Dieses Projekt wurde durch Gewährung 1R03MH08127-01 und-02 7R03MH08127 von NIH Q. Li unterstützt und von den Mitteln aus IMPACT Abteilung für Medizin an der UAB Q. Li. Unterstützung aus der Molette Fonds und der Auburn University wird geschätzt. Wir danken auch die technischen Hilfestellungen von Frau Pulin Che und Herr Volodymyr Musiienko im Laufe der Arbeit.

1. Zellen, Virus und die antivirale Verbindungen <ol><li> Aufrechterhaltung BSR Zellen, ein Derivat von Babyhamsternieren (BHK)-Zellen 10, in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), enthaltend 5% fötales Kälberserum (FCS), 100U/ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin. </li><li> Bei allen drei Assays Platte Zellen in DMEM mit 1% FCS, 100U/ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin, wie zuvor optimierten 5. Dieses Medium wird als Testmedium für alle drei Assays bezeichnet. </li><li> Alle Zellen im Brutschrank inkubieren bei 37 ° C mit 5% CO &amp;sub2; und 80-95% Luftfeuchtigkeit. </li><li> Plaque-Reinigung und propagieren den Typ 10 BTV (BTV-10), wie zuvor 8 beschrieben. Verdünnen BTV-10 in Assay-Medium für jeden benannten Assays. </li><li> Lösen Sie alle Testverbindungen in DMSO, eine Aktie mit der Konzentration auf 10 mM zu bilden. Bewahren Sie die Aktien bei -20 ° C </li><li> Verdünnen Sie Verbindungen zu gewünschten Konzentrationen mit Assay-Medium für den designiertend 2-Assays. </li></ol> 2. CPE-basierte Assay unter Verwendung von CTG Kit <ol><li> Seed BSR Zellen in eine 384-Well-Mikroplatte (schwarz, Format 16 x 24) über MicroFlo wählen Spender. Die Aussaatdichte beträgt 5.000 Zellen / gut, und die Aussaat Volumen 20 ul für die antivirale Wirksamkeit Analyse. </li><li> Inkubieren Zellen für 2-3 Stunden bis Zellen erhalten Anhänger der Platte gründlich. </li><li> Hinzufügen antiviralen Verbindung mit einer Endkonzentration von 10 &amp;mgr; M zu jeder Vertiefung. Mischen Sie es vollständig. </li><li> BTV verdünnen, um die gewünschten Titer und mit 5 ul BTV bezeichnet mit MOI in jede Vertiefung. Für die Steuerung gut, fügen 5 ul der Testmedien. Die infizierten Zellen für 72 Stunden bei 37 ° C mit 5% CO &amp;sub2; und 80-95% Luftfeuchtigkeit. </li><li> Bei 72 hpi, Tauwetter und ins Gleichgewicht CTG-Puffer und die lyophilisiert CTG Substrat auf Raumtemperatur vor der Verwendung. Die Rekonstitution der homogenen CTG Reagenzienlösung durch Mischen der lyophilisierten Enzym / Substrat und die Puffer Reagenz nach thAnweisungen des e-Hersteller. </li><li> Äquilibrieren Die Testplatten auf Raumtemperatur für 15 min. </li><li> Ein gleiches Volumen (25 &amp;mgr; l) CTG Reagenzien in jede Vertiefung von einem Spender. Nach Inkubation für 15 min bei Raumtemperatur in der Dunkelheit zu messen Lumineszenz-Signale mit einem Multi-Modus-Lesegerät mit einer Integrationszeit von 0,1 Sekunden. </li></ol> 3. Dosis-Wirkungs-Assay <ol><li> Samen BSR Zellen in eine 384-Well-Mikroplatte (schwarz; Format von 16 x 24) über eine Abgabevorrichtung, mit einer Aussaatdichte von 5.000 Zellen / Vertiefung in einer Aussaat von 20 &amp;mgr; l für die antivirale Wirksamkeit und 25 &amp;mgr; l Assay für Zytotoxizitätstest jeweils . </li><li> Zellen, Inkubation für 2-3 h bei 37 ° C mit 5% CO &amp;sub2; und 80-95% Luftfeuchtigkeit bis Zellen sind an der Platte befestigt. </li><li> Verfahren Assay in einer Viertelfläche der 384-Well-Platte für jede Verbindung (äquivalent zu einer 96-Well-Platte), wie in Tabelle 1 gezeigt. Ordnen Sie acht Wiederholungen für jede Konzentrationin einem einzigen Assay. Weisen Sie die erste Spalte als positive Kontrolle ohne Zugabe von Verbindung und Viren, und die letzte Spalte (12.) als Negativkontrolle durch Zugabe von Virus nur ohne Verbindungen. </li><li> Verdünnen Sie Verbindungen zu 50 uM in Assay-Medium und zu der 2. Säule bei 20 ul / für die antivirale Wirksamkeit Assay. Mischen Sie die Verbindung fünfmal mit 8-Kanal-semi-automatischen Pipette bis zu einer Konzentration von 25 uM. </li><li> Verwendung von 8-Kanal-Halb automatischen Pipette, 20 &amp;mgr; l-Gemisch in der 2. Spalte zur nächsten Spalte (3.) zugeben, um eine Konzentration von 12,5 &amp;mgr; m zu bilden. Wiederholen dieses Prozesses durch die Übertragung von 20 ul Gemisch aus 3. Spalte zur nächsten