Dieses Protokoll beschreibt, wie transgene Zebrafischlarven verwendet werden können, um einen in vivo quantitativen Assay der Tumor-Xenograft-Vaskularisation zu liefern. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber früheren Techniken ist, dass es dem Prüfer ermöglicht, Veränderungen in den Graden der Xenograft-Vaskularisation genau zu quantifizieren. Der wichtigste Schritt besteht darin, sicherzustellen, dass die Tumorzellen korrekt in Zebrafischlarven injiziert werden, damit nachfolgende Bildgebungs- und Quantifizierungsschritte nicht beeinträchtigt werden.
Nach dem Anbau und der Kennzeichnung von B16-F1-Zellen mit Fluoreszenzfarbstoff, beginnen Sie mit der Vorbereitung von Embryonen für die Implantation. Füllen Sie eine 35-Millimeter-Schale mit einer 2%Methylcellulose in E3-Lösung auf ein Viertel des Volumens der Schale. Mit einer Transferpipette ca. 50 zuvor präparierte transgene Embryonen auf die Methylcellulose legen und gleichzeitig das Volumen der übertragenen E3-Lösung minimieren.
Ordnen Sie die Embryonen mit hilfe einer mikrokapillaren Pipettenspitze so an, dass sie alle vertikal mit ihren Köpfen nach oben, Schwänzen nach unten und dem Embryo mit der linken Seite nach oben ausgerichtet sind. Fügen Sie 50%ECM zu einem zuvor vorbereiteten B16-F1-Zellpellet hinzu, um eine Mischung von Zellen zu ECM im Verhältnis zu zwei zu 1 zu erzeugen. Durch Pipettieren und Rühren gut mischen und die Mischung auf Eis lagern.
Verwenden Sie eine Mikrokapillarpipetten, um drei bis zehn Mikroliter Zellen aufzunehmen. Setzen Sie die Pipettenspitze vorsichtig in eine zuvor vorbereitete Mikroinjektionsnadel ein und werfen Sie dann die B16-F1-Matrixmischung in das Ende der Nadel aus. Setzen Sie die Nadel in den Nadelhalter ein und neigen Sie in einem 45-Grad-Winkel zur Schale.
Verwenden Sie eine Pinzette, um die Spitze der Nadel zu brechen, um ein Loch groß genug zu machen, damit die Zellen aus der Nadel ausgeworfen werden können, ohne die Zellen zu drücken. Schalten Sie den druckfertigen Luftzylinder ein, der an der Einspritzvorrichtung befestigt ist, und schalten Sie den Injektor dann kurzzeitig für nicht mehr als eine Sekunde in den kontinuierlichen Modus, um die Zellen an die Spitze der Nadel zu drücken. Richten Sie die Nadel auf den Dottersack eines Embryos und schieben Sie sie durch den Eigelbsack in ventraler Richtung, bis die Spitze der Nadel aus dem Eigelbsack hervorgegangen ist und die embryonale Epidermis auf der ventralen Seite des Embryos schiebt, nur hinter dem Herzen.
Schieben Sie die Nadelspitze vorsichtig und leicht nach vorne, bis sie einen kleinen Abstand zwischen der Epidermis und der Dottersackmembran geschaffen hat. Pulsieren Sie den Injektor, um einen Teil der Zellmischung in diesen Perivitelline-Raum auszuwerfen. Schauen Sie sich die Größe, Form und Position des Xenografts bei der Implantation sorgfältig an, und passen Sie die Pulszahl und Position der Nadel entsprechend an, um ein korrekt implantiertes Xenograft zu gewährleisten.
Wiederholen Sie die Impulse, bis 500 bis 800 Zellen in den Perivitelline-Raum injiziert wurden, wodurch eine sichtbare Wölbung entsteht, die sich mindestens die Hälfte des Weges entlang des Fußbodens des Dottersacks erstreckt. Entfernen Sie die Nadel aus dem Embryo. Nachdem Sie alle Embryonen injiziert haben, verwenden Sie eine mikrokapillare Pipettenspitze, um alle Embryonen zusammenzuschieben, so dass sie mit so wenig Methylcellulose wie möglich ausgepfiffen werden können.
