Unser Protokoll kann verwendet werden, um hochwertige exosomenangereicherte extrazelluläre Vesikel aus embryonalen Stammzellen herzustellen, die den immunstimulierenden Faktor GM-CSF exprimieren. Exosomenangereicherte extrazelluläre Vesikel, die GM-CSF tragen, haben das Potenzial, zellfreie immunregulatorische Vesikel zu bedienen, die die Immunantwort modulieren können. Forscher mit der grundlegenden molekular- und zellbiologischen Ausbildung, sollten in der Lage sein, wie dieses Protokoll leicht zu tun, aber jeder, der dieses Protokoll zum ersten Mal durchführt, sollte die Anweisungen genau befolgen.
Da unser Protokoll kompliziert ist, wird die Visualisierung der komplizierten Details jedes Schritts anderen Forschern helfen, exosomenfreies FBS zu erzeugen, das gewünschte Volumen von FBS ultrazentrifugieren und den exosomenfreien Überstand zu sammeln. Bevor Sie die drei ESD-Zellen plattieren, beschichten Sie 15 Zentimeter Gewebekulturschalen mit 0,1% Gelatine bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Gelatine durch Aspiration entfernen und die ESD drei Zellen ohne Feederschicht Zellen in ESD drei Zellkulturmedium bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid befeuchteten Inkubator bis die Zellen 90% Konfluenz erreichen.
Waschen Sie die fast konfluenten Kulturen mit fünf Millilitern 0,05% Trypsin pro Gericht, gefolgt von einer fünfminütigen Inkubation bei 37 Grad Celsius in frischem Trypsin. Am Ende der Inkubation die abgelösten Zellen in einem Zentrifugenröhrchen ziehen und das Trypsin mit fünf Millilitern frischem Kulturmedium inaktivieren. Sedimentieren Sie die Zellen durch Zentrifugation und suspendieren Sie die Paletten in frischem Medium zum Zählen zum Zählen Für das Passieren, Platte fünfmal 10 bis zum sechsten der ESD drei Zellen in 15 Milliliter Zellkulturmedium auf neue Gelatine beschichtete Platten für drei Tage der Kultur vor der Subkulturierung der Zellen Sammeln Sie den Zellkulturüberstand für die Isolierung von exosomen angereicherten extrazellulären Vesikeln Platte einmal 10 bis die siebte ESD drei Zellen in 15 Milliliter Zellkulturmedium pro neuer gelatinebeschichteter Platte für drei Tage vor dem Sammeln der Zellkulturüberstände Für die exosomenangereicherte extrazelluläre Vesikelisolierung sedimentieren Sie zunächst die großen Zellfragmente innerhalb der Überstände, die aus 72 Stunden kultivierten ESD-Dreizellen durch Zentrifugation gesammelt wurden.
Nachdem Sie den Überstand gesammelt haben, ultrazentrifugen Sie die Proben und entsorgen Sie die Überstände. Spülen Sie jede Palette vorsichtig zweimal mit einem Milliliter PBS pro Waschgang ab, um restinterne Kulturüberstände zu entfernen und den Gehalt an exosomenangereichertem extrazellulärem Vesikelprotein gemäß den Anweisungen des Herstellers mit einem Bicinchoninsäure-Assay zu quantifizieren. Dann suspendieren Sie die mit Exosomen angereicherten extrazellulären Vesikel in PBS in einer Konzentration von sechs Mikrogramm pro Mikrometer zur Lagerung bei minus 80 Grad Celsius.
Zur Visualisierung der exosomenangereicherten extrazellulären Vesikel durch Transmissionselektronenmikroskopie fixieren Sie drei bis fünf Mikrogramm pro Milliliter der extrazellulären Vesikel mit der Endkonzentration von 2% Elektronenmikroskopgitterparaformaldehyd bei Raumtemperatur für zwei Stunden. Am Ende der Inkubation 10 Mikroliter der festen Proben für eine Minute auf Kupfergitter mit Kohlenstoffträgerfolie laden, bevor Sie die Gitter mit Filterpapier entleeren, mit einer geeigneten Färbelösung gemäß dem Protokoll des Herstellers in den Gittern bleiben und mit einer Pinzette die Gitter auf ein Stück Filterpapier übertragen. Verwenden Sie dann das Transmissionselektronenmikroskop mit einer 50.000-fachen Vergrößerung, um elektronenmikroskopische Bilder gemäß den Standardprotokollen zu erhalten. Um Ganzzellextrakte herzustellen, sammeln Sie wie gezeigt drei ESD-Zellen aus der Kultur und suspendieren Sie die geernteten Zellen in PBS zum Zählen erneut.
Nach einer zweiten Zentrifugation suspendieren Sie die Zellen aus fünf mal 10 bis zu den dritten Zellen pro Mikroliter SDS-Seitenladepuffer mit 0,5% SDS-Konzentration erneut und beschallen die Proben für 10 Sekunden auf einem Sonicator mit einer Amplitude von 10%. Anschließend die Proben fünf Minuten lang bei 100 Grad Celsius erhitzen. Um Lysate für die mit Exosomen angereicherten extrazellulären Vesikel vorzubereiten, suspendieren Sie die mit Exosomen angereicherten extrazellulären Vesikel in einem SDS-Seitenladepuffer mit 0,5% SDS bei einer Konzentration von 1,2 Mikrogramm pro Mikroliter erneut und beschallen Sie die Proben für 10 Sekunden, wie gezeigt, und erhitzen Sie die Proben dann fünf Minuten lang bei 100 Grad Celsius.
