Wir danken Francisco Candal, CDC Technology Transfer Office, Atlanta Georgia für HBEC-5i-Zellen. Diese Arbeit wurde von den Wellcome Trust (4 Jahre Doktorandenstelle an AC-und Senior Fellowship in Basic Biomedical Science to JAR, Grant-Nummer 084226) gefördert.

Allgemeine Empfehlungen Menschliches Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen (HBEC-5i) Kultur wurde bereits in 6 beschrieben, 8. P. falciparum Parasiten wurden in 9 kultiviert. Beide HBEC-5i und P. falciparum Parasiten Kulturen sollten in sterile Bedingungen zu jeder Zeit eingehalten werden. Alle Reagenzien sollten bei 37 ° C vorgewärmt werden Wir empfehlen, regelmäßig auf Mykoplasmen-Kontaminationen 10 durch PCR (Minevera Biolabs, folgt den Anweisungen des Herstellers) zu überprüfen. Das Protokoll ist in Abbildung 1 zusammengefasst. 1. Endothelzellen Routine Kultur <ol><li> Bereiten Sie die notwendigen Reagenzien. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Medium zur Vorbereitung </td><td> Reagenzien </td><td> Menge </td></tr><tr><td> &quot;DMEM unvollständig&quot; </td><td> DMEM-F12 Ham </td><td> 500ml </td></tr><tr><td> &amp;nbsp; </td><td> L-Glutamin 200 mM </td><td> 5ml </td></tr><tr><td></td><td> Penicillin / Streptomycin 100X </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td></td><td> NaOH 1M </td><td> 1,3 ml (pH-Wert auf 7,4) </td></tr><tr><td> &quot;DMEM complete&quot; </td><td> &quot;DMEM unvollständig&quot; </td><td> 450ml </td></tr><tr><td></td><td> Fetale Bovine Serum hitzeinaktiviertem </td><td> 50ml </td></tr><tr><td></td><td> Endothelzellwachstum ergänzen </td><td> 5 ml </td></tr></tbody></table> <ol start="2"><li> Kultur HBEC-5i in einem belüfteten 25cm 2-Kolben mit 10ml DMEM Vollmedium in einem 37 ° C Inkubator mit 5% CO 2. </li><li> Passage-Zellen, wenn sie konfluent geworden. Entfernen Sie das alte Medium abgesaugt und waschen zweimal mit DMEM unvollständige mittel-oder Gewebekulturen grade PBS (Ca 2 + und Mg 2 + frei) bis 37 vorgewärmten ° C. </li><li> Add 1 ml vorgewärmten VersuchenPSIN-EDTA (0,025% Trypsin, 0,5 mM EDTA), schwenken, um die Gesamtheit der Kolben abdecken und inkubieren ~ 2 min bei 37 ° C. </li><li> Überprüfen Sie unter inversen Mikroskop, dass mindestens 90% der Zellen wurden abgelöst. Wenn nötig, vorsichtig klopfen den Boden des Kolbens auf adhärente Zellen zu entfernen. Fügen Sie 10 ml DMEM Vollmedium, um das Trypsin und Transfer Zellen in eine 15 ml konische Röhrchen zu blockieren. Zentrifuge für 4 min bei 300 g bei Raumtemperatur (RT). </li><li> Überstand verwerfen und das Pellet mit 10 ml DMEM Vollmedium. Pipette die Lösung nach oben und unten gründlich resuspendieren. </li><li> Fügen Sie 1 oder 2 ml der Zellsuspension in eine neue Kultur einwiegen und 8ml frischem Medium, um die Kultur aufrecht zu erhalten. Bewerten Kultur Wachstum jeden Tag unter einem inversen Mikroskop und ändern Medium alle 2 oder 3 Tage, bevor es gelb wird. </li></ol> 2. Vorbereitung Endothelzellen für eine Auswahl <ol><li> Zwei Tage vor dem Tag der selectio<html> n, fügen Fibronektin in sterile PBS (2 g / cm 2) in einem (oder mehreren) 60 mm Petrischale verdünnt. Inkubieren Sie die Schale für 5 bis 20 min bei 37 ° C, dann entfernen Sie die Fibronektin-Lösung, die bei 4 ° C für einen Monat gespeichert werden und wieder einmal verwendet. </li><li> Passage-Zellen wie in den Abschnitten 1.3 beschrieben. bis 1,5. Unter der Annahme, 100% konfluenten Zellen getrennt wurden und erneut in 10ml DMEM Vollmedium (Abschnitt 1.6., Mit einem äquivalenten Volumen Medium resuspendieren, wenn der Konfluenz niedriger ist, z. B. mit 8ml resuspendieren, wenn der Konfluenz betrug 80%), fügen Sie 1,5 ml der suspendierten Zellen, die Fibronektin beschichtete Petrischale und anderen 1,5 ml DMEM Vollmedium. </li><li> Legen Sie die Samen Petrischale in den Brutschrank. Hinweis: Im Idealfall sollte die Konfluenz werden rund 90% zum Zeitpunkt der Auswahl zwei Tage später. </li><li> Optional. So aktivieren Sie HBEC-5i, fügen Sie die TNF (Tumor Nekrose Faktor) Zytokin in einer Endkonzentration von 50μg/ml 24 Stunden vor der Wahl. </li></ol>e_title &quot;&gt; 3. Plasmodium falciparum Routine Kultur <ol><li> Bereiten Sie die notwendigen Reagenzien (siehe Tabelle hier unter). Bereiten menschlichen roten Blutzellen (RBC) durch die Trennung von Vollblut (Gruppe O +) beim Durchgang durch ein Leukozytendepletionsfilter (siehe &quot;Methoden in Malaria Research&quot; Publikation 11 für allgemeine Malaria-Parasiten Kultivierung). Wash RBC zweimal durch Zentrifugieren bei 400 g für 5 min und Resuspendieren sie mit 10 ml RPMI unvollständig. Keep gewaschen RBC bei 4 ° C zu einer unvollständigen Medium bei 50% Hämatokrit. