Dieses Protokoll ist wichtig, weil es den Vergleich der Mikrovaskulatur zwischen verschiedenen Regionen des zentralen Nervensystems sowie zwischen verschiedenen Individuen ermöglicht. Diese Mikrogefäßisolationstechnik kann innerhalb eines einzigen Tages abgeschlossen werden und macht ultrazentrifugation und enzymatische Dissoziation überflüssig. Das Entfernen der Meninges und des Aderhautplexus kann schwierig sein.
Achten Sie darauf, langsam und sorgfältig zu arbeiten, um die vollständige Entfernung jedes Gewebes zu gewährleisten. Für die ZNS-Gewebesektion aus einer kleinen lissenzephalen Wirbeltierprobe, legen Sie das geerntete Gehirn in eine 15 Milliliter konische Röhre mit MV-1-Lösung auf Eis, und verwenden Sie Zangen, um die Hypophyse aus der Sellaturcica des Schädels zu holen. Legen Sie die Hypophyse in einem 1,7 Milliliter Mikrozentrifugenrohr der MV-1-Lösung auf Eis, und entfernen Sie die Haut und den Muskel, um die Wirbelsäule freizulegen.
Nach dem Entfernen der Gliedmaßen, des Brustkorbs und der inneren Organe verwenden Sie eine 10-Milliliter-Spritze, die mit einer 18-Meter-Nadel ausgestattet ist, um die Wirbelsäule mit frischer MV-1-Lösung in kaudaler bis rostraler Richtung im gesamten Lendenwirbelforamen zu spülen. Dann legen Sie das Rückenmark in eine 5 Milliliter Tube mit frischer MV-1-Lösung. Als nächstes legen Sie das Gehirn in eine Petrischale unter dem Sezieren Mikroskop, und entfernen Sie die Meninges mit doppelzackigen Stachel.
Achten Sie darauf, das Rückenmark zu überprüfen, um sicherzustellen, dass keine Stücke von Meningen übrig bleiben. Verwenden Sie die Zange, um den Hypothalamus, Kleinhirn, Hirnstamm und Kortex zu trennen. Verwenden Sie bei Bedarf Zangen und Iris und Federscheren, um die Olfaktor-Lampen und Thalamus zu verbrauchen, und verwenden Sie den doppelzackigen Stachel, um den gesamten Aderhautplexus aus allen Hirnkammern zu entfernen.
Für Die ZNS-Gewebesektion aus einer großen gyrencephalen Wirbeltierprobe verwenden Sie ein Sezieren des Mikroskops und einen doppelzackigen Stich, Zangen und Iris- und Federscheren, um die Hirnhäute aus jedem ZNS-Gewebe zu entfernen, wobei darauf geachtet wird, alle Stücke des Aderhautplexus aus den Hirnkammern zu entfernen. Zur Homogenisierung des geernteten ZNS-Gewebes wird jede ZNS-Region in einzelnen Petrischalen in ein bis zwei Millimeter zerkleinert. Um ZNS-Gewebe aus kleinen Wirbeltierproben zu homogenisieren, verwenden Sie eine Transferpipette, um einen Milliliter MV-1-Lösung hinzuzufügen, um das gehackte Gewebe zu suspendieren.
Verwenden Sie dann die gleiche Transferpipette, um den Kortex, Kleinhirn, Hirnstamm, Sehlappen und Rückenmarksstücke in einzelne 10 Milliliter Glasgewebeschleifer zu verteilen, und verwenden Sie einen PTFE-Stößel und fünf Milliliter MV-1-Lösung, um jeden Satz Gewebe für etwa 10 Striche zu mahlen. Übertragen Sie jede Gewebeschlämme in einzelne 15 Milliliter konische Röhren auf Eis, und verwenden Sie Zangen, um den Hypothalamus und die Hypophyse in 100 Mikroliter MV-1-Lösung, in einzelnen 1,7 Milliliter-Röhren zu platzieren. Dann, sorgfältig homogenisieren jedes Gewebe mit einem Glas Mikropestle.