Spalte (4 th), eine andere zweifachen Verdünnung mit einer Konzentration von 6,25 &amp;mgr; m zu bilden. Wiederholen Sie diese zweifache serielle Verdünnung bis 11. Spalte. Absaugen und entsorgen 20 ul der Mischung im 11-ten Spalte nach dem Hinzufügen und Mischen des Layoutound. </li><li> Hinzufügen BTV-10, bezogen auf MOI von 0,01, in jede Vertiefung von Spalte 2 bis Spalte 11 mit einem Volumen von 5 &amp;mgr; l / Vertiefung. Nach der Zugabe des Virus, sollte die Endkonzentration der Verbindung in jeder Spalte werden: 20 &amp;mgr; M in Spalte 2, 10 &amp;mgr; M in Spalte 3, und weiterhin mit einer zweifachen Verdünnung bis Spalte 11 mit einer Endkonzentration von 0,04 uM. </li><li> In 5 ul Medium in die Spalte 1 als Zell nur Kontrolle (positiv) und 5 ul / BTV Spalte 12 als BTV-Infektion nur Steuerung (negativ). </li><li> Verdünnen Verbindungen zu einer Anfangskonzentration von 200 &amp;mgr; M für Zytotoxizitätstest. Ebenso werden 25 ul / Vertiefung der Verbindung der Säule 2 und gemischt mit 5 x 8-Kanal-Pipette halbautomatisch auf eine Konzentration von 100 uM. Sie BTV nicht hinzu. </li><li> Führen Sie die zweifache Verdünnungsreihe durch Ansaugen von 25 ul aus Spalte 2 in die benachbarte Spalte 3, und dauerte bis in die letzte Spalte (12.). , In Spalte 12, nach dem Mischen, absaugen und entsorgen 25 ul mixture. Die Endkonzentration in Spalte 2 ist 100 um und der 12-ten Spalte sollte 0,2 &amp;mgr; m sein. Die Säule 1 ist die Zelle nur Steuerung. </li><li> Sowohl antivirale Wirksamkeit und Zytotoxizitätstests, Inkubation der Platten bei 37 ° C mit 5% CO &amp;sub2; und 80-95% Luftfeuchtigkeit für 72 Stunden nach der Behandlung. Lebensfähigkeit der Zellen zu messen unter Verwendung der CTG-Kit, wie oben beschrieben (Schritte Protokoll 2,5-2,7). </li></ol> 4. Time-of-Addition (TOA) Assay <ol><li> Seed BSR Zellen von Spalte 1-24 in einer 384-Well-Mikroplatte (schwarz, Format 16 x 24) über einen Spender mit 5000 Zellen / Well und der Aussaat Volumen 15 ul /. </li><li> Für jede Verbindung verwenden alle vierundzwanzig Spalten mit acht Replikate für jede Zeitpunkt in einer Hälfte der 384-Well-Platte (Tabelle 2). Weisen Spalte 1 als Zellen, die nur Steuer durch Zugabe von 10 ul / Assay-Medium. Spalte 24 Mark als BTV-Infektion nur Kontrolle (Negativkontrolle) durch Zugabe von 5 ul / Assay-Medium eind 5 &amp;mgr; l / Vertiefung Virus bei einer MOI von 0,01 bis zu einem Endvolumen von 25 ul / Vertiefung. </li><li> Wählen Sie die geraden Spalten aus Spalte 2-22 als antivirale Wirksamkeit Auswertung Säule zu verschiedenen Zeiten nach der Infektion (hpi). In diesen Spalten, infizieren Zellen mit 5 ul / BTV bei MOI von 0,01. Bei verschiedenen hpi, auch in jede Vertiefung werden 5 &amp;mgr; l / Vertiefung verdünnt Verbindung, um ein Endvolumen von 25 ul / Vertiefung zu bilden. Für die bezeichnete -2 und -1 hpi hinzuzufügen Verbindung BSR Zellen vor der BTV-Infektion. Für 0 hpi, fügen Sie die Verbindung und BTV mit der Kultur gleichzeitig. </li><li> Gleichzeitig bestimmen die ungeradzahligen Spalten aus Spalte 3-23 als Verbindung nur steuert, die Verbindung zu unterschiedlichen Zeitpunkten zugegeben als (-2, -1, 0, 1, 2, 4, 8, 16 bezeichnet, 24, 48 hpi). In diesen Spalten werden 5 &amp;mgr; l / Vertiefung Assaymedium und 5 &amp;mgr; l / Vertiefung verdünnt Verbindung, um ein Endvolumen von 25 ul / Vertiefung zu bilden. </li><li> Nach der Behandlung inkubieren Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 mit 80-95% Feuchtigkeit. </li><li> Bestimmen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen bei 72 hpi mit der CellTiter-Glo-Kit wie zuvor (Protokoll Schritte 2,5-2,7) beschrieben. </li></ol> 5. Datenanalyse <ol><li> Bearbeiten Sie alle Daten zuerst mit den richtigen In-House-Software auf der Basis der Leuchtsignale über den Multi-Mode-Reader erhalten. Bestimmen Sie den Mittelwert (Durchschnitt), Standardabweichung (STABW) für jede Behandlung sowie die Variationen Koeffizient (CV), der einen Wert von nicht mehr als 10% erfordert. </li><li> Übertragen Sie die verarbeiteten Daten von den oben genannten Software auf eine biostatischen und Grafik-Software-Werkzeug. Führen Sie die nicht-lineare Regressionsanalyse, um die Werte der EG-50 und CC 50 zu bestimmen. </li></ol>