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Medium zur Vorbereitung </td><td> Reagenzien </td><td> Menge </td></tr><tr><td> &quot;RPMI unvollständig&quot; </td><td> RPMI 1640 (mit Bicarbonat) </td><td> 500ml </td></tr><tr><td></td><td> Hepes 1M </td><td> 12.5ml </td></tr><tr><td></td><td> Glucose 20% </td><td> 5ml </td></tr><tr><td></td&gt; <td> L-Glutamin 200 mM </td><td> 5ml </td></tr><tr><td></td><td> Gentamycin 50mg/ml </td><td> 250μl </td></tr><tr><td></td><td> NaOH 1M </td><td> 0,7 ml (pH-Wert auf 7,2) </td></tr><tr><td> &quot;RPMI komplett&quot; </td><td> &quot;RPMI unvollständig&quot; </td><td> 450ml </td></tr><tr><td></td><td> Pooled Menschen (nicht-immunen) Serum </td><td> 50ml </td></tr></tbody></table> <ol start="2"><li> Kultur P. falciparum infiziert RBC mit RPMI Vollmedium mit 2% Hämatokrit und bei 37 ° C mit 3% CO 2, 1% O 2, und 96% N 2. Machen Giemsa Abstrich 11 tägliche auf die Stufe der Entwicklung des Parasiten (Abbildung 2) zu beurteilen. </li><li> Regelmäßig (ca. einmal pro Woche) zu synchronisieren Kultur durch Sorbit Behandlung 12. Am Tag vor der Wahl Assay Ziel für einen Ring-Bühne Kultur bei 5% Parasitämie oder mehr (im Idealfall mindestens 10%). </li></ol> 4. Auswahl von P. falciparum für cytoadhesion an Endothelzellen <ol><li> Am Tag des Tests sollte der Parasit Kultur pigmentierte Trophozoiten Stufe (Abbildung 2) (im Idealfall 10% Parasitämie), während HBEC-5i Kultur sollte bei 50 bis 100% Konfluenz (im Idealfall 90%). 30μl Hämatokrits von Parasiten Kultur pro HBEC-5i Petrischale benötigt. </li><li> Wash Parasiten zweimal durch Zentrifugieren (500 g für 5 min) 1,5 ml der Parasit Kultur. Überstand und resuspendieren mit 10 ml frisch zubereitet, erwärmt, DMEM unvollständige Medium. Wiederholen Sie die Wäsche ein zweites Mal. Resuspendieren 30μl Hämatokrits mit 1,5 ml DMEM unvollständig mit 1% BSA. </li><li> Waschen Sie die HBEC-5i beschichtete Petrischale zweimal Absaugen Medium und das Hinzufügen von 3 ml DMEM unvollständig. </li><li> Fügen Sie die Lösung von Parasiten, die HBEC-5i Gericht und bei 37 ° C für 75min. Resuspendieren Parasiten zweimal (nach 30 und 60 min) während der Inkubationdurch vorsichtiges Schwenken der Schale in die vier Richtungen, sowie im Uhrzeigersinn und gegen den Uhrzeigersinn. </li><li> Nach der Inkubation der Schale 5-mal durch Absaugen Medium, mit einem Kunststoff-Pasteurpipette bis 3 ml warmem DMEM unvollständige mittlere und sanfte Schaukeln hinzuzufügen. Wenn viele Gerichte benutzt werden, halten sie an einem warmen Oberfläche, wie eine große Flasche mit Wasser bei 37 ° C gefüllt </li><li> Überprüfen Sie die Teller unter einem inversen Mikroskop. Wenn viele infizierte RBC noch sichtbar sind, nicht mehr wäscht, wie oben beschrieben. Handle der Petrischale sehr sorgfältig, um das Risiko einer Kontamination zu vermeiden. </li><li> Entfernen Sie Medium aus der Schüssel und fügen 3ml warmes RPMI Vollmedium mit 40 ul Hämatokrits von frischen uRBC. </li><li> Die Schale in einer luftdichten Kammer inkubiert, Gas für 3 min und Ort der Kammer in einem Brutschrank bei 37 ° C über Nacht. </li><li> Am Tag danach Ernte der Parasiten durch Waschen mit RPMI unvollständige Medium, in ähnlicher Weise wie in Abschnitt 4.4 beschrieben. aber stärker. Keep alle verwendeten Medium (mit resuspendiert RBC) in einer 15 ml konische Röhrchen. Überprüfen Sie unter inversen Mikroskop, dass alle RBC aus der Schale entfernt worden sind. </li><li> Pellet der Parasiten, den Überstand verwerfen, in 5ml RPMI Vollmedium und legen Sie die Mischung in einer Flasche für die normale Züchtung resuspendieren. