Name: invasive behavior of human breast cancer cells in embryonic zebrafish
Uploaded: 2017-04-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
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Untersuchungen an TGF-β-Familie Mitglieder werden vom Cancer Genomics Center Niederlanden unterstützt. Sijia Liu und Jiang Ren werden von der China Scholarship Council für 4 Jahre Studium an der Universität von Leiden unterstützt. Wir danken Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) für die MCF10A Zelllinien.

Alle Forschung , um den transgenen fluoreszierenden Zebrabärbling Tg unter Verwendung (fli: EGFP) Stamm, der die grün fluoreszierendes Protein (EGFP) -markierten Gefäß 20, einschließlich Gehäuse und Experimenten verbessert hat, wurde nach den internationalen Richtlinien durchgeführt und wurde von dem lokalen institutionellen Ausschuß genehmigt Tierschutz (Dier Ethische Commissie (DEC) der Leiden University Medical Center. HINWEIS: Wie in Figur 1 zusammengefaßt, wird das Protokoll grob in vier Schritte: Besamungs (Abbildung 1A), die Mikroinjektion (1B), Screening (1C), und die Analyse (Figur 1D). 1. Bereiten die Injektionsnadeln <ol><li> Bereiten Injektionsnadeln mit Borosilikatglas Mikrokapillaren. Legen Sie eine Mikrokapillare in eine Mikropipette Abziehvorrichtung mit den folgenden Einstellungen: Luftdruck, 500; Hitze, 650; ziehen, 100; Geschwindigkeit, 200; Zeit,40. Halten die Injektionsnadeln in einer Nadelhalteplatte, bis sie für die Injektion verwendet werden. </li></ol> 2. Bereiten Sie die Fluorescent, Genetisch Beschriftete Brustkrebszellen zur Injektion <ol><li> Kultur menschlicher Brustkrebs MDA-MB-231-Zellen bei 37 ° C in DMEM-Hochglucosemedium, das L-Glutamin, 10% fötalen Rinderserum und 1: 100 Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep). </li><li> Kultur, um die Brust-Epithel-Zelllinien, MCF10A (M1) und MCF10A-Ras (M2), bei 37 ° C in DMEM / F12-Medium, das L-Glutamin mit 5% Pferdeserum, 20 ng / ml epidermalen Wachstumsfaktor, 10 mg / mL Insulin, 100 ng / ml Cholera-Enterotoxin, 0,5 mg / ml Hydrocortison und 1: 100-Pen-Strep. </li><li> Produzieren mCherry Lentivirus durch Cotransfektion PLV-mCherry, pCMV-VSVG 21, pMDLg-RRE (gag / pol) 22 und pRSV-REV 22 Plasmid in HEK293T - Zellen. Erntezellüberstände 48 Stunden nach der Transfektion und bei -80 ° C. </li><li> ichnfect MDA-MB-231, M1, M2 und Zellen bei 30% Konfluenz für 24 h mit lentiviralen Überstand, verdünnt 1: 1 mit normalen Kulturmedium in Gegenwart von 5 ng / mL Polybren. </li><li> Wählen Einzelzellklone von den Zellen in einer 96-Well-Platte verdünnt wird, die das Auswachsen von isolierten Zellklone ermöglicht, bis die stabilen mCherry-exprimierende Zelllinien zu erhalten. </li><li> Kultur eines T75-Kolben von Zellen zur Injektion. Ernte der Zellen bei 80% Konfluenz mit einer 0,5% Trypsin-EDTA-Behandlung. Waschen Sie die Zellen mit 1x PBS 2-3 mal. </li><li> Resuspendieren der Zellen in etwa 200 &amp; mgr; l PBS. Aufbewahren bei ihnen 4 ° C für weniger als 5 Stunden vor der Injektion. </li></ol> 3. Bereiten Sie Zebrafischembryonen zur Injektion <ol><li> Richten Sie Zebrabärbling Brutpaare und sammeln Embryonen, wie in einem früheren JoVE Artikel von Rosen gezeigt et al. 23. </li><li> Wählen Sie die Embryonen, die bei 0-4 HPF sind durch die unbefruchteten und abnorme Embryonen zu entfernen. Halten Sie die Embryonen in einer Petri-dish voller Ei Wasser (60 &amp; mgr; g / ml Meersalze; ~ 60 Embryonen / Schale) und bei 28 ° C inkubieren. </li><li> Dechorionate die Embryonen mit einer feinen Pinzette bei 48 HPF. </li><li> Anesthetize die Embryonen von ihnen zu 40 ug / ml Tricaine (3-Aminobenzoesäure), das Ei Wasser etwa 2 min vor der Injektion, aber nicht länger als 2 h vor der Injektion zu übertragen. HINWEIS: Tricaine Stammlösung (4 mg / ml, 100x) als 400 mg Tricaine Pulver in 97,9 ml doppelt destilliertem Wasser und 2,1 ml 1 M Tris-Base (pH 9), wobei der pH-Wert auf 7,4 eingestellt. Speicher in der -20 ° C Gefrierschrank. </li></ol> 4. Inject menschliche Brustkrebszellen in den perivitellinen Raum <ol><li> Last 15 ul der Zellsuspension in eine Injektionsnadel. Montieren die Nadel auf den Mikromanipulator und brechen die Nadelspitze mit einem feinen Pinzette off ein Spitzenöffnungsdurchmesser von 5-10 um zu erhalten. </li><li> Verwenden eines pneumatischen picopump und einen Manipulator, um die Mikroinjektion durchzuführen. adjust die picopump 400 Zellen jedes Mal zu injizieren. Vor der Injektion Zählen der Zellzahlen von Hand durch die Zellen auf der Oberseite einer Petrischale mit 1% Agarose einzuspritzen. </li><li> Line up narkotisierten Embryonen (2-3 Tage nach der Befruchtung (dpf)) auf einer flachen, 1% igen Injektion Platte, rund 10 Embryonen jedes Mal. </li><li> Ausrichten der Einspritzplatte mit der Hand während der Injektionen , die Embryonen zu versetzen , in der bevorzugten Stellung zum Einführen der Nadel (dh diagonal). </li><li> Die Nadelspitze an der Injektionsstelle und sanft die Nadelspitze in den perivitellinen Raum zwischen dem Dottersack und dem periderm des Zebrafischembryos (2A) einzufügen. </li><li> Einzuspritzen etwa 400 mCherry-markierten