.

Bakterielle Expression und Aufreinigung der humanen Matrix-Metalloproteinase-3 mittels Affinitätschromatographie

Matrix metalloproteinases (MMPs) belong to the family of metzincin proteases with central roles in extracellular matrix (ECM) degradation and remodeling, ...

Forschung

Biochemie

A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors

Lysophospholipids (LPLs) are bioactive lipids that include sphingosine 1-phosphate (S1P), lysophosphatidic acid, etc. S1P, a metabolic product of sphingolipids in the cell membrane, is one of the best-characterized LPLs that regulates a variety of cellular physiological responses via signaling pathways mediated by sphingosine 1-phosphate receptors (S1PRs). This implicated that the S1P-S1PRs signaling system is a remarkable potential therapeutic target for disorders, including multiple sclerosis (MS), autoimmune disorders, cancer, inflammation, and even COVID-19. S1PRs, a small subset of the class A G-protein coupled receptor (GPCR) family, are composed of five subtypes: S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4, and S1PR5. The lack of detailed structural information, however, impedes the drug discovery targeting S1PRs. Here, we applied the cryo-electron microscopy method to solve the structure of the S1P-S1PRs complex, and elucidated the mechanism of activation, selective drug recognition, and G-protein coupling by using cell-based functional assays. Other lysophospholipid receptors (LPLRs) and GPCRs can also be studied using this strategy.

S1P exerts its diverse physiological effects through the S1P receptors (S1PRs) subfamily. Here, a pipeline is described to expound on the structures and function of S1PRs.

Eine Pipeline zur Untersuchung der Strukturen und Signalwege von Sphingosin-1-phosphat-Rezeptoren

Lysophospholipids (LPLs) are bioactive lipids that include sphingosine 1-phosphate (S1P), lysophosphatidic acid, etc. S1P, a metabolic product of ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate immune system responses during the course of infection. Though methods have been developed to successfully purify and produce many of these important virulence factors, there are still many bacterial toxins whose unique structure or extensive post-translational modifications make them difficult to purify and study in in vitro systems. Furthermore, even when pure toxin can be obtained, there are many challenges associated with studying the specific effects of a toxin under relevant physiological conditions. Most in vitro cell culture models designed to assess the effects of secreted bacterial toxins on host cells involve incubating host cells with a one-time dose of toxin. Such methods poorly approximate what host cells actually experience during an infection, where toxin is continually produced by bacterial cells and allowed to accumulate gradually during the course of infection. This protocol describes the design of a permeable membrane insert-based bacterial infection system to study the effects of Streptolysin S, a potent toxin produced by Group A Streptococcus, on human epithelial keratinocytes. This system more closely mimics the natural physiological environment during an infection than methods where pure toxin or bacterial supernatants are directly applied to host cells. Importantly, this method also eliminates the bias of host responses that are due to direct contact between the bacteria and host cells. This system has been utilized to effectively assess the effects of Streptolysin S (SLS) on host membrane integrity, cellular viability, and cellular signaling responses. This technique can be readily applied to the study of other secreted virulence factors on a variety of mammalian host cell types to investigate the specific role of a secreted bacterial factor during the course of infection.

Here, a method using a permeable membrane insert-based infection system to study the effects of Streptolysin S, a secreted toxin produced by Group A Streptococcus, on keratinocytes is described. This system can be readily applied to the study of other secreted bacterial proteins on various host cell types during infection.

Implementierung eines Systems durchlässige Membran Insert-basierten Infektion der Auswirkungen von sekretierten bakteriellen Toxins zur Untersuchung auf Säugetierwirtszellen

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

Immunologie und Infektion

Aufreinigung eines fibrinolytischen Enzyms aus Sipunculus nudus mittels Affinitätschromatographie

Affinity Purification of a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus

The fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus (sFE) is a novel fibrinolytic agent that can both activate plasminogen into plasmin and degrade fibrin directly, showing great advantages over traditional thrombolytic agents. However, due to the lack of structural information, all the purification programs for sFE are based on multistep chromatography purifications, which are too complicated and costly. Here, an affinity purification protocol of sFE is developed for the first time based on a crystal structure of sFE; it includes preparation of the crude sample and the lysine/arginine-agarose matrix affinity chromatography column, affinity purification, and characterization of the purified sFE. Following this protocol, a batch of sFE can be purified within 1 day. Moreover, the purity and activity of the purified sFE increases to 92% and&#160;19,200 U/mL,&#160;respectively. Thus, this is a simple, inexpensive, and efficient approach for sFE purification. The development of this protocol is of great significance for the further utilization of sFE and other similar agents.

Autor im Rampenlicht: Affinitätsreinigung eines fibrinolytischen Enzyms aus Sipunculus nudus  

Here, we present an affinity purification method of a fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus that is simple, inexpensive, and efficient.

Affinitätsreinigung eines fibrinolytischen Enzyms aus Sipunculus nudus

The fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus (sFE) is a novel fibrinolytic agent that can both activate plasminogen into plasmin and degrade fibrin ...