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Nicht ausgewählte Parasiten zeigen eine geringe Bindung an HBEC-5i (Abbildung 3A). So wird nach der ersten Runde der Auswahl wird nur sehr wenige Parasiten geerntet und es kann bis zu einem Monat der Kultivierung einer Parasitämie ausreichend für die zweite Auswahlrunde erreichen. Nach jeder Runde der Selektion, binden mehr und mehr Parasiten auf die Endothelzellen und die Auswahl kann in kürzeren Zeitabständen wiederholt werden. Nach 4-5 Runden der Selektion, sind High-Bindung Parasitenpopulation erhalten (Abbildung 3). In unseren Händen, wurde die Bindung von HB3-HBEC zu HBEC-5i oder TNF aktiviert HBEC-5i von simIlar Ebene (Daten nicht gezeigt). Die hier beschriebene Protokoll wurde mit 4 P. getestet falciparum-Stämme: HB3, IT/FCR3, 3D7 und Dd2 (Tabelle 1). Nur die letztere erwies sich nicht in der Lage zu HBEC-5i zu binden, auch nach 5 Runden der Selektion. HB3 Parasiten wurden auch für cytoadherence Human Dermal und pulmonale mikrovaskuläre Endothelzellen (HDMEC und HPMEC) ausgewählt. Nach 4 Runden der Selektion, mit der hier beschriebenen Methode wurde eine High-Bindung der Bevölkerung auf beiden HDMEC und HPMEC (Abbildung 4). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3122/3122fig1.jpg" /> Abbildung 1. Überblick über den Auswahlprozess. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3122/3122fig2.jpg" /> Abbildung 2. Entwicklungsstadien von P. falciparum infiziert rote Blutkörperchen. Giemsa-Abstrich unter dem Mikroskop sichtbar zu 1000x Vergrößerung. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3122/3122fig3.jpg" /> Abbildung 3. Typisches Beispiel von Parasiten Bindung an HBEC-5i. (A) Die blaue Schicht ist HBEC-5i fixiert mit Glutaraldehyd und mit Giemsa, visualisiert unter dem Mikroskop bei 1000facher Vergrößerung. Die Bilder wurden aufgenommen, nachdem uRBC und ungebundenen iRBC weggespült wurden. Die linke Tafel zeigt ein einzelnes P. falciparum HB3 (nicht ausgewählt) Parasit HBEC-5i gebunden. Im rechten Bereich der HB3-HBEC Parasiten hatten für 5 Runden ausgewählt worden. (B) Daten stellt den Mittelwert aus zwei unabhängigen Experimenten, die jeweils doppelt durchgeführt. Die Zahl der Parasiten pro Endothelzellen gebunden wurde gezählt. <img alt="Tabelle 1" src="/files/ftp_upload/3122/3122table1.jpg" /> Tabelle 1. Zusammenfassung von Plasmodium falciparum-Stämme, die erfolgreich für die Bindung an HBEC-5i. Beachten Sie, dass HB3 auch auf TNF-aktivierten HB ausgewählt wurden ausgewähltEC-5i. Nach 5 Runden der Selektion zeigten die Dd2 Belastung keine Zunahme der Bindung an HBEC-5i im Vergleich zu unselektierten-Dd2. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3122/3122fig4.jpg" /> Abbildung 4. Bindung von P. falciparum HB3 Parasiten dermal (HDMEC) und Lungenembolien (HPMEC) Endothelzellen, vor und nach 4 Runden der Selektion. Obwohl der Nährboden für HDMEC und HPMEC leicht unterscheidet (siehe Anweisungen des Herstellers), wurde das Protokoll für die Auswahl identisch mit HBEC-5i. Pictures at 400-facher Vergrößerung aufgenommen. <table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> DMEM-F12 Ham </td><td> Sigma </td><td> D6421 </td><td> Für DMEM Vollmedium </td></tr><tr><td> L-Glutamin 200 mM </td><td>GIBCO </td><td> 25030 </td><td> Für DMEM und RPMI Vollmedium </td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin 100X (10000 units / ml und 10mg/ml) </td><td> ScienCell </td><td> 0503 </td><td> Für DMEM Vollmedium </td></tr><tr><td> Fetale Bovine Serum hitzeinaktiviertem </td><td> ScienCell </td><td> 0025 </td><td> Für DMEM Vollmedium </td></tr><tr><td> Trypsin-EDTA (0,025% Trypsin, 0,5 mM EDTA) </td><td> ScienCell </td><td> 0103 </td><td></td></tr><tr><td> Endothelzellwachstum ergänzen </td><td> ScienCell </td><td> 1052 </td><td> Für DMEM Vollmedium </td></tr><tr><td> Gewebekultur behandelt 60 mm X 15 mm Petrischalen </td><td> BD </td><td> 353002 </td><td></td></tr><tr><td> Humanem Fibronectin </td><td> Millipore </td><td> FC010 </td><td> Verwenden Sie bei 2 g / cm 2 </td></tr><tr><td> TNF </td><td> R &amp;D Systems </td><td> 210-TA </td><td> optional, bei 50 pg / ml Einsatz </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Lonza </td><td> BE12-167f </td><td> Für RPMI Vollmedium </td></tr><tr><td> Gentamycin 50mg/ml </td><td> Lonza </td><td> 17-518Z </td><td> Für RPMI Vollmedium </td></tr><tr><td> Hepes 1M </td><td> Lonza </td><td> BE17-737E </td><td> Für RPMI Vollmedium </td></tr><tr><td> HDMEC </td><td> ScienCell </td><td> 2000 </td><td> Primary-Zelllinie </td></tr><tr><td> HPMEC </td><td> ScienCell </td><td> 3000 </td><td> Primary-Zelllinie </td></tr><tr><td> HBEC-5i </td><td></td><td></td><td> Gewonnen aus Francisco Candal (fcandal@cdc.gov) </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Materials