Tumorzellen. Achten Sie darauf, dass der Dottersack nicht Implantation in den Dottersack zu vermeiden zerrissen wird. </li></ol> 5. Injizieren menschlichen Brustkrebszellen in die Doc <ol><li> Bereiten Sie die Injektionsnadel und Zebrafisch-Embryonen als i beschrieben<html> n Protokollschritte 1, 2 und 3. </li><li> Verwenden, um einen 45 ° Winkel Nadel, so dass der Doc von der dorsalen Seite des Embryos angefahren werden. </li><li> Die Nadel in den Startpunkt der DOC (Figur 3A), um nur dorsal , wo der Kanal beginnt über den Dottersack verbreiterte und injiziert etwa 400 Zellen; die Injektion ist korrekt, wenn das Volumen innerhalb des Kanals unmittelbar nach dem Impuls und den Dottersack expandiert. HINWEIS: Mehrere aufeinanderfolgende Injektionen können, ohne Extraktion der Nadel durchgeführt werden. </li><li> Übertragen Sie die injizierten Zebrabärblingembryonen zu Ei Wasser. HINWEIS: Da erhebliche Unterschiede gibt es zwischen den einzelnen Zebrabärblingembryonen, und wie der Tod von Embryonen nach der Injektion auftreten kann, eine relativ große Anzahl von Zebrabärblingembryonen (ca. 100) soll mit Krebszellen injiziert werden. </li><li> Pflegen die Zebrabärblingembryonen bei 33 ° C, die optimalen Temperaturanforderungen für Fische und Säugetierzellen zu ermöglichen. </li></ol>_title &quot;&gt; 6. Bildschirm, um die injizierten Embryonen <ol><li> Bildschirm jeden Fisches unter einem Fluoreszenz - Stereomikroskop bei 2 h nach der Injektion (hpi) für die Injektions perivitellinen Raumes (2) oder bei 2-24 hpi für die Doc - Injektion (Abbildung 2) , um sicherzustellen , dass alle der Embryonen mit einem injiziert ähnliche Anzahl von Tumorzellen. Entfernen Sie die Embryonen mit Injektionsfehlern, wie Brüchen (2B) oder Injektionen (3B) des Dottersackes und auszusuchen Embryonen mit injizierten Zellen unter (2C und 3B) oder über (Figuren 2D und 3B) Schwellenwert liegt. Behalten Sie nur die Embryonen mit etwa 400 Zellen in Kultur. </li><li> Schließen die Möglichkeit aus, dass die Zellen direkt in den Verkehr während des Injektionsvorgangs eingeführt werden durch die Embryonen zu entfernen mit Zellen, die bereits im Umlauf. Entfernen Sie auch jeden Embryo mit einer Zellmasse nahe dem Doc (2D </strong&gt;). </li></ol> 7. Bild und Analysieren des metastatischen Prozesses <ol><li> Sammle mehrere anästhesiert Embryonen mit einer großen Spitze-Pasteur-Pipette und sie auf dem Glasboden eines Polystyrolschale. </li><li> überschüssiges Wasser entfernen und eine begrenzte Menge an Ei Wasser halten. Manipulieren des Embryos in einer Position mit einem Haarschleife Werkzeug und legt eine Abdeckung auf der Oberseite des Glases. </li><li> Verwenden eines invertierten konfokalen Mikroskop in Kombination mit wasserEintAuchen oder Ferntrocken Ziele. Positionieren Sie den Embryo, so dass die Region von Interesse ist so nahe am Ziel wie möglich. </li><li> Führen Bildgebung unmittelbar nach der Anästhesie der Gefahr des Todes zu verringern durch Flüssigkeitsverdampfung. <ol><li> Capture-Signale von EGFP-markiertem Vaskulatur und mCherry-markierten Tumorzellen an der gleichen Position auf der Embryonen zusammenzuwirken Registerzellen mit Blutgefäße injiziert, indem die beiden bildgebenden Kanäle zu verschmelzen. </li><li> Für jeden Zebrafischembryo, sammeln zwei verschiedene Sätze von Bildernvom Kopfbereich und Schwanzbereich. </li></ol></li><li> Quantifizieren der Anzahl von disseminierten Zellen. <ol><li> Für perivitellinen Raum Injektionen, zählen die Anzahl der Zellen in jedem Fisch, der von der Zellmasse in Richtung der embryonischen Fischkörper in den Kopf- und Schwanzbereichen 4, 15 verbreitet hat; die Regionen über die Grenzen des Herzens Hohlraum auf der Oberseite der Schwimmblase dorsal und jenseits der urogenitalen Öffnung kaudal frontal. </li><li> Für die Doc-Injektion, um die Anzahl der einzelnen Zellen zählen, die die Kollagenfasern des tailfin aus dem Kreislauf (MDA-MB-231) oder die Anzahl von Clustern, die durch Zellen gebildet kollektiv (M2) im kaudalen hämatopoetische Geweben (CHT) von eingedrungenen jeder Zebrafisch 19. </li></ol></li><li> Studium der Invasion und Metastasierung im Detail durch konfokale Mikroskopie (sehr empfehlenswert). <ol><li> Verwenden geringe Vergrößerung (4X Objektiv) das Bild der ganzenKörper und einen Überblick über die Tumorzelldissemination Muster zu erhalten. HINWEIS: Ein stärkere Vergrößerung (20X und 40X Ziele) ist geeignet zur Untersuchung von intra- und peri-tumorale Angiogenese und die genaue Lokalisierung von disseminierten Zellen im Embryo Körper. </li><li> Verwenden, um einen 488-nm-Laser den Zebrafischembryo Vaskulatur und einen 543 nm-Laser gescannt implantierten Tumorzellen mit roter Fluoreszenz markierte abzutasten. Besorgen Sie sich ein qualitativ hochwertiges Bild durch Abtasten jeden Embryos in acht bis zehn Schritten. Scannen und im Durchschnitt jeden Schritt sechsmal. </li></ol></li><li> Legen Sie das Embryo wieder in das Ei Wasser, wenn es für weitere Experimente erforderlich ist. </li></ol> 8. Führen Sie Statistische Auswertung mittels Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) , gefolgt von Post - Hoc - Analyse

