Dieses Protokoll bietet ein hochwirksames bakterielles Anzeigesystem zur Isolierung neuartiger Varianten von BirA, das eine spezifische Biotinylierung nativer Proteine ermöglicht. Der Hauptvorteil der Technik ist, dass sie BirA-Varianten mit hoher Affinität Streptavidin-Auswahl auswählt. Dadurch wird sichergestellt, dass inaktive Klone entfernt werden, wodurch ein hocheffizienter Auswahlprozess entsteht.
Um in einem Plasmid-Editor zu beginnen, entwerfen Sie die Vorwärts-Primer so, dass sie die letzten 30 Nukleotide der umgekehrten Komplementierung der Peptid-Codierungssequenz einschließt, und fügen Sie die Plasmidbindungsnukleotidsequenz zu ihrem Fünf-Primat-Ende hinzu. Entwerfen Sie die Reverse Primer so, dass sie die ersten 30 Nukleotide der umgekehrten Komplementierung der Peptid-Codierungssequenz enthält, und fügen Sie die Plasmidbindungsnukleotidsequenz zu ihrem Fünf-Primat-Ende hinzu. Um dann eine 20-Mikroliter-PCR-Reaktion einzurichten, fügen Sie die Reagenzien in eine dünnwandige PCR-Röhre ein.
Übertragen Sie das Rohr auf einen thermischen Cycler, und führen Sie PCR gemäß dem Manuskript durch. Führen Sie als nächstes fünf Mikroliter der PCR-Reaktion auf einem 1%Agarose-Gel aus, um die Amplifikation eines PCR-Produkts mit sechs Kilobase zu bestätigen, und fahren Sie entsprechend dem Manuskript fort. Um nun die mutierten Megaprimer mit BirA-Hexahistidin vorwärts und Reverse Primer in einer PCR-Röhre zu synthetisieren, fügen Sie ein Nanogramm pBAD-BirA-eCPX mit der vorbereiteten Zielpeptidsequenz als Vorlage hinzu.
Richten Sie 35 PCR-Zyklen mit einer Glühtemperatur von 60 Grad Celsius nach Herstelleranweisung ein. Führen Sie dann fünf Mikroliter der Amplifikationsreaktion auf einem 1%Agarose-Gel aus, um die Amplifikation eines PCR-Produkts mit 984 Basen zu überprüfen. Reinigen Sie das PCR-Produkt von den verbleibenden 45 Mikrolitern der Amplifikationsreaktion mit einem kommerziellen PCR-Reinigungskit und verwenden Sie ein Spektralphotometer, um die DNA-Ausbeute zu quantitieren.
In einem dünnwandigen PCR-Rohr die Reagenzien in die vorbereiteten mutierten Megaprimer geben, um die Probenreaktion vorzubereiten. Übertragen Sie das Reaktionsgemisch auf einen thermischen Cycler, und führen Sie die PCR gemäß dem Manuskript aus. Die Verstärkungsreaktion bei vier Grad Celsius oder auf Eis lagern.
Als nächstes fügen Sie einen Mikroliter Dpn1-Restriktionsenzym direkt in die Amplifikationsreaktion ein und mischen Sie sie vorsichtig. Drehen Sie die Reaktionsmischung herunter und brüten Sie zwei Stunden bei 37 Grad Celsius. Nach zwei Stunden transformieren Sie T7 Express lysY/Iq kompetente E.coli-Zellen in eine Röhre mit zwei Mikrolitern der Dpn1-Reaktion.
Zunächst impfen Sie 100 Milliliter LB mit 1% Glukose und 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin mit einem Milliliter BirA-Bibliothek, und inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius mit Schütteln bei 200 U/min. Dann impfen Sie fünf Milliliter LB mit 1% Glukose und 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin mit 100 Mikrolitern der Nachtkultur. Inkubieren Sie für zwei Stunden und 30 Minuten oder bis die Kultur eine OD600 von etwa 0,5 erreicht.
Als nächstes induzieren Sie eCPX- und BirA-Expression mit 0,2% Volumengewicht L-Arabinose, 100-Mikromolar IPTG und 100-Mikromolar-Biotin. Schütteln Sie die Kultur bei 200 Umdrehungen pro Minute für eine Stunde bei 37 Grad Celsius. Zentrifugieren Sie die Kultur für 10 Minuten bei 5.000 mal g, und entfernen Sie den Überstand.
Setzen Sie die Zellen in einem Milliliter eiskaltem PBS und zentrifugieren Sie fünf Minuten lang 5000 mal g. Entsorgen Sie den Überstand, und setzen Sie die Zellen in 400 Mikrolitere eiskaltes PBS wieder aus, und speichern Sie Zellen auf Eis. Übertragen Sie dann 10 Mikroliter der resuspendierten Zellen in einen 1,5-Milliliter-Rohr mit beschrifteter Eingabe.
Auf Eis aufbewahren. Als nächstes waschen Sie 20 Mikroliter Streptavidin-Magnetperlen in einem Milliliter eiskaltem PBS in einem Rohr, und legen Sie das Rohr zwei Minuten lang in einen magnetischen Partikelabscheider auf der Bank und entfernen Sie vorsichtig den Überstand. Setzen Sie die Streptavidin-Magnetperlen in 20 Mikrolitere eiskaltem PBS aus und übertragen Sie die Perlenlösung auf die zuvor hergestellten 390 Mikroliter resuspendierter Zellen.