<ol>
	<li>Scherf, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigenic+variation+in+malaria:+in+situ+switching,+relaxed+and+mutually+exclusive+transcription+of+var+genes+during+intra-erythrocytic+development+in+Plasmodium+falciparum.">Antigenic variation in malaria: in situ switching, relaxed and mutually exclusive transcription of var genes during intra-erythrocytic development in Plasmodium falciparum.</a> Embo. J. 17, 5418-5426 (1998).</li><li>MacPherson, G. G., Warrell, M. J., White, N. J., Looareesuwan, S., Warrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cerebral+malaria.+A+quantitative+ultrastructural+analysis+of+parasitized+erythrocyte+sequestration.">Human cerebral malaria. A quantitative ultrastructural analysis of parasitized erythrocyte sequestration.</a> Am. J. Pathol. 119, 385-401 (1985).</li><li>Seydel, K. B., Milner, D. A., Kamiza, S. B., Molyneux, M. E., Taylor, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+and+intensity+of+parasite+sequestration+in+comatose+Malawian+children.">The distribution and intensity of parasite sequestration in comatose Malawian children.</a> J. Infect. Dis. 194, 208-208 (2006).</li><li>Taylor, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiating+the+pathologies+of+cerebral+malaria+by+postmortem+parasite+counts.">Differentiating the pathologies of cerebral malaria by postmortem parasite counts.</a> Nat. Med. 10, 143-145 (2004).</li><li>van der Heyde, H. C., Nolan, J., Combes, V., Gramaglia, I., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unified+hypothesis+for+the+genesis+of+cerebral+malaria:+sequestration,+inflammation+and+hemostasis+leading+to+microcirculatory+dysfunction.">A unified hypothesis for the genesis of cerebral malaria: sequestration, inflammation and hemostasis leading to microcirculatory dysfunction.</a> Trends. Parasitol. 22, 503-508 (2006).</li><li>Dorovini-Zis, K., Prameya, R., Bowman, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+characterization+of+microvascular+endothelial+cells+derived+from+human+brain.">Culture and characterization of microvascular endothelial cells derived from human brain.</a> Lab. Invest. 64, 425-436 (1991).</li><li>Rowe, J. A., Claessens, A., Corrigan, R. A., Arman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+of+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+to+human+cells:+molecular+mechanisms+and+therapeutic+implications.">Adhesion of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes to human cells: molecular mechanisms and therapeutic implications.</a> Expert reviews in molecular medicine. 11, e16-e16 (2009).</li><li>Xiao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum:+involvement+of+additional+receptors+in+the+cytoadherence+of+infected+erythrocytes+to+microvascular+endothelial+cells.">Plasmodium falciparum: involvement of additional receptors in the cytoadherence of infected erythrocytes to microvascular endothelial cells.</a> Exp. Parasitol. 84, 42-55 (1996).</li><li>Corrigan, R. A., Rowe, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+variation+in+early+innate+cytokine+induction+by+Plasmodium+falciparum.">Strain variation in early innate cytokine induction by Plasmodium falciparum.</a> Parasite. Immunol. 32, 512-527 (2010).</li><li>Rowe, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+of+mycoplasma+contamination+in+Plasmodium+falciparum+cultures+and+methods+for+its+detection+and+eradication.">Implications of mycoplasma contamination in Plasmodium falciparum cultures and methods for its detection and eradication.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 92, 177-180 (1998).</li><li>Moll, K., Ljungstr&#246;m, I., Perlmann, H., Scherf, A., Wahlgren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Malaria Research. , (2009).</li><li>Lambros, C., Vanderberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+of+Plasmodium+falciparum+erythrocytic+stages+in+culture.">Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture.</a> J. Parasitol. 65, 418-420 (1979).</li><li>Herricks, T., Antia, M., Rathod, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deformability+limits+of+Plasmodium+falciparum-infected+red+blood+cells.">Deformability limits of Plasmodium falciparum-infected red blood cells.</a> Cell. Microbiol. , (2009).</li><li>Nakamura, K., Hasler, T., Morehead, K., Howard, R. J., Aikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum-infected+erythrocyte+receptor(s)+for+CD36+and+thrombospondin+are+restricted+to+knobs+on+the+erythrocyte+surface.">Plasmodium falciparum-infected erythrocyte receptor(s) for CD36 and thrombospondin are restricted to knobs on the erythrocyte surface.</a> J. Histochem. Cytochem. 40, 1419-1422 (1992).</li><li>Wassmer, S. C., Cianciolo, G. J., Combes, V., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LMP-420,+a+new+therapeutic+approach+for+cerebral+malaria.">LMP-420, a new therapeutic approach for cerebral malaria.</a> Med. Sci. (Paris). 22, 343-345 (2006).</li><li>Wassmer, S. C., Combes, V., Candal, F. J., Juhan-Vague, I., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelets+potentiate+brain+endothelial+alterations+induced+by+Plasmodium+falciparum.">Platelets potentiate brain endothelial alterations induced by Plasmodium falciparum.</a> Infect. Immun. 74, 645-653 (2006).</li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Das Markenzeichen von zerebraler Malaria ist die Beschlagnahme von P. falciparum iRBC innerhalb des Gehirns Mikrovaskulatur 2, 3. Doch in vitro-Kulturen von P. falciparum nur schlecht cytoadhere zu HBEC-5i, ein Modell für menschliche Gehirn mikrovaskulären Endothel. Hier entwickelten wir eine einfache Assay einer Bevölkerung für die Bindung an HBEC-5i, eine &quot;in-vivo wie&quot; Phänotyp zu bereichern. Drei von 4 P. falciparum-Stämme wurden erfolgreich gewählt mit dieser Methode. Darüber hinaus wurde HB3 auch auf HDMEC und HPMEC ausgewählt, was darauf hinweist, dass dieses Protokoll für verschiedene Parasiten und endothelialen Zelltypen verwendet werden kann. Verschiedene Hypothesen können erklären die mangelnde Bindung mit dem Dd2 Belastung. Die wahrscheinlichste ist die Tatsache, dass dieser Parasit line knobless ist, die tief behindert die cytoadherence 13, 14. Wir empfehlen Kultivierung unselected Parasiten neben der Auswahl proZugang zu einem Steuerelement zum Vergleich bieten. Dies ermöglicht zum Beispiel den Vergleich der Transkriptom von verbindlichen und unverbindlichen Parasiten, mit der Hoffnung, Parasiten Ligand Kandidaten. TNF ist ein Zytokin, auf hohem Niveau in der zerebralen Malaria-Patienten gefunden und wurde zu zeigen, die Expression vieler Oberflächenproteine ​​HBEC-5i (Claessens et al, in Vorbereitung und 8, 15, 16) zu induzieren. In diesem Fall war die Menge an gebundenem iRBC ähnlich im normalen HBEC-5i im Vergleich zu aktivierten HBEC-5i. Diese &quot;Sequestrierung Modell&quot; kann auch verwendet werden, um die molekulare Wechselwirkung zwischen den iRBC und Endothelzellen, sowie die Wirkung der vermeintlichen Anti-cytoadherence Drogen zu untersuchen. In diesem Fall empfehlen wir plating HBEC-5i in kleineren Brunnen, wie &quot;8-Well-Kammer-Objektträgern&quot; (BD 354628) oder &quot;CultureWell&quot; (Sigma C7735-20EA).