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Hier haben wir beschrieben , zwei Methoden , um das invasive Verhalten von Brustkrebszellen in Tg (FLI1: EGFP) zu untersuchen Zebrabärblingembryonen, mit perivitellinen Raum und Doc - Injektionen. Durch die Injektion mit chemischen Farbstoff markiert Krebszellen oder fluoreszierendem Protein in transgene Zebrafischembryonen, die dynamischen und räumlichen Eigenschaften der Invasion und Metastasierung können deutlich an der Einzelzelle oder Clusterebene unter einem Fluoreszenzmikroskop in Echtzeit verfolgt we...

Offenkundige Krebsmetastasen in der Klinik weisen eine Reihe von komplexen und mehrstufiges Ereignissen als „metastatic cascade“ bekannt. Die Kaskade wurde ausführlich überprüft und können in aufeinanderfolgende Schritte zerlegt werden: lokale Invasion, intravasation, Verbreitung, Festnahme, Extravasation und Kolonisierung 1, 2. Ein besseres Verständnis der Pathogenese von Krebsmetastasen und der Entwicklung von möglichen Behandlungsstrategien in vivo erfordert robuste Host - Modelle von Krebszellen zu verbreiten. Nagetiermodelle sind gut etabliert und werden verwendet , weit Metastasierung 3 zu bewerten, aber diese Ansätze haben eine geringe Effizienz und ethische Grenzen und sind teuer als Vordergrund Modell zu bestimmen , ob eine bestimmte Manipulation des metastatischen Phänotyp beeinflussen könnte. Andere effiziente, zuverlässige, kostengünstige Modelle sind notwendig, um schnell die möglichen Auswirkungen des Zugangs (epi) genetische Veränderungen oder pharmacologische Verbindungen. Aufgrund ihrer hohen genetischen Homologie zu den Menschen und die Transparenz ihrer Embryonen Zebrabärbling (Danio rerio) haben als ein wichtiges wirbel Modell entstanden und zunehmend auf die Untersuchung von Entwicklungsprozessen angewendet werden, mikroben Wirt - Interaktionen, menschliche Krankheiten, Drogen - Screening, etc. . 4. Die Krebsmetastasen Modelle in Zebrabärbling erstellt wurden, können eine Antwort auf die Mängel von Nagetiermodellen bieten 5, 6. Obwohl spontaner Neoplasie kaum in Wild Zebrabärbling 7 zu sehen ist gibt es mehr Techniken seit langem des gewünschten Krebs in Zebrabärbling zu induzieren. Karzinogen-induzierte Gen - Mutationen oder Signalwegs - Aktivierung können in menschliche Krankheit Zebrabärbling 7, 8, 9 und histologisch molekular Modell des Karzinogenese, nachahmt. durch taking Vorteil von verschiedenen Vorwärts- und Rückwärts genetische Manipulationen von Onkogenen oder Tumorsuppressoren, (transgene) Zebrabärbling hat auch potentielle Studien der Krebsentstehung und Wartung 6, 10 aktiviert. Die induzierten Krebsmodelle in Zebrabärbling decken ein breites Spektrum, einschließlich Verdauungs-, Fortpflanzungs-, Blut, Nervensystem, und epithelialen 6. Die Nutzung von Zebrabärbling in der Krebsforschung hat sich durch die Etablierung von humanen Tumorzell Xenograftmodellen in diesem Organismus vor kurzem erweitert. Dies wurde zuerst mit humanen metastasierenden Melanom - Zellen berichtet , dass im Jahr 2005 11 an dem Blastulastadium in Zebrabärblingembryonen erfolgreich transplantiert wurden. Mehrere unabhängigen Labors haben die Machbarkeit dieser Pionierarbeit validiert durch ein breites Spektrum von Säugetierkrebszelllinien in Zebrabärbling an verschiedenen Standorten und Entwicklungsstadien der Einführung 5 &lt;/ Sup&gt;. Zum Beispiel Injektionen in der Nähe der Blastulascheiben und Blastozyste der Blastulastadium; Injektionen in den Dottersack, perivitellinen Raum, Kanal von Cuvier (Doc) und posterioren Kardinalvene von 6-h- bis 5 Tage alten Embryonen; und Injektionen in die Bauchhöhle von 30 Tage alten immunsupprimierten Larven wurden 5 durchgeführt, 12. Zusätzlich wurden allogenen Tumor Transplantationen auch in Zebrabärbling berichtet 12, 13. Einer der großen Vorteile von Xenotransplantaten ist, dass die transplantierten Krebszellen fluoreszenz kann leicht gekennzeichnet und unterscheiden sich von normalen Zellen. Daher Untersuchungen über das dynamische Verhalten von microtumor Bildung 14, Zellinvasion und Metastasierung 15, 16, 17, tumorinduzierte Angiogenese 15, 18, und die Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und Wirtsfaktoren 17 in lebenden Fischen Körper deutlich sichtbar gemacht werden, vor allem , wenn transgene Zebrabärbling Linien 5 angewendet werden. Angeregt durch das hohe Potential von Zebrabärbling Xenograftmodellen Metastasierung zu bewerten, haben wir gezeigt , die transvaskulärer Extravasation Eigenschaften