Dieses Protokoll ermöglicht es uns, Axon-Führungswege zu identifizieren, die im okulomotorischen Nerv aktiv sind, und ihre Rollen an verschiedenen Punkten entlang der Nervenbahn in Echtzeit zu bewerten. Diese Technik bewahrt die lokalen Umgebungen, durch die Axone reisen, und ihre endgültigen Ziele. Die wachsenden Axone werden nicht geschnitten, so dass das anfängliche Axonwachstum statt der Regeneration beurteilt werden kann.
Diese Methode bietet Einblicke in die Axonführung im Augenmotorsystem, könnte aber an die Untersuchung der Axonführung anderer Nerven angepasst werden. Diese Technik erfordert Übung zu meistern, und schnelles Arbeiten ist extrem wichtig. Wenn Sie es zum ersten Mal versuchen, verwenden Sie nur ein paar Embryonen, anstatt einen ganzen Wurf.
Vor Beginn des Eingriffs bestätigen Sie zunächst die Schwangerschaft durch Ultraschall am embryonalen Tag 10.5 aus einer zeitgesteuerten Paarung. Ernten Sie die Embryonen, sprühen Sie den Bauch der schwangeren Maus mit 70% Ethanol, und verwenden Sie eine Schere, um die Bauchhöhle zu öffnen, um die Gebärmutter zu extrahieren. Waschen Sie die Gebärmutter in einer Petrischale eiskalter HBSS, bevor Sie die Orgel in eine zweite Petrischale mit frischem eiskaltem HBSS legen.
Entfernen Sie im Rahmen eines Sezierens die Embryonen aus dem Gebärmutterhorn und ihren individuellen Fruchtwassersäcken, indem Sie jeden Embryo auf die Unterseite des Deckels einer 12-Well-Platte legen, auf Eis, während sie geerntet werden. Verwenden Sie Filterpapier, um jede Flüssigkeit, die jeden Embryo umgibt, zu entfernen, ohne die Embryonen selbst zu berühren, und tauchen Sie die Embryonen in flüssige 4%niedrigschmelzende Agarose ein. Legen Sie den Plattendeckel auf Eis, um die Agarose zu erstarren.
Wenn die Agarose verhärtet ist, die Embryonen umdrehen und die andere Seite jeder Probe mit zusätzlicher Agarose bedecken. Wenn das zweite Band von Agarose verfestigt ist, verwenden Sie ein Fluoreszenz-Sezieren-Mikroskop, um die Agarose um jeden Embryo zu trimmen, so dass jeder Embryo richtig auf der Vibratome-Stufe ausgerichtet wird. Die okulomotorischen Kerne und frühen Axonauswüchse sollten fluoreszierend sein.
Richten Sie jeden Embryo so aus, dass der Kern, die auswachsenden Axone und das Auge eine Linie bilden, und verwenden Sie eine Rasierklinge, um die Agarose parallel zu dieser Linie zu trimmen. Als nächstes füllen Sie die Vibratomkammer mit eiskaltem Scheibenpuffer und überkleben Sie den ersten Embryo in das Vibratomstadium, so dass die Klinge parallel zum okulomotorischen Kern und den Augen ist. Wenn der Superkleber trocken ist, tauchen Sie das Vibratomstadium unter, so dass der Embryo nach weg von der Klinge ausgerichtet ist, und verwenden Sie eine neue Vibratomklinge, um 400-bis 450-Mikrometer-Scheiben zu erhalten.
Verwenden Sie eine sterile Transferpipette, um jede Scheibe in den kalt geschnittenen Puffer zu übertragen, wie sie erworben wird, und verwenden Sie das Fluoreszenz-Sezierendes Mikroskop, um die Scheibe auszuwählen, die die okulomotorischen Kerne und Augen enthält. Mit einer sterilen Transferpipette die Scheibe auf einen Zellkultureinsatz in einer Sechs-Brunnen-Platte mit 1,5 MilliliterKulturmedium pro Brunnen übertragen und die Platte in einen 37-Grad-Celsius-Inkubator legen. Entfernen Sie die Rest-Agarose aus dem Vibratomstadium, und überkleben Sie den nächsten Embryo auf die Bühne, so dass weiterhin Scheiben gesammelt werden, bis alle Embryonen geschnitten und plattiert wurden.
Fügen Sie dann die entsprechende Konzentration des Inhibitors oder rekombinanten Moleküls von Interesse, in einem geeigneten Lösungsmittel verdünnt, auf das Medium jedes Brunnens. Erstellen Sie eine Dosis-Wirkungs-Kurve. Stellen Sie die Scheiben alle 30 Minuten nach Phasenkontrast und Fluoreszenzmikroskopie für bis zu 72 Stunden auf.
Während der normalen Entwicklung der Gebärmutter erreichen die ersten grünen fluoreszierenden proteinpositiven okulomotorischen Axone die Umlaufbahn am embryonalen Tag 11.5, bevor sie sich zu ihren endgültigen Zielen verzweigen, wie in dieser repräsentativen Scheibenkultur beobachtet. Die Ausrichtung der Scheibe auf der Vibram-Stufe ist entscheidend, da die Scheiben nicht interpretierbar sind, wenn sie nicht richtig ausgerichtet sind. Wenn der Embryo beispielsweise zur Seite geneigt ist, wird innerhalb der Scheibe nur ein okulomotorischer Kern beobachtet.
Wenn der eingebettete Embryo zu weit nach hinten geneigt ist, sind die Augen nicht innerhalb der Scheibe vorhanden, stattdessen können die obere Extremität und das Hinterhirn oder das Rückenmark einbezogen werden. Es ist auch wichtig, darauf zu achten, dass bei der Platzierung der Scheibe auf die Kulturmembran, dass das Gewebe nicht gefaltet wird. Achten Sie bei der Auflösung der Inhibitoren und Wachstumsfaktoren in organischen Lösungsmitteln.
In diesem Experiment starb die Scheibe beispielsweise nach Zugabe von Ethanol zum Medium. Denken Sie daran, alles auf Eis zu halten und die Zeit zwischen der Extraktion der Embryonen und der Platzierung der Scheiben im Brutkasten zu minimieren. Mit dieser Technik haben wir begonnen, zusätzliche Axon-Führungsmechanismen bei der Arbeit im Augenmotorsystem zu identifizieren.
Denken Sie daran, Vorsicht zu walten, wenn Sie mit Rasierklingen arbeiten und dass einige Inhibitoren gefährlich sein können und sorgfältig nach ihren Sicherheitsprofilen behandelt werden sollten.
