Этот протокол позволяет нам определить аксоновые пути, активные в окуломоторном нерве, и оценить их роль в разных точках по нервной траектории в режиме реального времени. Этот метод сохраняет местную среду, через которую проходят аксоны, и их конечные цели. Растущие аксоны не вырезаются, поэтому можно оценить начальный нарой аксон, а не регенерацию.
Этот метод дает представление о аксон руководство в глазной двигательной системы, но может быть адаптирована к изучению аксон руководство других нервов. Этот метод требует практики, чтобы освоить, и работать быстро чрезвычайно важно. При попытке его в первый раз, использовать только несколько эмбрионов, а не весь мусор.
Перед началом процедуры сначала подтвердите беременность ультразвуком на эмбриональный день 10.5 от таймингового спаривания. Урожай эмбрионов, спрей брюшной полости беременной мыши с 70% этанола, и использовать ножницы, чтобы открыть брюшную полость для извлечения матки. Вымойте матку в чашке Петри ледяной HBSS перед размещением органа во второй чашке Петри свежего ледяного HBSS.
Под рассечением области, удалить эмбрионы из рога матки и их отдельных амниотических мешков, поместив каждый эмбрион на нижней стороне крышки 12-хорошо пластины, на льду, как они собирают. Используйте фильтровальную бумагу, чтобы удалить любую жидкость, окружающую каждый эмбрион, не касаясь самих эмбрионов, и погрузить эмбрионы в жидкость 4%low-melting агарозу. Поместите крышку пластины на лед, чтобы затвердеть агарозу.
Когда агароза затвердеет, переверните эмбрионы и покройте другую сторону каждого образца дополнительной агарозой. Когда второй том агарозы затвердеет, используйте флуоресцентный рассеченный микроскоп, чтобы обрезать агарозу вокруг каждого эмбриона так, чтобы каждый эмбрион был правильно ориентирован на стадии вибромы. Ядра окуломотора и ранние нарости аксона должны быть флуоресцентными.
Выровнять каждый эмбрион так, что ядро, перерастает аксоны, и глаз образуют линию, и использовать лезвие бритвы, чтобы обрезать агарозу параллельно этой линии. Затем заполните вибромную камеру ледяным ломтиком буфера и скоулите первый эмбрион до вибромной стадии так, чтобы лезвие было параллельно окуломотору и глазам. Когда суперклей высохнет, погрузите вибромную стадию так, чтобы эмбрион был ориентирован лицом к лезвию, и используйте новое лезвие вибромы, чтобы получить 400-450-микрометровые ломтики.
Используйте стерильные пипетки передачи для передачи каждого ломтика в холодный нарезки буфера, как она приобрела, и использовать флуоресценции вскрытия микроскопа, чтобы выбрать ломтик, содержащий ядра окуломотора и глаза. Используя стерильную трубу передачи, перенесите срез на вставку клеточной культуры в шести-хорошо пластины, содержащей 1,5 миллилитров культуры среды на колодец, и поместите пластину в 37-градусный инкубатор по Цельсию. Удалите остаточную агарозу со стадии вибромы и вывемите следующий эмбрион на сцену, продолжая собирать ломтики до тех пор, пока все эмбрионы не будут разрезаны и потолкнулись.
Затем добавьте соответствующую концентрацию ингибитора или рекомбинантной молекулы интереса, разбавленной соответствующим растворителем, к среде каждой хорошо. Создайте кривую реакции дозы. Изображение ломтиков каждые 30 минут путем фазового контраста и флуоресценции микроскопии на срок до 72 часов.
Во время нормального развития матки, первые зеленые флуоресцентные протеин-положительные аксоны oculomotor достигают орбиты эмбриональным днем 11.5 перед разветвлением к их окончательным целям, как замечено в этой репрезентативной культуре ломтика. Ориентация ломтика на сцене виброма имеет решающее значение, так как ломтики не интерпретируются, если они не ориентированы должным образом. Например, если эмбрион наклонен в свою сторону, в срезе будет наблюдаться только одно ядро окуломотора.
Если встроенный эмбрион наклонен слишком далеко к спине, глаза не будут присутствовать в ломтике, и вместо этого верхние конечности и задний мозг или спинной мозг могут быть включены. Важно также позаботиться о том, чтобы во время размещения ломтика на мембрану культуры, что ткань не складывается. Позаботьтесь при растворении ингибиторов и факторов роста органических растворителей.
Например, в этом эксперименте, ломтик умер после добавления этанола в среду. Не забудьте держать все на льду и свести к минимуму время между извлечением эмбрионов и размещением ломтиков в инкубаторе. Используя этот метод, мы приступили к выявлению дополнительных механизмов наведения аксона на работе в глазной двигательной системе.
Не забудьте использовать осторожность при работе с лезвиями бритвы и что некоторые ингибиторы могут быть опасными и должны быть обработаны тщательно в соответствии с их профилями безопасности.