verschiedener Brustkrebszelllinien in dem tailfin Bereich von Tg (FLI: EGFP) Zebrabärbling - Embryonen durch Doc Injektionen 16. Die Rolle von transformierendem Wachstumsfaktor-β (TGF-β) 16 und bone morphogenetic protein (BMP) 19 Signalweg in pro- / Anti-Brustkrebs-Zellinvasion und Metastasierung wurden auch in diesem Modell untersucht. Darüber hinaus haben wir rekapituliert auch die intravasation Fähigkeit verschiedener Brustkrebszelllinien in Umlauf Xenotransplantat Zebrabärbling Modelle mit perivitellinen Raum Injektionen. <p class = „jove_content“&gt; Dieser Artikel stellt detaillierte Protokolle für Zebrabärbling Xenograftmodellen basiert auf der Injektion von menschlichen Brustkrebszellen in den perivitellinen Raum oder Doc. Verwendung von hochauflösenden Fluoreszenzabbildung zeigen wir den repräsentativen Prozess der intravasation in Blutgefäße und das invasiven Verhaltens von verschiedenen menschlichen Brustkrebszellen, die aus den Blutgefäßen in den avaskuläre tailfin Bereich bewegen.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>MP Biomedicals</td><td>AGAF0500</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillary</td><td>Harvard Apparatus</td><td>300038</td><td></td></tr><tr><td>Cholera enterotoxin&amp;nbsp;</td><td>Calbiochem</td><td>227035</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Leica</td><td>SP5 STED</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-high glucose media containing L-glutamine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 media containing L-glutamine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21041025</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 forceps</td><td>Fine Science Tools Inc</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Epidermal growth factor</td><td>Merck Millipore</td><td>01-107</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>16140071</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent stereo microscope</td><td>Leica</td><td>M165 FC</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T cell line</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>SigmaAldrich</td><td>227035</td><td></td></tr><tr><td>Horse serum</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>SigmaAldrich</td><td>I-6634</td><td></td></tr><tr><td>MCF10A (M1) cell line</td><td></td><td></td><td>Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MCF10Aras (M2) cell line</td><td></td><td></td><td>Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MDA-MB-231 cell line</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRM-HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>Manual micromanipulator&amp;nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>M3301R</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Wide-tip Pasteur pipette (0.5-20 &amp;micro;L)</td><td>Eppendorf</td><td>F276456I</td><td></td></tr><tr><td>pCMV-VSVG plasmid</td><td></td><td></td><td>Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands)</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PLV-mCherry plasmid</td><td>Addgene</td><td>36084</td><td></td></tr><tr><td>pMDLg-RRE (gag/pol) plasmid</td><td></td><td></td><td>Kindly provided by Prof. Dr. Rob Houben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands)</td></tr><tr><td>Pneumatic picoPump</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYS-PV820</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>SigmaAldrich</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>Prism 4 software</td><td>GraphPad Software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pRSV-REV plasmid</td><td></td><td></td><td>Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands)</td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Leica</td><td>MZ16FA</td><td></td></tr><tr><td>Tg (&lt;em&gt;fli:EGFP&lt;/em&gt;) zebrafish strain</td><td></td><td></td><td>Kindly provided by Dr. Ewa Snaar-Jagalska (Institute of Biology, Leiden University, Leiden, The Netherlands)</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>SigmaAldrich</td><td>11814273001</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine (3-aminobenzoic acid)</td><td>SigmaAldrich</td><td>A-5040</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.5%)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes, polystyrene (60 &amp;times; 15 mm)</td><td>SigmaAldrich</td><td>P5481-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene dish with glass bottom</td><td>WillCo</td><td>GWST-5040</td><td></td></tr></tbody></table>

