In Ovo und Ex Ovo Methoden zur Untersuchung der Entwicklung des Vogelinnenohrs

Alter, Infektion und ototoxische Medikamente können eine Degeneration der Haarzellen des Innenohrs verursachen, was bei uns zu Hörverlust führt. Bei Nicht-Säugetier-Wirbeltieren, wie dem Küken, können Haarzellen regeneriert werden. Die hier beschriebenen Techniken nutzen die Kosteneffizienz der Arbeit an Hühnerembryonen, die Leichtigkeit der Embryonengewinnung und die gute Exo-Entwicklung von Gewebeexplantaten.

Das Verständnis der Entwicklung und Regeneration der Innenohrhaare von Vögeln kann wichtige Einblicke in Hörverlust und mögliche Therapien liefern, und Explantatkultur kann wichtig sein, um die ototoxischen Wirkungen verschiedener Medikamente zu bewerten. Bevor Sie mit dem Experiment beginnen, beschaffen Sie frisch gelegte Eier und reinigen Sie sie mit 70% Ethanol, um eine Kontamination zu vermeiden. Inkubieren Sie die Eier für 3,5 bis 4 Tage, bei 37 bis 38 Grad Celsius mit 45% Luftfeuchtigkeit.

Positionieren Sie den Embryo nach der Inkubation erneut auf die Oberseite des Eigelbs, indem Sie ein Ei für fünf Minuten auf die Seite legen. Verwenden Sie dann eine Pinzette, um ein kleines Loch am oberen und stumpfen Ende des Eies zu machen, durch das eine 21-Gauge-Nadel passieren kann. Entfernen Sie mit einer Fünf-Milliliter-Spritze und einer 21-Gauge-Nadel zwei Milliliter des Albumins aus einem Loch am stumpfen Ende des Eies.

Decken Sie das Loch am stumpfen Ende mit durchsichtigem Klebeband ab. Damit das Eierfenster das durchsichtige Klebeband oben auf der Eierschale anbringt. Halten Sie die Nadeln von der Mikroinjektion aus Standardglaskapillaren mit einem vertikalen Pipettenzieher.

Nach dem Ziehen brechen Sie die Kapillarspitze mit einer feinen Pinzette ab, um einen Spitzendurchmesser von etwa 50 Mikrometern mit einem konischen Ende zu erhalten. Für das Gen-Knockout-Experiment mischen Sie die drei Konstrukte, nämlich das Leitplasmid, pcU6.1sgRNA, T2KeGFP, T2TP in einem Verhältnis von eins zu eins zu eins mit einem Mikrogramm SP Cas9-Protein, 30% Saccharose und 0,1% schnellem grünen Farbstoff und einem Endvolumen von 10 Mikrolitern. Stellen Sie bei der Elektropolierung mehrerer Plasmide sicher, dass die Endkonzentration der DNA mindestens vier Mikrogramm pro Mikroliter beträgt.

Mit Hilfe einer Springbow-Schere um ein zwei Zentimeter langes und 1,5 Zentimeter breites Fenster aufschneiden und den Embryo freilegen. Verwenden Sie dann eine Pinzette, um die Chorionmembranen über dem Embryo zu öffnen und den Zugang zum Embryo zu ermöglichen. Injizieren Sie etwa 200 Nanoliter DNA-Lösungsmischung, um das otische Vesikel zu füllen.

Um die Effizienz der Guide-RNA zu bestimmen, wird ein T7-Endonuklease-Assay durchgeführt. Fügen Sie dem Embryo 0,719% Kochsalzlösung hinzu, um den elektrischen Widerstand zu senken und eine Überhitzung zu verhindern. Als nächstes legen Sie die positive Elektrode durch das Loch an der stumpfen Seite des Eies und manövrieren Sie die Elektrode so, dass sie sich unter dem Eigelb befindet.