selection of plasmodium falciparum parasites for cytoadhesion to human brain endothelial cells

Die meisten menschlichen Malaria-Todesfälle werden durch Blut-Bühne Plasmodium falciparum Parasiten verursacht werden. Zerebrale Malaria, die meisten lebensbedrohliche Komplikation der Erkrankung ist durch eine Anhäufung von Plasmodium falciparum infiziert rote Blutkörperchen (iRBC) bei pigmentierten Trophozoiten Stufe in der Mikrovaskulatur des Gehirns 2-4 aus. Diese microvessel Obstruktion (Sequestrierung) führt zu Azidose, Hypoxie und schädliche inflammatorischen Zytokinen (reviewed in 5). Sequestration ist auch in den meisten mikrovaskulären Gewebe des menschlichen Körpers 2, 3 gefunden. Der Mechanismus, durch den iRBC die Wände der Blutgefäße anzubringen ist noch weitgehend unverstanden. Die immortalisierten Human Brain mikrovaskulären Endothel-Zelllinie (HBEC-5i) wurde als ein in vitro Modell der Blut-Hirn-Barriere 6 verwendet worden. Allerdings Plasmodium falciparum iRBC nur schlecht anbringen, um HBEC-5i in vitro, im Gegensatz zu den dichten sequestratIon, das in der zerebralen Malaria-Fälle auftritt. Wir haben deshalb eine Panning-Assay (bereichern) verschiedene P. wählen falciparum-Stämme für die Haftung auf HBEC-5i, um Populationen von High-bindenden Parasiten, repräsentativer, was in vivo zu erhalten. Eine Probe von einem Parasiten Kultur (Mischung aus iRBC und nicht infizierten Erythrozyten) an der pigmentierten Trophozoiten Bühne wird gewaschen und auf einer Schicht aus HBEC-5i auf einer Petrischale gezüchtet inkubiert. Nach der Inkubation wird die Schale vorsichtig gewaschen frei von uRBC und ungebundenen iRBC. Frische uRBC sind die wenigen iRBC an HBEC-5i und über Nacht inkubiert aufgenommen. Als Schizonten Parasiten platzen, Merozoiten reinvade RBC und diese Ring-Parasiten geerntet werden am folgenden Tag. Parasiten sind kultiviert, bis genug Material erhalten (in der Regel 2 bis 4 Wochen) und eine neue Runde der Selektion durchgeführt werden kann. Abhängig von der P. falciparum, 4 bis 7 Runden der Selektion sind erforderlich, um eine Bevölkerung zu bekommenwo die meisten Parasiten binden HBEC-5i. Die Bindung Phänotyp ist progressiv nach ein paar Wochen verloren, was auf einen Schalter in der Variante Oberflächenantigen Genexpression, also regelmäßige Auswahl an HBEC-5i erforderlich ist, um den Phänotyp zu erhalten. Zusammenfassend haben wir eine Auswahl Assay Rendering P. falciparum Parasiten eine &quot;zerebrale Malaria Klebstoff&quot; Phänotyp. Wir konnten 3 Wählen Sie aus 4 P. falciparum-Stämme auf HBEC-5i. Dieser Test hat sich auch erfolgreich verwendet worden, um Parasiten für die Bindung an menschliche Haut-und Lungenerkrankungen Endothelzellen zu wählen. Wichtig ist, dass diese Methode verwendet, um Gewebe-spezifischen Parasiten Populationen zu wählen, um Kandidaten Parasiten Liganden für die Bindung an Gehirn Endothel zu identifizieren. Darüber hinaus kann dieser Test zum Screening auf putative anti-Sequestrierung Drogen 7 verwendet werden.