<ol>
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Methods. 179, 396-401 (2012).</li><li>Kampmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+screening+of+small+molecule+libraries+using+the+dengue+virus+envelope+E+protein+has+identified+compounds+with+antiviral+activity+against+multiple+flaviviruses.">In silico screening of small molecule libraries using the dengue virus envelope E protein has identified compounds with antiviral activity against multiple flaviviruses.</a> Antiviral Res. 84, 234-241 (2009).</li><li>Kirchmair, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+anti-viral+agents+using+molecular+modeling+and+virtual+screening+techniques.">Development of anti-viral agents using molecular modeling and virtual screening techniques.</a> Infect. Disord. Drug Targets. 11, 64-93 (2011).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Für die erstmalige Identifizierung von antiviralen Hits, ist einer der wichtigsten Schritte für die antivirale Wirkstoffforschung und Entwicklung, um robuste Tests zu entwickeln, die die Auswahl eines quantifizierbaren Marker, die Entwicklung einer einfachen Protokoll, ausreichende Signale und weniger als 10% CV enthält. Die meisten biochemischen und zellbasierte Bildschirme sind für eine chemische Ausgangspunkt auf der Grundlage der robustesten, einfache und kostengünstige Assay aufgrund der erforderlichen Reprodu...

BTV ist ein Prototyp Doppelstrang-RNA-Virus aus der Gattung Orbivirus, Familie Reoviridae. BTV ist eine der wichtigsten Krankheiten von Haustieren, darunter Schafe, Ziegen, Rinder und andere Haustiere, 3 Milliarden $ / Jahr weltweit 1,2 Verlust. Die exotische BTV-Serotyp ist ein in den aufgeführten wichtig Tierpathogen &quot;USDA Hohe Consequence Tierkrankheitserreger.&quot; Vor kurzem hat die wieder auftauchende der BTV hat einen großen Ausbruch der Krankheit bei Rindern und Schafen in mehreren Ländern in Nordeuropa 3,4 verursacht. Als Ergebnis ihrer wirtschaftlichen Bedeutung und als Modellsystem hat BTV Gegenstand von umfangreichen Molekular, genetische und strukturelle Untersuchungen und mehrere Impfstoffe entwickelt worden. Aufgrund des Mangels an richtigen Tests für antivirale Wirkstoffforschung, es gibt keine antivirale Verfügung gegen BTV. In einer aktuellen Hochdurchsatz-Screening (HTS)-Kampagne mit BTV als Modellsystem, wir dntwickelt, optimiert und validiert eine CPE-basierte Assays, um potenzielle Breitspektrum antiviralen Medikamenten gegen Arboviren 5 identifizieren. CPE-basierten Assays ist ein anerkannter Test, der in der antiviralen Arzneimittelforschung gegen eine Anzahl von Viren, die eine schnelle und beobachtbaren CPE / Apoptose induziert 5-7 verwendet wurde. In unserem System, Post BTV-Infektion ist CPE in Zellen von Wirbeltieren, einschließlich HeLa, BSR und HEK 293T-8 deutlich. BTV-induzierten CPE überwacht werden könnte und quantifiziert anhand verschiedener Zelllebensfähigkeit Nachweismethoden, einschließlich der CellTiter Glo Lebensfähigkeit der Zellen Reagenzien-Kit (CTG-Kit) 9. Dieses Kit bestimmt die Anzahl der lebensfähigen Zellen in Kultur, die auf die Quantifizierung der zellulären ATP dargestellt, die das Vorhandensein von lebenden Zellen metabolisch aktiv signalisiert. Unter optimierten Bedingungen, die CPE-basierte Assays hier präsentiert werden, zeigen die Machbarkeit mit dem &quot;Mix und messen&quot; ein Schritt-Protokoll und Flexibilität mit stabilen Leuchtsignalen. Inzwischen toxische Verbindungen reduCING Zelllebensfähigkeit wird in dieser CPE-basierte Assays ausgeschlossen. Die CPE-basierte Assay zeigte seiner Robustheit und Zuverlässigkeit für die antivirale Medikamentenforschung gegen BTV, und wurde verwendet, um die NIH Molecular Libraries Small Molecule Repository (MLSMR), die auf die Identifizierung von sechs neuartige antivirale Potential Cluster von Blei-Verbindung (en führt zu screenen ) 5. Wenn ein potentieller antivirale Verbindung wurde unter Verwendung des CPE-basierten Assay identifiziert wird, muss sie auf die zehn-Konzentration Dosis-Wirkungs-Assay unterzogen werden, um das Spektrum der antiviralen Wirksamkeit und Zytotoxizität 2 zu bestimmen. Die antivirale Wirksamkeit