invasive behavior of human breast cancer cells in embryonic zebrafish

In vielen Fällen Krebspatienten sterben nicht von einem Primärtumor, sondern wegen der Metastasierung. Obwohl zahlreiche Nagetiermodelle zur Untersuchung von Krebsmetastasen in vivo zur Verfügung stehen, andere effizient, zuverlässig, sind Low-Cost - Modelle benötigt , um schnell die möglichen Auswirkungen von (epi) genetischen Veränderungen oder pharmakologischer Verbindungen zugreifen. Als solche wir veranschaulichen und die Machbarkeit der Xenograftmodellen mit menschlichen Brustkrebszellen injiziert in Zebrabärblingembryonen erklären, dieses Ziel zu unterstützen. Unter dem Mikroskop sind in transgene Zebrafischembryonen transplantiert fluoreszierende Proteine oder chemisch markierte menschliche Brustkrebszellen, Tg (FLI: EGFP), am perivitellinen Raum oder Kanal Cuviers (DOC) 48 h nach der Befruchtung. Kurz darauf der räumlich-zeitliche Prozess der Invasion von Krebszellen, die Verbreitung und die Metastasierung im lebenden Fischkörper wird unter einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht. Die Modelle mit unterschiedlichen Injektionsstellen, dh proivitelline Raum oder Doc ist komplementär zueinander, was das frühe Stadium (intravasation Schritt) und Spätstadium (Extravasation Schritt) der vielstufigen metastatischen Kaskade von Ereignissen. Darüber hinaus kann peritumoralen und intratumorale Angiogenese mit der Injektion in den perivitellinen Raum beobachtet werden. Die gesamte Versuchsdauer nicht mehr als 8 Tage. Diese beiden Modelle kombinieren Zellmarkierung, Mikro-Transplantation, und Fluoreszenz-Bildgebungstechniken, ermöglicht die schnelle Auswertung von Krebsmetastasen in Reaktion auf genetische und pharmakologische Manipulationen.

Im embryonalen Xenotransplantat Zebrabärbling-Modell mit einer perivitellinen Raum Injektion, die hämatogene Verbreitung von markierten Krebszellen im Fischkörper als aktive Migration betrachtet. Dieser Prozess kann unter einem Fluoreszenzmikroskop nachgewiesen und quantifiziert werden, wie oben bei den Verfahren beschrieben. Um dieses Xenograftmodell veranschaulicht, folgten wir den Verbreitungsprozess verschiedener Brustkrebs-Zelllinien mit bekannter (oder ohne) invasion / Metastasi...

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Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

Hier beschreiben wir Xenotransplantat Zebrabärbling Modelle mit zwei verschiedenen Injektionsstellen, dh perivitellinen Raum und Kanal von Cuvier, das invasive Verhalten zu untersuchen und die intravasation und Extravasation Potential von menschlichen Brustkrebszellen zu bewerten sind.

Invasive Verhalten von menschlichen Brustkrebszellen in embryonalem Zebrabärbling

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

invasive-behavior-of-human-breast-cancer-cells-in-embryonic-zebrafish

Research

JoVE Journal

Cancer Research

16.5K Aufrufe.  Leiden University Medical Center.  Hier beschreiben wir Xenotransplantat Zebrabärbling Modelle mit zwei verschiedenen Injektionsstellen, dh perivitellinen Raum und Kanal von Cuvier, das invasive Verhalten zu untersuchen und die intravasation und Extravasation Potential von menschlichen Brustkrebszellen zu bewerten sind. 

