Die Beschaffung ausreichender Mengen an Membranproteinen für nachgelagerte Anwendungen bleibt eine erhebliche technische Herausforderung. Dieses Protokoll ermöglicht die Reinigung mehrerer Membrantransportproteine zur Homogenität. Ein wesentlicher Vorteil dieser Technik ist, dass Saccharomyces cerevisiae ein zeit- und kostengünstiges eukaryotisches Expressionssystem für Membranproteine ist, das die Optimierung vieler wichtiger experimenteller Variablen ermöglicht.
Beginnen Sie mit der Impfung von drei transformierten Hefekolonien, in 50 Milliliter neines ergänzenden selektiven Mediums ohne Histidin. Ergänzt mit Hefestickstoffbasis und 2% Glukose für eine nächtliche Inkubation bei 190 Umdrehungen pro Minute und 30 Grad Celsius. Entfernen Sie die Kultur am nächsten Tag.
Verwenden Sie ein Spektralphotometer, um die optische Dichte bei 600 Nanometern oder OD 600 zu bestimmen. Und impfen Sie jeden von vier Zwei-Liter-Kolben mit 500 Milliliter Kulturmedium zu einem OD 600 von 0,01. Dann schütteln Sie die Kulturen bei 190 Umdrehungen pro Minute bei 30 Grad Celsius für 30 Stunden, damit die Zellen die gesamte Glukose verbrauchen und zu einer hohen Dichte wachsen können.
Um Borat-Transporter-Expression zu induzieren, fügen Sie 125 Milliliter von fünf x Hefe Pepton Medium, ergänzt mit 10%Galaktose bei 190 Rotationen pro Minute bei 30 Grad Celsius für 16 Stunden. Dann ernten Sie die Hefezellen durch Zentrifugation und setzen Sie das Pellet in 100 Milliliter kaltem Wasser wieder auf. Wirbel im Wirbel, um das Hefepellet wieder aufzuhängen und die Lösung seriell mit allen Flaschen zu übertragen, die Pellets enthalten.
Um die Hefemembranen zu ernten, fügen Sie zunächst 11,25 Milliliter eines Molaren-Tris, 0,45 Milliliter 0,5-Mol-EDTA und 2,25 Milliliter 100 Millimolar PMSF zu den resuspendierten Zellen hinzu. Fügen Sie Wasser zu einem Endvolumen von 225 Millilitern hinzu und übertragen Sie die Zellen in einen 450 Milliliter Metallperlenschlagkanister. Das restliche Volumen mit kalten 0,5 Millimeter Glasperlen aufzuladen und die Perlenkammer mit einem Rotor zu montieren.
Tauchen Sie die Kammer in ein Eisbad ein und führen Sie sechs einminütige Impulse durch, getrennt durch zwei Minuten Ruhezeiten, um eine Überhitzung des Lysats zu verhindern. Entfernen Sie nach dem letzten Puls die Filtrationsmembran aus einem in eine Glasflasche eingeschraubten Kunststoff-Einwegflaschen-Topfilter und gießen Sie den Inhalt der Perlenkammer während des Vakuums auf die Baugruppe. Dann spülen Sie mit den beiden x Perle Waschpuffer durch Hinzufügen der Kammer wirbeln und dann zu den Perlen hinzufügen.
Spülen Sie die Perlenkammer mit 225 Milliliter Waschpuffer und waschen Sie die Perlen mit dem Inhalt der Kammer. Sammeln Sie das Lysat durch Zentrifugation und dekantieren Sie den Überstand in Polycarbonatflaschen zur Ultrazentrifugation zur Sammlung der Membranen. Am Ende der Ultrazentrifugation entsorgen Sie den Überstand und wiegen Sie die Flaschen mit den Membranpellets, bevor sie die Membranen in ca. 35 Milliliter Membranresuspensionspuffer wieder aufhängen.
Fügen Sie die Suspensionen zu einem Glas-Douncer, dann Dounce homogenisieren die Membranen und aliquot das Homogenat in einem 50 Milliliter konischen Rohr für negative 80 Grad Celsius Lagerung. Wiegen Sie die leeren Zentrifugenflaschen, um die Masse der geernteten Membranen zu bestimmen. Zur Proteinlöslichkeit und -reinigung einen Rührstab und 150 Milligramm DDM pro Gramm Membran zu einem Becher auf eis und die aufgetauten Membranen auf ein Endvolumen von 15 Milliliter Membranresuspensionspuffer aufsetzen, ergänzt durch ein Millimolar PMSF und 20 Millimolar-Imidazole pro Gramm Membran.
Fügen Sie die Membranlösung in das Becherglas für eine Stunde rühren in einem Eisbad. Gefolgt von zentrifugieren, um das nicht-lösliche Material zu pellet. Filtern Sie den Überstand in einem 4 Grad Celsius kalten Raum durch einen Fünf-Mikrometer-Spritzenfilter und verwenden Sie eine peristaltische Pumpe, die auf eine Durchflussrate von einem Milliliter pro Minute eingestellt ist, um die Probe auf eine ein Milliliter immobilisierte Nickel-Affinitätssäule zu laden. Dann waschen Sie die Säule mit 10 Säulenvolumen Waschpuffer und verdünnen Sie das Protein im Elutionspuffer.