Um eine große Wirbeltierprobe zu homogenisieren, verwenden Sie eine abgeschrägte Geschnittentransferpipette, um das gehackte Gewebe auf einen 55-Milliliter-Glasgewebeschleifer zu übertragen, und befestigen Sie den Schleifer an einem Oberrührer. Fügen Sie die Hälfte des empfohlenen Volumens der MV-1-Lösung entsprechend dem in der Tabelle angegebenen zwiesigen ZNS-Teil hinzu, und schalten Sie den Overheadrührer auf ca. 150 Umdrehungen pro Minute ein. Bewegen Sie das Glasrohr vorsichtig für ca. 30 Sekunden nach oben und unten, bevor Sie den Oberrührer ausschalten, um weitere MV-1-Lösung für eine zusätzliche Homogenisierung hinzuzufügen, bis eine homogene Gülle erhalten ist.
Dann das homogenisierte Gewebe auf ein 50 Milliliter konisches Rohr auf Eis übertragen. Zur Mikrogefäßreinigung wird das ZNS-Gewebe durch Zentrifugation homogenisiert und die Überstande entsorgt. Für eine kleine Wirbeltier-Mikrogefäßisolierung, Pipette die Kortex, Kleinhirn, Hirnstamm, Optiklappen und Rückenmarkspellets, in fünf Milliliter frische, eiskalte MV-2-Lösung pro Probe, etwa 10 Mal, bevor fünf weitere Milliliter eiskalte MV-2-Lösung zu jeder Röhre hinzugefügt.
Drehen Sie die Rohre vorsichtig um, um sie zu mischen, und hängen Sie den Hypothalamus und die Hypophysenpellets in einem Milliliter MV-2-Lösung wieder auf. Für die Isolierung von großen Wirbeltieren fügen Sie 20 Milliliter eiskalte MV-2-Lösung in die Kortex-, Kleinhirn-, Hirnstamm- und Rückenmarksmikrovessel-Pellets ein und hängen Sie die Pellets in einem Röhrenrevolver mit 40 Umdrehungen pro Minute für etwa 5 Minuten wieder auf. Am Ende der Wiedersuspension, trennen Sie die ZNS-Gewebelykate durch Zentrifugation, und drehen Sie langsam jedes Rohr, damit der Überstand entlang der Wand passieren kann, um die dicke und dichte Myelinschicht an der flüssigen Schnittstelle vorsichtig von den Rohrwänden zu lösen.
Entsorgen Sie die Myelin- und Flüssigkeitsschnittstellen, und bauchen Sie die Innenwand jedes Rohres mit einem Spachtel, der mit einem papierarmen Papiertuch umwickelt ist. Verwenden Sie dann ein verdrehtes Low-Lint-Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit zu absorbieren, und verwenden Sie niedrigbindende Spitzen, um jedes Pellet in einem Milliliter MV-3-Lösung wieder aufzuhängen. Für die Mikrogefäßelution und Filtration, mischen Sie ein paar Milliliter frische MV-3-Lösung zu jeder CNS-Gewebe-Mikrogefäß-Schlämme, und während des Mischens, um Aggregate zu vermeiden, jede Suspension durch ein Pruitt-Sieb in einzelne 50 Milliliter konische Röhren zu dehnen.
Legen Sie einen 20 Mikrometer Nylonnetzfilter auf einen modifizierten Filterhalter pro ZNS-Region. Übertragen Sie den Filterhalter auf ein 50 Milliliter Konikonrohr und befeuchten Sie den Filter mit fünf Millilitern eiskalter MV-3-Lösung, um sicherzustellen, dass der Puffer den Filterhalter heruntergießt, in das konische Rohr. Übertragen Sie die eluierten Mikrogefäße auf jeden 20 Mikrometer Nylonnetzfilter und spülen Sie die Mikrogefäße mit fünf bis zehn Millilitern eiskalter MV-3-Lösung.