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Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell für zerebrale Malaria-Sequestrierung wird beschrieben<sup&gt; 1</sup&gt;.<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Infizierten roten Blutkörperchen sind für die Bindung an verewigt menschliche Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen aktiviert. Die ausgewählten Parasiten zeigen eine deutliche Phänotyp. Die Auswahl kann mit verschiedenen werden<em&gt; P. falciparum</em&gt; Stämme und endothelialen Zell-Linien.

Auswahl der Plasmodium falciparum Parasiten für Cytoadhesion zu Human Brain Endothelial Cells

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

selection-plasmodium-falciparum-parasites-for-cytoadhesion-to-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

18.9K Aufrufe.  University of Edinburgh. Ein In-vitro- Modell für zerebrale Malaria-Sequestrierung wird beschrieben 1. Plasmodium falciparum Infizierten roten Blutkörperchen sind für die Bindung an verewigt menschliche Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen aktiviert. Die ausgewählten Parasiten zeigen eine deutliche Phänotyp. Die Auswahl kann mit verschiedenen werden P. falciparum Stämme und endothelialen Zell-Linien.

Serie: Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Plasmodium falciparum, the causative agent of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important health problems worldwide, being responsible for a total of 4 million deaths annually1. Due to their extensive overlap in developing regions, especially Sub-Saharan Africa, co-infections with malaria and HIV-1 are common, but the interplay between the two diseases is poorly understood. Epidemiological reports have suggested that malarial infection transiently enhances HIV-1 replication and increases HIV-1 viral load in co-infected individuals2,3. Because this viremia stays high for several weeks after treatment with antimalarials, this phenomenon could have an impact on disease progression and transmission.
The cellular immunological mechanisms behind these observations have been studied only scarcely. The few in vitro studies investigating the impact of malaria on HIV-1 have demonstrated that exposure to soluble malarial antigens can increase HIV-1 infection and reactivation in immune cells. However, these studies used whole cell extracts of P. falciparum schizont stage parasites and peripheral blood mononuclear cells (PBMC), making it hard to decipher which malarial component(s) was responsible for the observed effects and what the target host cells were4,5. Recent work has demonstrated that exposure of immature monocyte-derived dendritic cells to the malarial pigment hemozoin increased their ability to transfer HIV-1 to CD4+ T cells6,7, but that it decreased HIV-1 infection of macrophages8. To shed light on this complex process, a systematic analysis of the interactions between the malaria parasite and HIV-1 in different relevant human primary cell populations is critically needed.
Several techniques for investigating the impact of HIV-1 on the phagocytosis of micro-organisms and the effect of such pathogens on HIV-1 replication have been described. We here present a method to investigate the effects of P. falciparum-infected erythrocytes on the replication of HIV-1 in human primary monocyte-derived macrophages. The impact of parasite exposure on HIV-1 transcriptional/translational events is monitored by using single cycle pseudotyped viruses in which a luciferase reporter gene has replaced the Env gene while the effect on the quantity of virus released by the infected macrophages is determined by measuring the HIV-1 capsid protein p24 by ELISA in cell supernatants.

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

We have developed an in vitro malaria-HIV-1 co-infection model to study the impact of Plasmodium falciparum on the HIV-1 replicative cycle in human primary monocyte-derived macrophages. This versatile system can easily be adapted to other primary cell types susceptible to HIV-1 infection.

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Co-Infektion Modell zum Studium<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; HIV-1-Wechselwirkungen in primären menschlichen Monozyten abgeleitete Immunzellen

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Forschung

Immunologie und Infektion

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully understood and several hypotheses have been put forward, including mechanical obstruction of microvessels by P. falciparum-parasitized red blood cells (pRBC). Indeed, during the intra-erythrocytic stage of its life cycle, P. falciparum has the unique ability to modify the surface of the infected erythrocyte by exporting surface antigens with varying adhesive properties onto the RBC membrane. This allows the sequestration of pRBC in multiple tissues and organs by adhesion to endothelial cells lining the microvasculature of post-capillary venules 1. By doing so, the mature forms of the parasite avoid splenic clearance of the deformed infected erythrocytes 2 and restrict their environment to a more favorable low oxygen pressure 3. As a consequence of this sequestration, it is only immature asexual parasites and gametocytes that can be detected in peripheral blood.
Cytoadherence and sequestration of mature pRBC to the numerous host receptors expressed on microvascular beds occurs in severe and uncomplicated disease. However, several lines of evidence suggest that only specific adhesive phenotypes are likely to be associated with severe pathological outcomes of malaria. One example of such specific host-parasite interactions has been demonstrated in vitro, where the ability of intercellular adhesion molecule-1 to support binding of pRBC with particular adhesive properties has been linked to development of cerebral malaria 4,5. The placenta has also been recognized as a site of preferential pRBC accumulation in malaria-infected pregnant women, with chondrotin sulphate A expressed on syncytiotrophoblasts that line the placental intervillous space as the main receptor 6. Rosetting of pRBC to uninfected erythrocytes via the complement receptor 1 (CD35)7,8 has also been associated with severe disease 9.
One of the most recently described P. falciparum cytoadherence phenotypes is the ability of the pRBC to form platelet-mediated clumps in vitro. The formation of such pRBC clumps requires CD36, a glycoprotein expressed on the surface of platelets. Another human receptor, gC1qR/HABP1/p32, expressed on diverse cell types including endothelial cells and platelets, has also been shown to facilitate pRBC adhesion on platelets to form clumps 10. Whether clumping occurs in vivo remains unclear, but it may account for the significant accumulation of platelets described in brain microvasculature of Malawian children who died from CM 11. In addition, the ability of clinical isolate cultures to clump in vitro was directly linked to the severity of disease in Malawian 12 and Mozambican patients 13, (although not in Malian 14).
With several aspects of the pRBC clumping phenotype poorly characterized, current studies on this subject have not followed a standardized procedure. This is an important issue because of the known high variability inherent in the assay 15. Here, we present a method for in vitro platelet-mediated clumping of P. falciparum with hopes that it will provide a platform for a consistent method for other groups and raise awareness of the limitations in investigating this phenotype in future studies. Being based in Malawi, we provide a protocol specifically designed for a limited resource setting, with the advantage that freshly collected clinical isolates can be examined for phenotype without need for cryopreservation.