Mischen Sie durch sanftePipettierung. Dann für 30 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren. Legen Sie eine Säule mit ferromagnetischen Kugeln in einen magnetischen Partikelabscheider und waschen Sie sie mit fünf Millilitern eiskaltem PBS.
Übertragen Sie die Zellen und Streptavidin-Magnetperlen aus dem Rohr in die im Separator befestigte Säule. Sobald das Säulenreservoir leer ist, waschen Sie die Säule mit einem Gesamtvolumen von fünf Millilitern eiskaltem PBS bei 500 Mikrolitern pro Mal. Entfernen Sie danach die Säule aus dem Trennzeichen, und legen Sie sie in ein 1,5-Milliliter-Rohr.
Einen Milliliter des eiskalten PBS auf die Säule pfeifen und mit dem Kolben die magnetisch beschrifteten Zellen entkernen. Dann legen Sie das 1,5-Milliliter-Rohr in einen Tischabscheider und waschen Sie die magnetisch beschriftete Zelle mit einem Milliliter eiskaltem PBS. Die magnetisch beschrifteten Zellen in einem Milliliter des eiskalten PBS vorsichtig wieder aufhängen.
Übertragen Sie 10 Mikroliter der Resuspension in eine 1,5-Milliliter-Röhre mit der Bezeichnung Ausgang. Impfen Sie 100 Milliliter LB mit 1% Glukose und 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin mit den magnetisch markierten Zellen und inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius mit Schütteln bei 200 U/min. Am nächsten Tag 10 Milliliter der Übernachtungskultur in LB mit Glycerin zu einer Endkonzentration von 15% kombinieren und bei minus 80 Grad Celsius lagern, um Gefriervorräte herzustellen.
Verwenden Sie 100 Mikroliter der Übernachtungskultur für die nächste Auswahlrunde. Fügen Sie nun 990 Mikroliter eiskaltes PBS zu den Eingangs- und Ausgangsproben hinzu, und beschriften Sie den Röhreneingang 10 auf die Minus zwei und den Ausgang 10 zu den Minus zwei. Machen Sie 10-fache serielle Verdünnungen der beiden Proben in eiskaltem PBS, bis eine endgültige Verdünnung von 10 auf minus 10 in der Eingangsstichprobe und 10 auf die minus vier in der Ausgangsstichprobe erreicht ist.
Platte 100 Mikroliter proben vom Eingang 10 bis minus sechs, Eingang 10 bis minus acht, Eingang 10 bis minus 10, Ausgang 10 bis minus zwei, Ausgang 10 bis minus drei und Ausgang 10 bis minus vier auf einzelnen LB-Ampicillinplatten und über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren. Am Morgen zählen Sie die Anzahl der Kolonien auf den Platten mit klar getrennten Kolonien. Multiplizieren Sie die Koloniezahl mit dem Verdünnungsfaktor, um die bakterielle Konzentrationszahl pro 100 Mikroliter zu erhalten.
In diesem Protokoll wurde nach der Generierung einer zufällig mutierten Bibliothek von BirA-Varianten BirA- und eCPX-AP-Expression induziert. Bakterien wurden mit Affinitätsreagenz inkubiert, ungebundene Bakterien verworfen und ausgewählte Bakterien verstärkt. Western Blot von pBAD-BirA-eCPX-AP exemitten Bakterien produzierten ein 22-Kilodalton-Streptavidin-reagierendes Band, das mit dem Molekulargewicht von eCPX in nicht induzierten und induzierten Kulturen übereinstimmt.
Sie waren jedoch nicht in BirA Hexahistidin vorhanden. Die starke Oberflächenbiotinylierung in den eCPX-AP-exemitzenten Bakterien verursachte eine Aggregation nach Zugabe von Streptavidin-Magnetperlen und die Bildung eines Pellets am Boden des Rohres, das mit eCPX mit Lysin zu Alaninmutationsexpressionsbakterien nicht beobachtet wurde. Die Analyse des Niederschlags aus dem Streptavidin-Pulldown zeigte ein klares 22-Kilodalton-Streptavidin-reagierendes und Antihexahistidinband in den Proben aus eCPX-AP-Kulturen, aber nicht eCPX-AP mit Lysin zu Alaninmutationskulturen.
In ähnlicher Weise war die Anzahl der Bakterien, die an die Streptavidin-Perlen gebunden waren, im eCPX-AP signifikant höher als bei eCPX-AP-Lysin zu Alaninmutationskulturen. Der wichtigste Schritt ist ein strenges Waschen von Streptavidin-gebundenen Bakterien. Eine strenge Waschung stellt sicher, dass nur Bakterien mit oberflächenangezeigtem Biotin ausgewählt werden.
Sobald eine klare Anreicherung von Bakterien beobachtet ist, können die isolierten Klone weiter mutiert werden und entwickeln dadurch hochaktive BirA-Varianten, die eine spezifische Biotinylierung einheimischer Proteine ermöglichen.