Laden Sie für die Western Blot-Analyse 10 Mikroliter Großhandelsextrakt und exosomenangereicherte extrazelluläre Vesikellysatproben in einzelne Wells eines besten Stressseitengels. Am Ende des Laufs übertragen Sie die Proteine auf PVDF-Membranen und inkubieren die Membranen mit den entsprechenden primären und sekundären Antikörpern von Interesse, dann erkennen Sie die Proteinexpression mit einem verbesserten Chemilumineszenz-Erkennungskit, gemäß den Anweisungen des Herstellers. Um die Menge an GM-CSF in exosomenangereicherten extrazellulären Vesikeln zu bewerten, verwenden Sie ein Kit Murine GM-CSF, um eine ELISA-Platte mit Anti-GM-CSF-Capture-Antikörpern zu beschichten, behandeln Sie 0,6 Mikrogramm exosomenangereicherte extrazelluläre Vesikelproben mit 100 Mikrolitern PBS allein oder PBS plus 0,05% Tween 20 bei Raumtemperatur für 30 Minuten.
Am Ende der Inkubation werden die behandelten Proben zu einzelnen Vertiefungen der vorbereiteten ELISA-Platte für eine einstündige Inkubation bei Raumtemperatur gegeben, gefolgt von einem Waschen der entsprechenden entsprechenden Vertiefungen mit PBS allein oder PBS plus 0,05% tween 20. Nach dem Waschen fügen Sie den Nachweisantikörper den Proben für eine einstündige Inkubation bei Raumtemperatur hinzu, gefolgt von einer Wäsche mit PBS allein oder PBS plus 0,05% Tween 20, wie gezeigt, dann fügen Sie Avidin Meerrettichperoxidase zu den Proben für eine 30-minütige Inkubation bei Raumtemperatur hinzu, gefolgt von einer Wäsche und Messen der Absorption in jeder Vertiefung auf einem Microplate Reader bei 450 Nanometern. Die GFP-Fluoreszenzintensität einer GM-CSF-exprimierenden ESD-Drei-Zell-Linie oder einer ESD-Drei-Zell-Linie, die einen leeren Vektor exprimiert, ist viel höher als die ihrer elterlichen Gegenstücke.
ELISA zeigt, dass drei ESD-Zellen, die GM-CSF exprimieren, deutlich höhere GMCSF-Spiegel in ihrem Zellkulturüberstand produzieren als leere Vektorkontrollzellen. Darüber hinaus ist die Menge an GM-CSF, die durch GM-CSF-exprimierende DREI-Zellen erzeugt wird, ähnlich der von STO-Fibroblasten, die GM-CSF exprimieren. Die Transmissionselektronenmikroskopie extrazellulärer Vesikel, die aus vektortransduzierten und GM-CSF-transduzierten Zellkulturen isoliert wurden, zeigt Vesikel unterschiedlicher Größe, die innerhalb des erwarteten Durchmesserbereichs von 30 bis 100 Nanometern liegen.
Die Expression exosomaler Marker, einschließlich CD81, Annexin V und Flotillin-1, ist in extrazellulären Vesikeln, die aus drei ESD-Zellen isoliert wurden, im Vergleich zu entsprechenden Großhandelsextrakten durch Western-Blot-Analyse deutlich erhöht. Wichtig ist, dass das Vorhandensein anderer subzellulärer Kompartimentmarker in ESD drei abgeleiteten extrazellulären Vesikeln nicht nachgewiesen wurde, einschließlich des endoplasmatischen Retikulummarkers, der Proteindisulfidisomerase, der mitochondrialen Marker, des Cytochrom C- und Oxphos-Komplexes IV-Untereinheit IV und des zytosolischen Markers GAPDH. Nach dem Waschen mit 0,05% Tween 20 wurden die in den extrazellulären Kontrollvesikeln festgestellten GM-CSF-Spiegel im Hintergrund signifikant reduziert.
Im Gegensatz dazu waren die GM-CSF-Spiegel in den extrazellulären Vesikeln von GM-CSF-exprimierenden Zellen signifikant um Tween 20 erhöht. Der Erwerb hochwertiger exosomenangereicherter extrazellulärer Vesikel, die GMCSF tragen, ist der wichtigste Schritt für den Erfolg dieses Protokolls. Forscher können zusätzliche Experimente durchführen, z. B. Studien an GM-CSF-abhängigen Zelllinien und Tieren, um festzustellen, ob exosomenangereicherte extrazelluläre Vesikel, die GM-CSF pflegen, als zellfreie immunregulatorische Vesikel fungieren können.
Diese mit Exosomen angereicherten extrazellulären Vesikel können dann verwendet werden, um zu untersuchen, wie sich die Modulation der Immunantwort auf verschiedene Krankheitszustände auswirkt.