als die 50% inhibitorische Konzentration (IC 50) oder 50% effektive Konzentration (EC 50) dargestellt ist, ist die Konzentration eines Arzneimittels, die virusinduzierte CPE auf halbem Weg zwischen der Grundlinie und Maximal hemmt. Die Zytotoxizität der Virostatika, also die 50% Cytotoxizität Konzentration (CC 50), ist die KonzentrationInduzieren eines Arzneimittels 50% Zytotoxizität zwischen der Grundlinie und Maximum. Der Auswahlindex (SI), 50% SI (SI 50) bezeichnet wird, von CC 50 / IC-50, die die Spezifität der antiviralen gegen Virus-induzierten CPE bestimmt, berechnet. Der IC 50 (oder 50 EG), sind CC 50 und SI 50 Werte kritisch Maßnahmen zu bestimmen, ob eine antivirale Verbindung potenter und selektiver für die weitere Entwicklung von Medikamenten ist. Wenn ein antivirales zeigte keine offensichtliche Toxizität in vitro, noch verhindert Virus-induzierten CPE und die produktive viralen Lebenszyklus, ist es wichtig, seine MoA 2 charakterisieren. Leiteten solche Charakterisierung durch Ausführen ToA Assay, um die möglichen Schritt (e) des viralen Lebenszyklus, die durch das antivirale betroffen bestimmen. Im allgemeinen wurden antiviralen Verbindung, um Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten vor oder nach der Virusinfektion zugegeben. Wenn die antiviralen Medikamenten wurden in die infizierten Zellen aufgenommen, um sein Ziel zu posten sTEP im Verlauf der Infektion, wäre es in niedriger Aktivität führen, verglichen mit der, die vor dem Schritt zugegeben wurde. Somit ist ToA Studie kritisch für die Bestimmung der antiviralen Wirksamkeit der Verbindungen und ihrer potentiellen Ziel entweder auf dem viralen Lebenszyklus oder dem Hostmaschinen im viralen Lebenszyklus beteiligt. Für alle drei Tests wurde die Lebensfähigkeit der Zellen unter Verwendung der CTG-Kit folgende Herstellerangaben 5 bestimmt. Dieses Erfassungssystem gibt ausreichend Lumineszenz-Signale, die mit Hilfe verschiedener Inhouse-Software analysiert werden konnte. Jeder Test wurde mindestens in dreifacher Ausfertigung mit acht Repliken validiert und durchgeführt. Für alle erhaltenen Daten wurden drei Parameter, einschließlich der Mittelwert (AVE), Standardabweichung (STDEV) und Variationskoeffizient (CV) analysiert, um die Robustheit des Assays zu bestimmen. Sobald die Robustheit des Assays bestimmt wurde, werden die Daten weiter analysiert und mit verschiedenen Biostatik aufgetragen und grafisch werdenWerkzeuge 2 c.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1134218</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1000185</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gbico</td>
			<td>1049769</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo (CTG) kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>TB288</td>
			<td>For cell viability measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S25309B</td>
			<td>Diluted from 95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antiviral huashilcompounds</td>
			<td>NIH MLSMR and de novo synthesis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTV-10</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>VR-187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSR cell</td>
			<td>Developed in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy-II multi-mode microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>For luminescent signal reading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroFlo select dispenser</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>Adding cells, virus, and reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well flat-bottom microplate</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>28908031</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen. 5 software</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>For analysis of reading outputs from Synergy-II multi-mode microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 5</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>Version 5</td>
			<td>For biostatic analysis and plot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assays for the identification of novel antivirals against bluetongue virus