Verwenden Sie Zangen, um jeden Filter in einzelne Becher zu übertragen, die die eiskalte MV-3-Lösung enthalten, und schütteln Sie jeden Filter vorsichtig für etwa 30 Sekunden, um die Mikrogefäße zu lösen. Nach der Übertragung auf ein 15 Milliliter konisches Rohr, sammeln Sie die Mikrogefäße durch Zentrifugation, und verwenden Sie eine niedrig bindende Pipette, um jedes Pellet in einem Milliliter eiskalten MV-3-Lösung wieder aufzuhängen. Dann transferieren Sie Mikrogefäßsuspensionen von kleinen Wirbeltierproben in ein 1,7 Milliliter Mikrozentrifugenrohr zur Zentrifugation für fünf Minuten bei 20.000 mal G, bei vier Grad Celsius.
Bei großen Wirbeltierproben die Suspension in einzelne Fünf-Milliliter-Zentrifugenröhren übertragen und vier Milliliter MV-3-Lösung für die Zentrifugation für fünf Minuten bei 2 000 mal G bei vier Grad Celsius hinzufügen. Die intrinsischen Komponenten der neurovaskulären Einheit können in Mikrogefäßen, wie gezeigt, durch Immunkennzeichnung für CD31, PDGFR-beta und Aquaporin vier, einschließlich der kortikalen, Kleinhirn, Hypophyse, Hypothalamus, Hirnstamm und Spinalmikrogefäße nachgewiesen werden. Ebenso kann die Expression von Adhäsions-Junction-Protein VE-Cadherin, engen Knotenproteinen CLDN5 und Zonula Occludens-1, trizellulärem Junction-Protein Angulin-1 und Basalmarken Chemokinligand CXCL-Motiv 12 und Gamma-Glutamyltransferase-1 visualisiert werden.
Darüber hinaus ist die Mehrheit der Mikrogefäße frei von der Expression von Alpha-Glattmuskel-Actin, was darauf hindeutet, dass dieses Isolationsprotokoll selektiv auf kleinkalibrige Mikrogefäße abzielt. Mikrogefäße, die von anderen kleinen lissenzephalen Wirbeltieren wie Vogel, Liard, Frosch und Fisch gewonnen werden, teilen einige morphologische Merkmale, was darauf hindeutet, dass diese Methode für die weitere Charakterisierung von Unterschieden in neurovaskulären Einheiten zwischen Denspezies nützlich ist. Die Quantifizierung der Veränderungen der Proteinexpression zeigt eine Zunahme des Vaskulärenadhäsionsmoleküls eins und des junctionalen Adhäsionsmoleküls B entlang der Mikrogefäße des Rückenmarks während des Höhepunkts der experimentellen Autoimmunenzephalomyelitis.
Jedoch, Vaskuläre Zelladhäsion Molekül einist auch deutlich in Hypophysen Mikrogefäße erhöht, und in der Hypothalamus und Gehirnstamm Mikrogefäße verringert. Darüber hinaus werden Veränderungen im Vaskulärenzelladhäsionsmolekül eine Expression bei chronischer experimenteller Autoimmunenzephalomyelitis in allen ZNS-Geweben und bei der junctionalen Adhäsionsmolekül-B-Expression in den Hypothalamus- und Hypophysenmikrogefäßen beobachtet. Quantitative Analysen wie Western Blot, PCR und Immunhistochemie können nach diesem Verfahren durchgeführt werden, um Einblicke in Gen- und Proteinexpressionsmuster innerhalb der Blut-Hirn-Schranke zu gewinnen.
Paraformaldehyd ist ein akut toxisches Reagenz und sollte immer unter der Dunstabzugshaube behandelt werden, während sie die richtige PSA tragen.