Übertragen Sie die Embryonen in eine E3-haltige Rückgewinnungsschale mit PTU und Methylenblau. Dann sanft Pipette E3 um die Embryonen, um sie zu waschen, und dann bei 34 Grad Celsius brüten. Dann Bild anästhesierte Embryonen mit einem konfokalen Mikroskop.
Verwenden Sie einen Laserkanal, der für die Tumorzellen geeignet ist, um ein zu bebilderndes Volumen zu bestimmen, sodass mindestens ein oder zwei optische Abschnitte auf beiden Seiten des Transplantats möglich sind. Verwenden Sie Schnittintervalle, die etwa fünf Mikrometer voneinander entfernt sind, um einen Z-Stack zu erstellen. Verwenden Sie zweikanalige Bildgebung, um sowohl die Blutgefäße als auch das Tumor-Xenograft abzubilden.
Stellen Sie sich den Tumor Xenograft und die Blutgefäße für eine Larve, und wiederholen Sie diese Schritte für jede Larve abgebildet werden. Um mit der Quantifizierung der angiogenen Reaktion auf den Zebrafisch Xenograft zu beginnen, transferen zuvor erstellte Z-Stack konfokale Bilddateien eines Tumorxenografts in einen neuen Ordner auf der 3D-Bildanalysesoftware. Um das Tumorvolume-Protokoll zum Messen des Tumor-Xenograft-Volumens zu erstellen, wechseln Sie zur Registerkarte Messung im oberen Menü des Fensters, und ziehen Sie dann aus der Liste der angezeigten Protokolle das Protokoll mit dem Namen Objekte suchen in den Bereich, der den Titel Drag Tasks Here To Make Measurements trägt.
Nachdem Sie sichergestellt haben, dass dieses Protokoll so eingestellt ist, dass Objekte im Tumorkanal gemessen werden, ziehen Sie die Protokolle mit dem Namen Clip to ROIs und Make ROI From Population aus der Liste der Protokolle in den Bereich "Drag Tasks Here To Make Measurements" und stellen Sie sicher, dass diese beiden Befehle auf die von Find Objects identifizierten Objekte angewendet werden. Bevor Sie die Einstellungen dieses Protokolls kalibrieren, wechseln Sie zum Dropdown-Menü über der Modebeschriftung oben links im Fenster, und wählen Sie die Ansicht Erweiterter Fokus aus. Deaktivieren Sie die Nicht-Tumorkanäle im Bereich ganz rechts, indem Sie auf den schwarzen Kreis unter jeder Kanalüberschrift klicken, sodass nur der Tumorkanal sichtbar ist.
Verwenden Sie dann das Freihand-Tool oben im Fenster, um einen Bereich von Interesse oder ROI um das gesamte Tumorvolumen zu zeichnen. Wählen Sie im Bedienfeld unterhalb des Bildes die Beschriftung Zusammenfassung aus, und legen Sie dann die Option Anzeige fest, um die Grundgesamtheit zwei anzuzeigen. Um zu kalibrieren, klicken Sie auf die Aufgabe Objekte suchen auf das Sternchen, um das Einstellungsfenster zu öffnen.
Passen Sie den Schwellenwert mithilfe der Intensität an, und bestimmen Sie den unteren Schwellenwert, bis nur die Tumorzellen ausgewählt sind und nicht die Hintergrundfluoreszenz. Bestimmen Sie die minimale Objektgröße, sodass im Gegensatz zu kleineren Zellabfällen nur intakte Zellen gemessen werden, indem Sie die minimale Objektgröße auf 100 Kubikmeter festlegen. Speichern Sie dieses Protokoll als Tumorvolume, indem Sie im oberen Menü auf die Registerkarte Messungen klicken und auf Protokoll speichern klicken.
Verwenden Sie die gleichen Einstellungen zum Messen aller Xenografts. Um das Volumen der xenograft-assoziierten Blutgefäße zu messen, erstellen Sie ein neues Protokoll, indem Sie zum oberen Menü gehen und dann auf die Registerkarte Messungen und dann Protokoll löschen klicken. Ziehen Sie die Aufgaben Objekte suchen und Clip zu ROIs in den Bereich mit dem Titel Drag Tasks Here, um Messungen für dieses Protokoll vorzunehmen.