Um mögliche Virostatika gegen BTV zu identifizieren, haben wir entwickelt, optimiert und validiert drei Assays hier vorgestellt. Die CPE-basierte Test war der erste Test entwickelt, um zu beurteilen, ob eine Verbindung zeigte keine antivirale Wirksamkeit und wurden verwendet, um Bildschirm großen Substanzbibliothek. Inzwischen konnte die Zytotoxizität von Virostatika auch mit dem CPE-basierte Assays ausgewertet werden. Die Dosis-Wirkungs-Assay wurde entwickelt, um den Bereich der Wirksamkeit für die ausgewählte antivirale bestimmen, dh 50% inhibitorische Konzentration (IC 50) oder effektive Konzentration (EC 50), sowie dessen Bereich der Zytotoxizität (CC 50). Die Toa-Assay wurde für die erste Studie MoA den zugrundeliegenden Mechanismus der neuen antiviralen Medikamenten während der BTV viralen Lebenszyklus oder der möglichen Auswirkungen auf die Wirtszellmaschinerie bestimmen, beschäftigt. Diese Assays sind entscheidend für die Bewertung der antiviralen Wirksamkeit in Zellkultursystem, und sind für unsere jüngsten Forschungen führen verwendetten zur Identifizierung einer Reihe von neuen antiviralen Medikamenten gegen BTV.