Serie: Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish (Danio Rerio)

Cancer cell vascular invasion and extravasation is a hallmark of metastatic progression. Traditional in vitro models of cancer cell invasion of endothelia typically lack the fluid dynamics that invading cells are otherwise exposed to in vivo. However, in vivo systems such as mouse models, though more physiologically relevant, require longer experimental timescales and present unique challenges associated with monitoring and data analysis. Here we describe a zebrafish assay that seeks to bridge this technical gap by allowing for the rapid assessment of cancer cell vascular invasion and extravasation. The approach involves injecting fluorescent cancer cells into the precardiac sinus of transparent 2-day old zebrafish embryos whose vasculature is marked by a contrasting fluorescent reporter. Following injection, the cancer cells must survive in circulation and subsequently extravasate from vessels into tissues in the caudal region of the embryo. Extravasated cancer cells are efficiently identified and scored in live embryos via fluorescence imaging at a fixed timepoint. This technique can be modified to study intravasation and/or competition amongst a heterogeneous mixture of cancer cells by changing the injection site to the yolk sac. Together, these methods can evaluate a hallmark behavior of cancer cells and help uncover mechanisms indicative of malignant progression to the metastatic phenotype.

Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish Danio Rerio

This method utilizes zebrafish embryos to efficiently test the vascular invasive ability of cancer cells. Fluorescent cancer cells are injected into the precardiac sinus or yolk sac of developing embryos. Cancer cell vascular invasion and extravasation is assessed via fluorescence microscopy of the tail region 24 to 96 hr later.

Testen des Vascular Invasive Fähigkeit von Krebszellen in Zebrabärbling (<em&gt; Danio rerio</em&gt;)

Cancer cell vascular invasion and extravasation is a hallmark of metastatic progression.  Traditional in vitro models of cancer cell invasion of ...

Forschung

Krebsforschung

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to assess potential patient response to therapy. Current methods largely depend on using syngeneic or immune-compromised animals to avoid rejection of the tumor graft. Such methods require the use of specific genetic strains that often prevent the analysis of immune-tumor cell interactions and/or are limited to specific genetic backgrounds. An alternative method in zebrafish takes advantage of an incompletely developed immune system in the embryonic brain before 3 days, where tumor cells are transplanted for use in short-term assays (i.e., 3 to 10 days). However, these methods cause host lethality, which prevents the long-term study of tumor cell behavior and drug response. This protocol describes a simple and efficient method for the long-term orthotopic transplantation of zebrafish brain tumor tissue into the fourth ventricle of a 2-day-old immune-competent zebrafish. This method allows: 1) long-term study of tumor cell behaviors, such as invasion and dissemination; 2) durable tumor response to drugs; and 3) re-transplantation of tumors for the study of tumor evolution and/or the impact of different host genetic backgrounds. In summary, this technique allows cancer researchers to assess engraftment, invasion, and growth at distant sites, as well as to perform chemical screens and cell competition assays over many months. This protocol can be extended to studies of other tumor types and can be used to elucidate mechanisms of chemoresistance and metastasis.

The transplantation of cancer cells is an important tool for the identification of cancer mechanisms and therapeutic responses. Current techniques depend on immune-incompetent animals. Here, we describe a method to transplant zebrafish tumor cells into immune-competent embryos for the long-term analysis of tumor cell behavior and in vivo drug responses.

Transplantation von Zebrafisch-pädiatrischen Hirntumoren in immune-kompetente Wirte für die Langzeitstudie von Tumorzellverhalten und Drug Response

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A zebrafish xenograft is created by implanting mammalian tumor cells into the perivitelline space of two days-post-fertilization zebrafish embryos, followed by measuring the extent of the angiogenic response observed at an experimental endpoint up to two days post-implantation. The key advantage to this method is the ability to accurately quantitate the zebrafish host angiogenic response to the graft. This enables detailed examination of the molecular mechanisms as well as the host vs tumor contribution to the angiogenic response. The xenografted embryos can be subjected to a variety of treatments, such as incubation with potential anti-angiogenesis drugs, in order to investigate strategies to inhibit tumor angiogenesis. The angiogenic response can also be live-imaged in order to examine more dynamic cellular processes. The relatively undemanding experimental technique, cheap maintenance costs of zebrafish and short experimental timeline make this model especially useful for the development of strategies to manipulate tumor angiogenesis.

The aim of this method is to generate an in vivo model of tumor angiogenesis by xenografting mammalian tumor cells into a zebrafish embryo that has fluorescently-labelled blood vessels. By imaging the xenograft and associated vessels, a quantitative measurement of the angiogenic response can be obtained.