Stellen Sie sicher, dass der erste Befehl zum Messen von Objekten im Blutgefäßkanal festgelegt ist und dass der folgende Befehl so eingestellt ist, dass er auf die mit dem ersten Befehl identifizierten Objekte angewendet wird. Deaktivieren Sie dann die Nichtgefäßkanäle in der rechtsextremen Scheibe, so dass nur die Blutgefäße sichtbar sind. Bestimmen Sie die Einstellungen für das Vessel Volume-Protokoll in ähnlicher Weise wie für das zuvor beschriebene Tumor volume-Protokoll, und speichern Sie dieses Protokoll als Vessel Volume.
Löschen Sie das Protokoll, und zeichnen Sie einen ROI um das Xenograft, wobei darauf zu achten ist, dass keine Nicht-Tumor-Autofluoreszenz enthalten ist. Um die Summe der Volumen der Objekte im Tumorkanal innerhalb dieses ROI zu messen, klicken Sie auf die Registerkarte Messungen, wählen Sie den Befehl Protokoll wiederherstellen aus, wählen Sie das Tumorvolume-Protokoll aus, und klicken Sie auf Wiederherstellen. Klicken Sie mithilfe des neuen ROI des Tumor volume-Protokolls auf die Registerkarte Messungen, und wählen Sie den Befehl Protokoll wiederherstellen aus, wählen Sie das Vessel Volume-Protokoll aus, und klicken Sie auf die Summenzeile, um die Gesamtmenge der Objekte im Behälterkanal innerhalb dieses ROI zu berechnen.
Dividieren Sie das Gefäßvolumen durch das Tumorvolumen, und multiplizieren Sie die Antwort mit 100, um einen prozentualen Wert der Transplantat-Vaskularisation zu erhalten. Durch die Abbildung eines individuellen Xenografts nach sechs, 24 und 48 Stunden nach der Implantation kann die angiogene Reaktion zu verschiedenen Zeitpunkten berechnet werden, mit der größten angiogenen Reaktion zwischen 24 und 48 Stunden nach der Implantation und den maximalen Konzentrationen der Transplantat-Vaskularisation, die etwa 48 Stunden gesehen werden. Die konfokale Zeitraffer-Bildgebung eines B16-F1-Xenografts, das in einen zweitägigen Zebrafisch-Embryo implantiert wurde, zeigt GFP-markierte Blutgefäße, die durch das Xenograft wachsen und ein verdrehendes Netzwerk mit Gefäßen unregelmäßiger Größe und Morphologie bilden, die typisch für das abnorme Gefäßnetz sind, das bei Säugetiertumoren zu beobachten ist.
Xenografts, die im VEGFR-Inhibitor inkubiert werden, weisen eine große Gefäßreduktion im Vergleich zu Kontroll-Xenografts auf, die in DMSO inkubiert werden. Bei Kontrollembryonen gab es ein ausgedehntes Gefäßnetzwerk, das sich über die gesamte Xenograft-Region erstreckte, die typische angiogene Reaktion, die nach der Implantation von B16-F1-Zellen beobachtet wurde. Bei der Quantifizierung zeigt das angiogene Ansprechen eine deutliche Verringerung der Transplantat-Vaskularisation in den MIT VEGFR-Hemmern behandelten Xenografts im Vergleich zu Kontrollen.
Der Tumorkanal zeigt eine Masse von B16-F1-Zellen fluoreszierend unter dem Dottersack, die Autofluoreszenz anzeigt. Daher muss ein ROI sorgfältig um den Xenograft gezogen werden, wobei darauf zu achten ist, dass keine der Autofluoreszenz aus dem Dottersack enthalten ist. Das Tumor volume-Protokoll identifizierte alle B16-F1-Zellen im ROI, maß ihr Volumen und schnitt den ROI auf ihr Volumen ab.
Das Tumorgefäßvolumenprotokoll in diesem neuen abgeschnittenen ROI ermöglichte die Identifizierung aller Gefäße, die mit der Masse von B16-F1-Zellen assoziiert sind, und maß deren Volumen. Die Werte aus den Protokollen Tumorvolume und Tumor Vessel Volume können verwendet werden, um ein Maß für die Transplantatvularisation zu geben. Die genetische Traktionsfähigkeit und Durchlässigkeit von Zebrafischen ermöglicht die Untersuchung von hohen Signalwegen in der Tumorangiogenese, und es kann auch als Screening-Plattform dienen, um anti-angiogene Verbindungen zu identifizieren.