1. Antivirale Wirksamkeit von Verbindung Die Zell-basierten CPE-Assay wurde entwickelt, optimiert und in vitro unter Verwendung des Leuchtbasis CTG Kit neuartige antivirale gegen BTV identifizieren, wie zuvor beschrieben, 2,5 validiert. Die zehn Dosis-Wirkungs-Assay wurde verwendet, um die antivirale Wirksamkeit und Zytotoxizität einer identifizierten Leitstruktur durch Messen der Anzahl von metabolisch lebensfähigen Zellen in Kultur, die auf die Quantifizierung der zellul...

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Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Drei Assays, einschließlich des zytopathischen Effekts (CPE)-basierte Assays, Dosis-Wirkungs-Assay und Time-of-Addition (TOA)-Assay entwickelt, optimiert, validiert und genutzt, um neue antivirale Mittel gegen Blauzungenvirus (BTV) zu identifizieren, sowie um den möglichen Mechanismus-of-Aktion (MoA) für neu identifizierten antiviralen Medikamenten zu bestimmen.

Tests für die Identifizierung neuer Antivirale gegen Blauzungenvirus

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.9K Aufrufe.  University of Alabama at Birmingham.  Drei Assays, einschließlich des zytopathischen Effekts (CPE)-basierte Assays, Dosis-Wirkungs-Assay und Time-of-Addition (TOA)-Assay entwickelt, optimiert, validiert und genutzt, um neue antivirale Mittel gegen Blauzungenvirus (BTV) zu identifizieren, sowie um den möglichen Mechanismus-of-Aktion (MoA) für neu identifizierten antiviralen Medikamenten zu bestimmen. 

Serie: Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of discrete plaques (infectious units and cellular dead zones) in cell culture. Here we demonstrate how to perform a basic plaque assay, and how differing overlays and techniques can affect plaque formation and production. Typically solid or semisolid overlay substrates, such as agarose or carboxymethyl cellulose, have been used to restrict viral spread, preventing indiscriminate infection through the liquid growth medium. Immobilized overlays restrict cellular infection to the immediately surrounding monolayer, allowing the formation of discrete countable foci and subsequent plaque formation. To overcome the difficulties inherent in using traditional overlays, a novel liquid overlay utilizing microcrystalline cellulose and carboxymethyl cellulose sodium has been increasingly used as a replacement in the standard plaque assay. Liquid overlay plaque assays can be readily performed in either standard 6 or 12 well plate formats as per traditional techniques and require no special equipment. Due to its liquid state and subsequent ease of application and removal, microculture plate formats may alternatively be utilized as a rapid, accurate and high throughput alternative to larger scale viral titrations. Use of a non heated viscous liquid polymer offers the opportunity to streamline work, conserves reagents, incubator space, and increases operational safety when used in traditional or high containment labs as no reagent heating or glassware are required. Liquid overlays may also prove more sensitive than traditional&#160;overlays for certain heat labile viruses.

Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

Viral Entschlossenheit Konzentration Durch Plaque-Assays: Mit Tradition und neuen Überzugssysteme

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or localization of a target molecule in cells and tissues. Immunofluorescence relies on the specificity of fluorescent-labelled antibodies against their corresponding antigens within a cell. Both direct and indirect immunofluorescence approaches can be used which rely on the use of antibodies linked with a fluorochrome. Direct immunofluorescence is less frequently used because it provides lower signal, involves higher cost and less flexibility. In contrast, indirect immunofluorescence is more commonly used because of its high sensitivity and provides an amplified signal since more than one secondary antibody can attach to each primary antibody. In this manuscript, both epifluorescence microscopy and confocal microscopy were used to monitor the internalization of human lactoferrin, an important component of the immune system, into hepatic cells. Moreover, we monitored the inhibitory potential of hLF on the intracellular replication of the Hepatitis C virus using immunofluorescence. Both the advantages and disadvantages associated with these approaches are discussed.

The human lactoferrin (hLF) is a component of the immune system. In this study, immunofluorescence assays are used to demonstrate both the hepatocellular uptake of hLF and a qualitative reduction in the hepatitis C virus replication upon treatment with hLF.

Immunfluoreszenz, um die zelluläre Aufnahme von menschlichem Lactoferrin und die damit verbundenen antivirale Aktivität gegen das Hepatitis C Virus-Monitor

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic approach to identify and evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry. In this report, the methods of examining viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion as antiviral assays for such purposes are described, using hepatitis C virus as a model. These assays should be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to early viral entry and help expand the scope of candidate antiviral agents for further drug development.

Here, we present a protocol that examines specific steps of the viral entry to identify and evaluate novel antiviral agents.

Frühe das Eindringen des Virus-Assays für die Ermittlung und Bewertung von antiviralen Verbindungen

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

Qualitative und quantitative Assays zur Detektion und Charakterisierung von Protein Antimikrobielle

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Bewertung der Wirksamkeit und Toxizität von RNAs Targeting HIV-1-Produktion für den Einsatz in Gene oder Arzneimitteltherapie

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst leukocytes and in their non-activated state are constitutively committed to apoptosis. When recruited to inflammatory sites to resolve inflammation, they produce an array of cytotoxic molecules with potent antimicrobial killing. Yet, when these powerful cytotoxic molecules are released in an uncontrolled manner they can damage surrounding tissues. In recent years however, neutrophil versatility is increasingly evidenced, by demonstrating plasticity and immunoregulatory functions. We have recently identified a new neutrophil-derived subpopulation, which develops spontaneously in standard culture conditions without the addition of cytokines/growth factors such as granulocyte colony-stimulating factor (GM-CSF)/interleukin (IL)-4. Their phagocytic abilities of neutrophil remnants largely contribute to increase their size immensely; therefore they were termed giant phagocytes (G&#981;). Unlike neutrophils, G&#981; are long lived in culture. They express the cluster of differentiation (CD) neutrophil markers CD66b/CD63/CD15/CD11b/myeloperoxidase (MPO)/neutrophil elastase (NE), and are devoid of the monocytic lineage markers CD14/CD16/CD163 and the dendritic CD1c/CD141 markers. They also take-up latex and zymosan, and respond by oxidative burst to stimulation with opsonized-zymosan and PMA. G&#981; also express the scavenger receptors CD68/CD36, and unlike neutrophils, internalize oxidized-low density lipoprotein (oxLDL). Moreover, unlike fresh neutrophils, or cultured monocytes, they respond to oxLDL uptake by increased reactive oxygen species (ROS) production. Additionally, these phagocytes contain microtubule-associated protein-1 light chain 3B (LC3B) coated vacuoles, indicating the activation of autophagy. Using specific inhibitors it is evident that both phagocytosis and autophagy are prerequisites for their development and likely NADPH oxidase dependent ROS. We describe here a method for the preparation of this new subpopulation of long-lived, neutrophil-derived phagocytic cells in culture, their identification and their currently known characteristics. This protocol is essential for obtaining and characterizing G&#981; in order to further investigate their significance and functions.

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

We describe here a method for obtaining and identifying a newly characterized subpopulation of neutrophil-derived giant phagocytes. These cells develop in culture from fresh human blood neutrophils, and are characterized by phagocytosis, autophagy, immensely large size, and extended lifespan. This method is essential to further investigate this unique neutrophil-derived subpopulation.