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

This method investigates the platelet-mediated clumping phenotype of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (pRBC) in clinical isolates. This is performed by isolating and co-incubating platelet-rich plasma and a suspension of pRBC.

Ein einfaches Protokoll für Thrombozyten-vermittelte Verklumpung<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-Infizierten Erythrozyten in einer Ressource Schlechte Einstellung

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We describe a method for isolation and characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. Infection of susceptible mouse-strains with this parasite strain results in the induction of experimental cerebral malaria, a neurologic syndrome that recapitulates certain important aspects of Plasmodium falciparum-mediated severe malaria in humans 1,2 . Mature forms of blood-stage malaria express parasitic proteins on the surface of the infected erythrocyte, which allows them to bind to vascular endothelial cells. This process induces obstructions in blood flow, resulting in hypoxia and haemorrhages 3 and also stimulates the recruitment of inflammatory leukocytes to the site of parasite sequestration.
Unlike other infections, i.e neutrotopic viruses4-6, both malaria-parasitized red blood cells (pRBC) as well as associated inflammatory leukocytes remain sequestered within blood vessels rather than infiltrating the brain parenchyma. Thus to avoid contamination of sequestered leukocytes with non-inflammatory circulating cells, extensive intracardial perfusion of infected-mice prior to organ extraction and tissue processing is required in this procedure to remove the blood compartment. After perfusion, brains are harvested and dissected in small pieces. The tissue structure is further disrupted by enzymatic treatment with Collagenase D and DNAse I. The resulting brain homogenate is then centrifuged on a Percoll gradient that allows separation of brain-sequestered leukocytes (BSL) from myelin and other tissue debris. Isolated cells are then washed, counted using a hemocytometer and stained with fluorescent antibodies for subsequent analysis by flow cytometry.
This procedure allows comprehensive phenotypic characterization of inflammatory leukocytes migrating to the brain in response to various stimuli, including stroke as well as viral or parasitic infections. The method also provides a useful tool for assessment of novel anti-inflammatory treatments in pre-clinical animal models.

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

A method for isolation of adherent inflammatory leukocytes from brain blood vessels of Plasmodium berghei ANKA-infected mice is described. The method allows quantification as well as phenotypic characterization of isolated leukocytes after staining with fluorescent antibodies and subsequent analysis by flow cytometry.

Isolierung und Analyse von Brain-sequestered Leukozyten aus<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-infizierte Mäuse

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the &asymp;40% limit, the investigator usually keeps the percentage at around 10%. In many cases it is necessary to isolate the parasite-containing red blood cells (RBCs) from the uninfected ones, to enrich the culture and proceed with a given experiment. 
When P. falciparum infects the erythrocyte, the parasite degrades and feeds from haemoglobin 2, 3. However, the parasite must deal with a very toxic iron-containing haem moiety 4, 5. The parasite eludes its toxicity by transforming the haem into an inert crystal polymer called haemozoin 6, 7. This iron-containing molecule is stored in its food vacuole and the metal in it has an oxidative state which differs from the one in haem 8. The ferric state of iron in the haemozoin confers on it a paramagnetic property absent in uninfected erythrocytes. As the invading parasite reaches maturity, the content of haemozoin also increases 9, which bestows even more paramagnetism on the latest stages of P. falciparum inside the erythrocyte.
Based on this paramagnetic property, the latest stages of P. falciparum infected-red blood cells can be separated by passing the culture through a column containing magnetic beads. These beads become magnetic when the columns containing them are placed on a magnet holder. Infected RBCs, due to their paramagnetism, will then be trapped inside the column, while the flow-through will contain, for the most part, uninfected erythrocytes and those containing early stages of the parasite.
Here, we describe the methodology to enrich the population of late stage parasites with magnetic columns, which maintains good parasite viability 10. After performing this procedure, the unattached culture can be returned to an incubator to allow the remaining parasites to continue growing.

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

The paramagnetic properties of hemozoin are used to isolate late stages of Plasmodium falciparum-infected red blood cells growing in culture. The method is simple and fast and does not affect the subsequent invasive capabilities of the parasites.

Trennung<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Late Stage-infizierten Erythrozyten durch magnetische Mittel

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Quantitative<em&gt; In-vitro-</em&gt; Assay auf Neutrophile Haftung auf Aktiviert primären humanen mikrovaskulären Endothelzellen unter statischen Bedingungen messen

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

Isolierung von myeloider dendritischer Zellen und Epithelzellen Menschliche Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of free merozoites from the blood by phagocytic cells. However assessing the functional efficacy of merozoite specific opsonizing antibodies is challenging due to the short half-life of merozoites and the variability of primary phagocytic cells. Described in detail herein is a method for generating viable merozoites using the E64 protease inhibitor, and an assay of merozoite opsonin-dependent phagocytosis using the pro-monocytic cell line THP-1. E64 prevents schizont rupture while allowing the development of merozoites which are released by filtration of treated schizonts. &#160;Ethidium bromide labelled merozoites are opsonized with human plasma samples and added to THP-1 cells. Phagocytosis is assessed by a standardized high throughput protocol. Viable merozoites are a valuable resource for assessing numerous aspects of P. falciparum biology, including assessment of immune function. Antibody levels measured by this assay are associated with clinical immunity to malaria in naturally exposed individuals. The assay may also be of use for assessing vaccine induced antibodies. &#160;

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Measuring antibody function is key to understanding immunity to Plasmodium falciparum malaria. This method describes the purification of viable merozoites, and measurement of opsonization-dependent phagocytosis by flow cytometry.