Legen Sie die negative Elektrode über die gefüllte Otozyste. Um das Plasmid mit Elektroporation in das otische Vesikel zu transfizieren, verwenden Sie einen quadratischen Pulsgenerator und wenden Sie fünf Impulse von 25 Volt für jeweils 100 Millisekunden im Abstand von 50 Millisekunden an. Bestimmen Sie die Bedingungen empirisch basierend auf einem individuellen Elektroporationsaufbau.

Nach der Elektroporation hydratisieren Sie den Embryo, indem Sie einige Tropfen 0,719% Kochsalzlösung hinzufügen. Verschließen Sie das Ei wieder mit durchsichtigem Klebeband und kehren Sie bei 37 bis 38 Grad Celsius zur weiteren Inkubation in den befeuchteten Inkubator zurück. Desinfizieren Sie den OP-Tisch, den Mikroskoptisch und die Umgebung mit 70% Ethanol und Hitze oder sterilisieren Sie die Mikrodissektionsausrüstung, einschließlich einer minimalen Federbogenschere, einer Mikroküre und zwei Paar feiner Pinzetten.

Bereiten Sie die Dissektionsplatten einschließlich einer Glas-Petrischale mit schwarzer Silikonbasis, einer 90-Millimeter-Kunststoff-Petrischale und einer 60-Millimeter-Petrischale vor. Halten Sie gekühltes PBS oder Hanks' ausgewogene Salzlösung, auch bekannt als HBSS, für die Sektion bereit. Knacken Sie das Ei vorsichtig in die 90 Millimeter Petrischale.

Identifizieren Sie dann das äußere Ohr des Kükens und übertragen Sie den Kopf auf eine 60-Millimeter-Petrischale, die mit eiskaltem PBS gefüllt ist. Als nächstes richten Sie den Embryo mit der Spitze des Schnabels nach innen aus und halten Sie den Schnabel mit einer der fünf Pinzetten Nummer fünf. Schöpfen Sie die Augen mit der zweiten Pinzette Nummer fünf aus.

Dann, von rostral zu kaudal, schneiden Sie entlang des Schädels entlang seiner Mittellinie und schöpfen Sie das Gehirn aus. Fügen Sie mehr eiskaltes PBS oder HBSS hinzu und lokalisieren Sie die beiden Otolithen der Lagena als glänzende Strukturen am Ende des Cochlea-Kanals und in der Nähe der Mittellinie. Um zwei Innenohren zu isolieren, schneiden Sie zwischen den beiden Lagenas und weit über und unter der Region.

Visualisieren Sie dann unter schräger Beleuchtung die Umrisse des Innenohrs und entfernen Sie Fremdgewebe und den Vorraum. Übertragen Sie die isolierte Cochlea auf eine schwarze Silikongrundplatte mit eiskaltem PBS. Ziehen Sie die knorpelige Cochlea-Kapsel mit einer fünften Pinzette ab, um den Cochlea-Gang zu erhalten.

Suchen Sie dann die gewellte Schicht oder das Tegmentum des Cochlea-Gangs und entfernen Sie sie mit einer Pinzette Nummer 55, um die Basilarpapille oder den Blutdruck freizulegen. Als nächstes entfernen Sie die tektoriale Membran, um Haarzellen und Stützzellen mit einer Pinzette Nummer 55 freizulegen. Für die Membrankultur der Basilarpapille nehmen Sie eine Sechs-Well-Gewebekulturplatte und ordnen Sie einen Kulturmembraneinsatz pro Vertiefung an. Ziehen Sie einige Medien in einer 200-Mikroliter-Pipette auf und saugen Sie dann die sezierte Basilarpapille mit einem X-HBSS-Puffer ab.

Übertragen Sie die Explantat auf eine Membran und richten Sie sie so aus, dass die Basilarpapille nach oben zeigt und die Haare und Stützzellen von oben sichtbar sind. Sobald die Explantat positioniert ist, saugen Sie den HBSS-Puffer langsam von der Oberfläche der Kulturmembran ab. Dabei wird sich die Explantat an die Kulturmembran anheften.