In Vivo Bildgebung und Quantifizierung der Angiogenreaktion des Wirts bei Zebrafischtumor Xenografts

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the standard in the field, but zebrafish have emerged as an alternative model with several advantages, including the ability for high-throughput and low-cost drug screening. Zebrafish also allow for in vivo drug screening with large replicate numbers that were previously only obtainable with in vitro systems. The ability to rapidly perform large scale drug screens may open up the possibility for personalized medicine with rapid translation of results back to clinic. Zebrafish xenograft models could also be used to rapidly screen for actionable mutations based on tumor response to targeted therapies or to identify new anti-cancer compounds from large libraries. The current major limitation in the field has been quantifying and automating the process so that drug screens can be done on a larger scale and be less labor-intensive. We have developed a workflow for xenografting primary patient samples into zebrafish larvae and performing large scale drug screens using a fluorescence microscope equipped imaging unit and automated sampler unit. This method allows for standardization and quantification of engrafted tumor area and response to drug treatment across large numbers of zebrafish larvae. Overall, this method is advantageous over traditional cell culture drug screening as it allows for growth of tumor cells in an in vivo environment throughout drug treatment, and is more practical and cost-effective than mice for large scale in vivo drug screens.

Zebrafish xenograft models allow for high-throughput drug screening and fluorescent imaging of human cancer cells in an in vivo microenvironment. We developed a workflow for large scale, automated drug screening on patient-derived leukemia samples in zebrafish using an automated fluorescence microscope equipped imaging unit.

Arzneimittel-Screening von Primärpatienten abgeleitetTumor Xenografts in Zebrafischen

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal models are required for bridging the nanotechnology to its biomedical application. The mouse represents the traditional animal model for preclinical testing; however, mice are relatively expensive to keep and have long experimental cycles due to the limited progeny from each mother. The zebrafish has emerged as a powerful model system for developmental and biomedical research, including cancer research. In particular, due to its optical transparency and rapid development, zebrafish embryos are well suited for real-time in vivo monitoring of the behavior of cancer cells and their interactions with their microenvironment. This method was developed to sequentially introduce human cancer cells and functionalized nanoparticles in transparent Casper zebrafish embryos and monitor in vivo recognition and targeting of the cancer cells by nanoparticles in real time. This optimized protocol shows that fluorescently labeled nanoparticles, which are functionalized with folate groups, can specifically recognize and target metastatic human cervical epithelial cancer cells labeled with a different fluorochrome. The recognition and targeting process can occur as early as 30 min postinjection of the nanoparticles tested. The whole experiment only requires the breeding of a few pairs of adult fish and takes less than 4 days to complete. Moreover, zebrafish embryos lack a functional adaptive immune system, allowing the engraftment of a wide range of human cancer cells. Hence, the utility of the protocol described here enables the testing of nanoparticles on various types of human cancer cells, facilitating the selection of optimal nanoparticles in each specific cancer context for future testing in mammals and the clinic.

Described here is a method for utilizing zebrafish embryos to study the ability of functionalized nanoparticles to target human cancer cells in vivo. This method allows for the evaluation and selection of optimal nanoparticles for future testing in large animals and in clinical trials.

In Vivo Targeting von xenografierten menschlichen Krebszellen mit funktionalisierten fluoreszierenden Kieselsäure-Nanopartikeln in Zebrafischen

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...

Generation of Zebrafish Larval Xenografts and Tumor Behavior Analysis

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly visualizing the response to anti-cancer therapies (chemo, radiotherapy, and biologicals), angiogenesis and metastasis with single cell resolution, places the zebrafish xenograft model as a top choice to develop preclinical studies.

The zebrafish larval xenograft assay presents several experimental advantages compared to other models, but probably the most striking is the reduction of size scale and consequently time. This reduction of scale allows single cell imaging, the use of a relatively low number of human cells (compatible with biopsies), medium-high-throughput drug screenings, but most importantly enables a significant reduction of the time of the assay. All these advantages make the zebrafish xenograft assay extremely attractive for future personalized medicine applications.

Many zebrafish xenograft protocols have been developed with a wide diversity of human tumors; however, a general and standardized protocol to efficiently generate zebrafish larval xenografts is still lacking. Here we provide a step-by-step protocol, with tips to generate xenografts and guidelines for tumor behavior analysis, whole-mount immunofluorescence, and confocal imaging quantification.

Here, we provide a step-by-step protocol, with tips to generate xenografts and guidelines for tumor behavior analysis, whole-mount immunofluorescence, and confocal imaging quantification.

Generation von Zebrafischen Larval Xenografts und Tumorverhaltensanalyse

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly ...

Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing technologies applied in zebrafish modeling, the ease of maintenance, high-yield productivity, and powerful live imaging altogether make the zebrafish a valuable model system to study metastasis and cellular and molecular bases underlying this process in vivo. The first zebrafish neuroblastoma (NB) model of metastasis was developed by overexpressing two oncogenes, MYCN and LMO1, under control of the dopamine-beta-hydroxylase (d&#946;h) promoter. Co-overexpressed MYCN and LMO1 led to the reduced latency and increased penetrance of neuroblastomagenesis, as well as accelerated distant metastasis of tumor cells. This new model reliably reiterates many key features of human metastatic NB, including involvement of clinically relevant and metastasis-associated genetic alterations; natural and spontaneous development of metastasis in vivo; and conserved sites of metastases. Therefore, the zebrafish model possesses unique advantages to dissect the complex process of tumor metastasis in vivo.