Sammeln des Eluats in zehn Milliliter-Fraktionen. Führen Sie die gesammelten vorbereiteten Gelfraktionen auf einem vier bis 20%Tris-Glycin-SDS-Seitengel zusammen mit solubilisiertem Lysat und Waschfraktionen bei Raumtemperatur aus und ziehen Sie die spitzen gesammelten Ausweichfraktionen für die Konzentration auf 500 Mikroliter oder weniger Volumen in einem 50 Kilo schweren Dalton-Cutoff-Konzentrator in einer Tischzentrifuge bei vier Grad Celsius. Filtern Sie das konzentrierte Protein durch einen 0,2 Mikrometer-Spin-Säulenfilter und injizieren Sie das Filtrat in eine Größenausschlusssäule, die in einem S-200-Puffer ausgeglichen wird.
Nachdem Sie die Spitzenfraktionen auf einem zweiten vier bis 20%Tris-Glycin-SDS-Seitengel ausgeführt haben, färben Sie das Gel und sammeln Sie die reinen Spitzenfraktionen für die Konzentration in einem 50 Kilo schweren Dalton Cutoff-Konzentrator bei vier Grad Celsius, wie gerade gezeigt. Messen Sie dann die Absorption der Proteinprobe bei einer Wellenlänge von 280 Nanometern, um die Konzentration zu bestimmen, bevor die Probe auf unbestimmte Zeit bei negativen 80 Grad Celsius gelagert wird. Um einen Glutaraldehyd-Kreuzverknüpfungstest durchzuführen, fügen Sie zunächst 0,5 Milligramm pro Milliliter aufgetautes Protein in drei Mikroliter S-200-Puffer zu fünf MikroliterS S200-Puffer hinzu.
Vervollständigen Sie die negative Kontrollreaktion mit der Zugabe von einem Mikroliter 20% Natriumdodecylsulfat und einem Mikroliter 1,5% Glutaraldehyd. Vervollständigen Sie die Versuchsproben mit einem Mikroliter Wasser und einem Mikroliter 1,5% Glutaraldehyd. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur beenden Sie die Reaktion mit fünf Mikrolitern 3x SDS-Seiten-Gel-Ladedüse, die einen Überschuss an Tris-Puffer enthält, um das Glutaraldehyd zu löschen und alle 15 Mikroliter der Lösung auf ein vier bis 20%Tris-Glycin-SDS-Seitengel zu laden.
Führen Sie dann das Gel mit 200 Volt für 30 Minuten vor der Färbung, um das Ausmaß der Dimer-Vernetzung zu bestimmen, wie durch ein Band belegt, das doppelt so groß wie das denaturierte Monomer läuft. Färben Sie das Gel, indem Sie auf einem langsamen Orbital-Shaker mit Gelfleck, der dem Gel hinzugefügt wird, schütteln. Hier zeigen typische Gele für die ausgeponten Fraktionen aus der Nickelaffinitätschromatographie drei teilweise gereinigte Proteine mit den Lysatfraktionen, die kein signifikantes Band aufweisen, das dem Borattransporter entspricht, wie erwartet für Proteine, die nicht überauskommen.
Die ad millimolar Waschbahn in jedem Gel zeigt trotz ihrer relativ hohen Emitter-Altenkonzentration einen minimalen Verlust der zehn Histidin-getaggten Proteine. Während die Bänder, die den Borat-Transportern entsprechen, in den ausgedrungenen Fraktionen leicht sichtbar sind. Vor der S200-Säuleninjektion werden die Proteine für viele nachgeschaltete Anwendungen nicht ausreichend gereinigt, wie die zusätzlichen Bänder in jeder Probe anzeigen.
Nach ihrer Injektion in Größenausschlusssäulen können jedoch ausentgangene Fraktionen einer hohen Reinheit beobachtet werden. Vernetzung zeigt, dass die gereinigten homomeren Transporter ihre Montage in Lösung leicht beurteilen lassen könnten, wobei das Ausmaß der Vernetzung von der Anzahl der Lysinrückstände in der Nähe voneinander abhängig ist. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass das Protein, sobald die Zellernte beginnt, jederzeit kalt gehalten werden muss. Entweder auf Eis in einem Vier-Grad-Raum oder im Feinkost-Gehäuse.
Nach diesem Verfahren können die Membranproteine durch biophysikalische, biochemische oder strukturelle Methoden wie Röntgenkristallographie oder Kryoelektronenmikroskopie weiter charakterisiert werden. Durch die Ermöglichung der Reinigung von Milligramm Mengen homogenen Proteins wurden diese Techniken verwendet, um die Kristallstruktur des Arabidopsis thaliana one Transporter zu bestimmen.