Antimicrobial Peptides Produced by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids

Nature has a variety of possibilities to create new protein functions by modifying the sequence of the individual amino acid building blocks. However, all variations are based on the 20 canonical amino acids (cAAs). As a way to introduce additional physicochemical properties into polypeptides, the incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) is increasingly used in protein engineering. Due to their relatively short length, the modification of ribosomally synthesized and post-translationally modified peptides by ncAAs is particularly attractive. New functionalities and chemical handles can be generated by specific modifications of individual residues. The selective pressure incorporation (SPI) method utilizes auxotrophic host strains that are deprived of an essential amino acid in chemically defined growth media. Several structurally and chemically similar amino acid analogs can then be activated by the corresponding aminoacyl-tRNA synthetase and provide residue-specific cAA(s) &#8594; ncAA(s) substitutions in the target peptide or protein sequence. Although, in the context of the SPI method, ncAAs are also incorporated into the host proteome during the phase of recombinant gene expression, the majority of the cell&#39;s resources are assigned to the expression of the target gene. This enables efficient residue-specific incorporation of ncAAs often accompanied with high amounts of modified target. The presented work describes the in vivo incorporation of six proline analogs into the antimicrobial peptide nisin, a lantibiotic naturally produced by Lactococcus lactis. Antimicrobial properties of nisin can be changed and further expanded during its fermentation and expression in auxotrophic Escherichia coli strains in defined growth media. Thereby, the effects of residue-specific replacement of cAAs with ncAAs can deliver changes in antimicrobial activity and specificity. Antimicrobial activity assays and fluorescence microscopy are used to test the new nisin variants for growth inhibition of a Gram-positive Lactococcus lactis indicator strain. Mass spectroscopy is used to confirm ncAA incorporation in bioactive nisin variants.

The protocol presents the Escherichia coli-based selective pressure incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) into the lactococcal antimicrobial peptide nisin. Its properties can be changed during recombinant expression via substitution with desired ncAAs in defined growth media. Resulting changes in bioactivity are mapped by growth inhibition assays and fluorescence microscopy.

Antimikrobielle Peptide produziert durch Selektionsdruck Einbeziehung der nicht-kanonischen Aminosäuren

Nature has a variety of possibilities to create new protein functions by modifying the sequence of the individual amino acid building blocks. However, all ...

Biotechnik

Purification of Human S100A12 and Its Ion-induced Oligomers for Immune Cell Stimulation

In this protocol, we describe a method to purify human calcium-binding protein S100A12 and its ion-induced oligomers from Escherichia coli culture for immune cell stimulations. This protocol is based on a two-step chromatography strategy, which comprises protein pre-purification on an anion-exchange chromatography column and a subsequent polishing step on a hydrophobic-interaction column. This strategy produces S100A12 protein of high purity and yield at manageable costs. For functional assays on immune cells eventual remnant endotoxin contamination requires careful monitoring and further cleaning steps to obtain endotoxin-free protein. The majority of endotoxin contaminations can be excluded by anion-exchange chromatography. To deplete residual contaminations, this protocol describes a removal step with centrifugal filters. Depending on the available ion-strength S100A12 can arrange into different homomultimers. To investigate the relationship between structure and function, this protocol further describes ion-treatment of S100A12 protein followed by chemical crosslinking to stabilize S100A12 oligomers and their subsequent separation by size-exclusion chromatography. Finally, we describe a cell-based assay that confirms the biological activity of the purified protein and confirms LPS-free preparation.

This protocol describes a purification method for recombinant tag-free calcium binding protein S100A12 and its ion-induced oligomers for human monocyte stimulation assays.

Reinigung des menschlichen S100A12 und seiner Ionen-induzierten Oligomere zur Immunzellstimulation

In this protocol, we describe a method to purify human calcium-binding protein S100A12 and its ion-induced oligomers from Escherichia coli culture for ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

Bäckerhefe Protein Extraktion und Reinigung für das Studium der Funktion, Wechselwirkungen, und post-translationale Modifikationen

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Biologie

Production and Visualization of Bacterial Spheroplasts and Protoplasts to Characterize Antimicrobial Peptide Localization

The use of confocal microscopy as a method to assess peptide localization patterns within bacteria is commonly inhibited by the resolution limits of conventional light microscopes. As the resolution for a given microscope cannot be easily enhanced, we present protocols to transform the small rod-shaped gram-negative Escherichia coli (E. coli) and gram-positive Bacillus megaterium (B. megaterium) into larger, easily imaged spherical forms called spheroplasts or protoplasts. This transformation allows observers to rapidly and clearly determine whether peptides lodge themselves into the bacterial membrane (i.e., membrane localizing) or cross the membrane to enter the cell (i.e., translocating). With this approach, we also present a systematic method to characterize peptides as membrane localizing or translocating. While this method can be used for a variety of membrane-active peptides and bacterial strains, we demonstrate the utility of this protocol by observing the interaction of Buforin II P11A (BF2 P11A), an antimicrobial peptide (AMP), with E. coli spheroplasts and B. megaterium protoplasts.

Here we present a protocol to produce gram-negative Escherichia coli (E. coli) spheroplasts and gram-positive Bacillus megaterium (B. megaterium) protoplasts to clearly visualize and rapidly characterize peptide-bacteria interactions. This provides a systematic method to define membrane localizing and translocating peptides.

Produktion und Visualisierung von bakteriellen Spheroplasts und Protoplasten antimikrobielle Peptide Lokalisierung zu charakterisieren

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Expression, Reinigung und antimikrobielle Aktivität von S100A12

Zusammenfassung

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Affinitätsreinigung eines fibrinolytischen Enzyms aus Sipunculus nudus

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Antimikrobielle Peptide produziert durch Selektionsdruck Einbeziehung der nicht-kanonischen Aminosäuren

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