High Yield Reinigung von<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Merozoiten Zur Verwendung in opsonierende Antikörper-Assays

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The molecular basis of this resistance, which is known to be multifactorial, remains incompletely understood. Recent studies found that the differential expression of erythrocyte microRNAs, once translocated into malaria parasites, affect both gene regulation and parasite growth. These miRNAs were later shown to inhibit mRNA translation by forming a chimeric RNA transcript via 5&#39; RNA fusion with discreet subsets of parasite mRNAs. Here, the techniques that were used to study the functional role and putative mechanism underlying erythrocyte microRNAs on the gene regulation and translational potential of P. falciparum, including the transfection of modified synthetic microRNAs into host erythrocytes, will be detailed.&#160; Finally, a polysome gradient method is used to determine the extent of translation of these transcripts. Together, these techniques allowed us to demonstrate that the dysregulated levels of erythrocyte microRNAs contribute to cell-intrinsic malaria resistance of sickle erythrocytes.

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Human microRNAs translocate from host erythrocytes to Plasmodium falciparum parasites. Here, the techniques used to transfect synthetic microRNAs into host erythrocytes and isolate all RNAs from P. falciparum are described. In addition, this paper will detail a method of polysome isolation in P. falciparum to determine the ribosomal occupancy and translational potential of parasite transcripts.

Methoden, um die regulatorische Rolle kleiner RNAs und Ribosomal Belegung von Untersuchen<em&gt; Plasmodium falciparum</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von Willebrand Factor (VWF). This glycoprotein changes its molecular conformation in response to shear stress, thereby exposing binding sites for a broad spectrum of host-ligand interactions. In general, culturing of primary endothelial cells under a defined shear flow is known to promote the specific cellular differentiation and the formation of a stable and tightly linked endothelial layer resembling the physiology of the inner lining of a blood vessel. Thus, the functional analysis of interactions between bacterial pathogens and the host vasculature involving mechanosensitive proteins requires the establishment of pump systems that can simulate the physiological flow forces known to affect the surface of vascular cells.
The microfluidic device used in this study enables a continuous and pulseless recirculation of fluids with a defined flow rate. The computer-controlled air-pressure pump system applies a defined shear stress on endothelial cell surfaces by generating a continuous, unidirectional, and controlled medium flow. Morphological changes of the cells and bacterial attachment can be microscopically monitored and quantified in the flow by using special channel slides that are designed for microscopic visualization. In contrast to static cell culture infection, which in general requires a sample fixation prior to immune labeling and microscopic analyses, the microfluidic slides enable both the fluorescence-based detection of proteins, bacteria, and cellular components after sample fixation; serial immunofluorescence staining; and direct fluorescence-based detection in real time. In combination with fluorescent bacteria and specific fluorescence-labeled antibodies, this infection procedure provides an efficient multiple component visualization system for a huge spectrum of scientific applications related to vascular processes.

This study describes the microscopic monitoring of pneumococcus adherence to von Willebrand factor strings produced on the surface of differentiated human primary endothelial cells under shear stress in defined flow conditions. This protocol can be extended to detailed visualization of specific cell structures and quantification of bacteria by applying differential immunostaining procedures.

Pneumokokken-Infektion von primären humanen Endothelzellen im konstanten Fluss

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von ...

Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells

Meningococcal meningitis is a life-threatening infection that occurs when Neisseria meningitidis (meningococcus, Nm) can gain access to the central nervous system (CNS) by penetrating highly specialized brain endothelial cells (BECs). As Nm is a human-specific pathogen, the lack of robust in vivo model systems makes study of the host-pathogen interactions between Nm and BECs challenging and establishes a need for a human based model that mimics native BECs. BECs possess tighter barrier properties when compared to peripheral endothelial cells characterized by complex tight junctions and elevated trans-endothelial electrical resistance (TEER). However, many in vitro models, such as primary BECs and immortalized BECs, either lack or rapidly lose their barrier properties after removal from the native neural microenvironment. Recent advances in human stem-cell technologies have developed methods for deriving brain-like endothelial cells from induced pluripotent stem-cells (iPSCs) that better phenocopy BECs when compared to other in vitro human models. The use of iPSC-derived BECs (iPSC-BECs) to model Nm-BEC interaction has the benefit of using human cells that possess BEC barrier properties, and can be used to examine barrier destruction, innate immune activation, and bacterial interaction. Here we demonstrate how to derive iPSC-BECs from iPSCs in addition to bacterial preparation, infection, and sample collection for analysis.

Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells

The protocol described here highlights the major steps in the differentiating induced pluripotent stem-cell derived brain-like endothelial cells, the preparation of Neisseria meningitidis for infection, and sample collection for other molecular analyses.

Neisseria meningitidis Infektion von induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Gehirnendothelzellen

Meningococcal meningitis is a life-threatening infection that occurs when Neisseria meningitidis (meningococcus, Nm) can gain access to the central ...