Füllen Sie die Vertiefung der Sechs-Well-Platte, indem Sie 1,2 Milliliter des modifizierten Eagle-Mediums oder DMEM-Kulturmediums von Dulbecco zwischen dem Membraneinsatz und der Brunnenwand hinzufügen. Um die Kollagenkultur des Cochlea-Gangs vorzubereiten, fügen Sie drei Tropfen frisch zubereiteter Kollagenmischung in jede Vertiefung einer Vier-Well-Platte hinzu und übertragen Sie den präparierten Cochlea-Gang auf jeden Kollagentropfen. Inkubieren Sie die Platte für 10 Minuten bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid, um die Kollagenmatrix auszuhärten.

Für eine niedermolekulare Behandlung der Kulturen ersetzen Sie die Kulturmedien durch 700 Mikroliter Medien, die mit dem pharmakologischen Modulator wie Penicillin ergänzt sind, und inkubieren Sie die Platten wie zuvor gezeigt. Ersetzen Sie jeden Tag 50% der Kulturmedien. Nach entsprechender Inkubationszeit werden die Nährmedien entfernt und die Explantate für nachgeschaltete Assays verwendet.

Im Elektroporationsaufbau führte die korrekte Elektrodenpositionierung zu einer höheren GFP-Expression im Innenohr in beiden vestibulären Organen und zu einer auditiven Basilarpapille, die die Transfektion bestätigte. CRISPR Cas9-vermittelte den Atoh1-Gen-Knockout im Innenohr und führte zum Verlust von Haarzellen. Atoh1-Gen-Knockout über eine Ovo-Elektroporation, gefolgt von Inkubation bis E10, zeigte eine reduzierte Haarzellentwicklung im Vergleich zur leeren Plasmidkontrolle.

Obwohl Elektroporation Mosaik ist, konnten elektropolierte Kontrollzellen Haarzellen bilden. In elektropolierten Atoh1-gRNA-Proben zeigten grün fluoreszierende Protein-positive Zellen nie die Marker der Haarzellentwicklung. Die Organkultur der Basilarpapille in einer 3D-Matrix, wie Kollagen und Färbung mit Antikörpern gegen Haarzellantigen, sorgte für die hervorragende Erhaltung der Gewebemorphologie für bis zu fünf Tage.

Die Organisation von Haarzellen und Stützzellen wurde unter diesen Kulturbedingungen aufrechterhalten. Die Organkulturen auf einer Membran können bis zu fünf Tage aufrechterhalten werden, während die Integrität des Haarbündels erhalten bleibt. Dies ist im repräsentativen Bild durch die Lokalisation des Tip-Link-Proteins, Protocadherin 15, zu sehen.

Um die Entwicklung des Haarbündels zu untersuchen, kann die Bildgebung mit höherer Auflösung, wie die Superauflösungsmikroskopie oder die Rasterelektronenmikroskopie, mehr Informationen liefern. Sterile Bedingungen sollten während des gesamten Verfahrens aufrechterhalten werden. Achten Sie beim Elektropolieren darauf, dass die Embryonen nicht austrocknen.

Bei der Titration pharmakologischer Inhibitoren kann man die Konzentration reduzieren, um jede Letalität zu überwinden. Sowohl Embryonen als auch Explantate können für bildgebende Experimente entnommen werden. Entweder durch Echtzeit-Videomikroskopie oder konfokale Elektronenmikroskopie mit statischem Licht, wie im Protokoll gezeigt.

Angesichts der Leichtigkeit und Zugänglichkeit der Verwendung von Hühner-Innenohr-Explantaten können wir Medium durch Proof-Screening verwenden, um neue Moleküle zu identifizieren, die für die Regeneration von Haarzellen unerlässlich sind.