Entwicklung und Identifizierung eines neuen Subpopulation von humanen neutrophilen abgeleiteten Riesen Phagozyten<em&gt; In Vitro</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

Fluoreszenz-basierte Neuraminidase-Inhibitionsassay die Empfänglichkeit der Influenza-Viren an die Neuraminidase-Inhibitor-Klasse von Anti-Virus zu beurteilen

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory response by the endothelial layer is crucial to efficiently fight against harmful inputs and aid in the recovery of damaged areas. When the endothelial cells are exposed to an inflammatory environment, such as the outer component of gram-negative bacteria membrane, lipopolysaccharide (LPS), they express soluble pro-inflammatory cytokines, such as Ccl5, Cxcl1 and Cxcl10, and trigger the activation of circulating leukocytes. In addition, the expression of adhesion molecules E-selectin, VCAM-1 and ICAM-1 on the endothelial surface enables the interaction and adhesion of the activated leukocytes to the endothelial layer, and eventually the extravasation towards the inflamed tissue. In this scenario, the endothelial function must be tightly regulated because excessive or defective activation in the leukocyte recruitment could lead to inflammatory-related disorders. Since many of these disorders do not have an effective treatment, novel strategies with a focus on the vascular layer must be investigated. We propose comprehensive assays that are useful to the search of novel endothelial regulators that modify leukocyte function. We analyze endothelial activation by using specific expression targets involved in leukocyte recruitment (such as, cytokines, chemokines, and adhesion molecules) with several techniques, including: real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), western-blot, flow cytometry and adhesion assays. These approaches determine endothelial function in the inflammatory context and are very useful to perform screening assays to characterize novel endothelial inflammatory regulators that are potentially valuable for designing new therapeutic strategies.

Vascular endothelium tightly controls leukocyte recruitment. Inadequate leukocyte extravasation contributes to human inflammatory diseases. Therefore, searching for novel regulatory elements of endothelial activation is necessary to design improved therapies for inflammatory disorders. Here, we describe a comprehensive methodology to characterize novel endothelial regulators that can modify leukocyte trafficking during inflammation.

Screening-Assays zur Charakterisierung neuartiger endothelialer Regulators der entzündlichen Reaktion beteiligt

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

Schnelle, sichere und einfache manuelle am Krankenbett Nukleinsäure-Extraktion für den Nachweis des Virus in Vollblut-Proben

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying gene expression related to biological processes of interest. These innovations not only allow researchers to observe expression from the mRNA sequences that code for genes that effect cellular function, but also the non-coding RNA (ncRNA) molecules that remain untranslated, but still have regulatory functions. Although researchers have the ability to observe both mRNA and ncRNA expression, it has been customary for a study to focus on one or the other. However, when studies are interested in both mRNA and ncRNA expression, many times they use separate samples to examine either coding or non-coding RNAs due to the difference in library preparations. This can lead to the need for more samples which can increase time, consumables, and animal stress. Additionally, it may cause researchers to decide to prepare samples for only one analysis, usually the mRNA, limiting the number of biological questions that can be investigated. However, ncRNAs span multiple classes with regulatory roles that effect mRNA expression. Because ncRNA are important to fundamental biologic processes and disorder of these processes in during infection, they may, therefore, make attractive targets for therapeutics. This manuscript demonstrates a modified protocol for the generation mRNA and non-coding RNA expression libraries, including viral RNA, from a single sample of whole blood. Optimization of this protocol, improved RNA purity, increased ligation for recovery of methylated RNAs, and omitted&#160;size selection, to allow capture of more RNA species.

Here, we present a protocol optimized for the processing of coding (mRNA) and non-coding&#160;(ncRNA) globin reduced RNA-seq libraries from a single whole blood sample.

Identifizierung der Codierung und nicht-kodierende RNA-Klassen ausgedrückt bei Schweinen Vollblut

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...