This paper introduces the method of developing, characterizing, and tracking in real-time the tumor metastasis in zebrafish model of neuroblastoma, specifically in the transgenic zebrafish line with overexpression of MYCN and LMO1, which develops metastasis spontaneously.

Zebrafisch-Modell der Neuroblastom-Metastasierung

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling processes of excitable neuronal and muscular cells and many other biological processes, such as embryonic developmental patterning. However, there is a need for in vivo electrical activity monitoring in vertebrate embryogenesis. The advances of genetically encoded fluorescent voltage indicators (GEVIs) have made it possible to provide a solution for this challenge. Here, we describe how to create a transgenic voltage indicator zebrafish using the established voltage indicator, ASAP1 (Accelerated Sensor of Action Potentials 1), as an example. The Tol2 kit and a ubiquitous zebrafish promoter, ubi, were chosen in this study. We also explain&#160;the processes of Gateway site-specific cloning, Tol2 transposon-based zebrafish transgenesis, and the imaging process for early-stage fish embryos and fish tumors using regular epifluorescent microscopes. Using this fish line, we found that there are cellular electric voltage changes during zebrafish embryogenesis, and fish larval movement. Furthermore, it was observed that in a few zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors, the tumor cells were generally polarized compared to the surrounding normal tissues.

Here, we show the process of creating a cellular electric voltage reporter zebrafish line to visualize embryonic development, movement, and fish tumor cells in vivo.

Visualisierung von zellulären elektrische Aktivität im frühen Zebrafish Embryos und Tumoren

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Entwicklungsbiologie

Verwendung von Zebrafischlarven für effiziente In-vivo-Tumorstudien

A Simple, Rapid, and Effective Method for Tumor Xenotransplantation Analysis in Transparent Zebrafish Embryos

In vivo studies of tumor behavior are a staple of cancer research; however, the use of mice presents significant challenges in cost and time. Here, we present larval zebrafish as a transplant model that has numerous advantages over murine models, including ease of handling, low expense, and short experimental duration. Moreover, the absence of an adaptive immune system during larval stages obviates the need to generate and use immunodeficient strains. While established protocols for xenotransplantation in zebrafish embryos exist, we present here an improved method involving embryo staging for faster transfer, survival analysis, and the use of flow cytometry to assess disease burden. Embryos are staged to facilitate rapid cell injection into the yolk of the larvae and cell marking to monitor the consistency of the injected cell bolus. After injection, embryo survival analysis is assessed up to 7 days post injection (dpi). Finally, disease burden is also assessed by marking transferred cells with a fluorescent protein and analysis by flow cytometry. Flow cytometry is enabled by a standardized method of preparing cell suspensions from zebrafish embryos, which could also be used in establishing the primary culture of zebrafish cells. In summary, the procedure described here allows a more rapid assessment of the behavior of tumor cells in vivo with larger numbers of animals per study arm and in a more cost-effective manner.

Autor im Rampenlicht: Weiterentwicklung von Krebstherapeutika mit Tumor-Xenotransplantation im Zebrafisch

We describe a protocol for xenotransplantation into the yolk of transparent zebrafish embryos that is optimized by a simple, rapid staging method. Post-injection analyses include survival and assessing the disease burden of xenotransplanted cells by flow cytometry.

Eine einfache, schnelle und effektive Methode zur Analyse der Tumor-Xenotransplantation in transparenten Zebrafischembryonen

In vivo studies of tumor behavior are a staple of cancer research; however, the use of mice presents significant challenges in cost and time. Here, we ...

Invasive Verhalten von menschlichen Brustkrebszellen in embryonalem Zebrabärbling

Zusammenfassung

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Testen des Vascular Invasive Fähigkeit von Krebszellen in Zebrabärbling (

Transplantation von Zebrafisch-pädiatrischen Hirntumoren in immune-kompetente Wirte für die Langzeitstudie von Tumorzellverhalten und Drug Response

In Vivo Bildgebung und Quantifizierung der Angiogenreaktion des Wirts bei Zebrafischtumor Xenografts

Arzneimittel-Screening von Primärpatienten abgeleitetTumor Xenografts in Zebrafischen

In Vivo Targeting von xenografierten menschlichen Krebszellen mit funktionalisierten fluoreszierenden Kieselsäure-Nanopartikeln in Zebrafischen

Generation von Zebrafischen Larval Xenografts und Tumorverhaltensanalyse

Zebrafisch-Modell der Neuroblastom-Metastasierung

Visualisierung von zellulären elektrische Aktivität im frühen Zebrafish Embryos und Tumoren

Eine einfache, schnelle und effektive Methode zur Analyse der Tumor-Xenotransplantation in transparenten Zebrafischembryonen

Eine einfache, schnelle und effektive Methode zur Analyse der Tumor-Xenotransplantation in transparenten Zebrafischembryonen