Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Institutes of Health (R01-NS084941) und die Arizona biomedizinische Forschungskommission (ADHS16-162406), PTR. WA erhielt vorbei an Unterstützung von Pre-doc Termin für eine nationale Institute der Gesundheit Ausbildung Grant (T32-HL007249).

Alle unten beschriebene Verfahren durch eine institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) genehmigt worden und entsprechen den National Institutes of Health (NIH) und Animal Research: In Vivo Experimente (Ankunft) Richtlinien zum Berichten. Der verfahrenstechnische Ablauf für das Protokoll ist in Abbildung 1dargestellt.
1. Set-up für das Verfahren
<ol><li>Bereiten Sie den Gehirn kapilläre Puffer (BMB). Starten Sie durch mit einem Gewicht von 54,66 g D-Mannit, 1,90 g EGTA und 1,46 g 2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (d. h. Tris) Basis in ein sauberes Becherglas. 1,0 L entionisiertem Wasser hinzufügen. Mischen Sie die Komponenten des Puffers BMB mit einem Magnetrührer. Sobald die Lösung gründlich vermischt worden ist, passen Sie den pH auf 7,4 mit 1,0 M HCl.</li>
	<li>Bereiten Sie 26 % Dextran (75.000 MW) Lösung (w/V) vor der Tiere zu betäuben. Bereiten Sie die Dextran-Lösung, wie in den folgenden Schritten beschrieben. Hinweis: Es ist von entscheidender Bedeutung, diese Lösung vor der Zeit vorzubereiten, da Dextran aufzulösen in wässrigen Puffer ca. 1,5-2 h dauern kann.<ol>
<li>Die pulverförmigen Dextran (26 g pro 100 mL Puffer) in ein sauberes Becherglas abwiegen.</li>
		<li>Das entsprechende Volumen der BMB abmessen und in eine separate, sauberes Becherglas zu verzichten.</li>
		<li>Gießen Sie langsam BMB in das Becherglas mit pulverförmigen Dextran. Manuell mischen Sie die pulverisierte Dextran in Gießen von BMB mit einem Glasstab umrühren.</li>
		<li>Anpassen des pH-Werts 7,4 mit 1,0 M HCl unmittelbar vor, zu verwenden. Hinweis: Eine typische Isolation des Gehirns mikrogefäßen aus 12 einzelnen Sprague-Dawley Ratten (männlich oder weiblich; 3 Monate alt, 200-250 g) 200 mL Dextran-Lösung (d. h. 52 g Dextran in 200 mL BMB) erfordert.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Gewinnung von Hirngewebe aus Sprague-Dawley Ratten
<ol><li>Nach der gewünschten experimentelle Behandlung betäuben Sprague-Dawley Ratten mit Ketamin (50 mg/kg; 2,5 mL/kg kg i.p.) und Xylazin (10 mg/mL; 2,5 mL/kg I, p.). Verdünnen Sie Ketamin und Xylazin in 0,9 % Kochsalzlösung zur endgültigen Konzentrationen von 20 mg/mL und 4,0 mg/mL bzw.. Einschläfern von Tieren durch Enthauptung mit einem geschärften Guillotine nach IACUC Richtlinien. Verwenden Sie das gleiche Verfahren für sowohl weibliche als auch männliche Sprague-Dawley Ratten.</li>
	<li>Resezieren Sie die Haut von der Ratte-Schädel mit einem quer-Schnitt mit einer chirurgischen Schere.</li>
	<li>Mit Rongeurs, sorgfältig entfernen Sie die schädelplatte und setzen Sie des Gehirns aus.</li>
	<li>Entfernen Sie das Gehirn mit einem Spachtel. Lösen Sie das Großhirn und legen Sie das isolierte Hirngewebe in ein 50 mL konische Röhrchen mit 5 mL der BMB. Fügen Sie 1,0 μL der Protease-Inhibitor cocktail pro 1,0 mL BMB Puffer unmittelbar vor Gebrauch.</li>
</ol>(3) Gehirn Verarbeitung
<ol><li>Übertragen Sie das Hirngewebe aus dem 50 mL konische Röhrchen auf eine saubere Petrischale.</li>
	<li>Rollen Sie mit Pinzette, vorsichtig das Gehirn auf 12,5 cm Durchmesser Filterpapier äußeren Hirnhaut zu entfernen, die Lose der Großhirnrinde eingehalten werden. Sanft drücken Sie das Hirngewebe gegen Filterpapier und Rollen Sie das Gewebe wieder. Schalten Sie das Filterpapier häufig während dieser Schritt.</li>
	<li>Der zerebralen Hemisphären mit Pinzette trennen Sie choroid Plexus. Hinweis: Das choroid Plexus erscheint als eine klare häutigen Gewebe an die Oberfläche der zerebralen Ventrikel lokalisiert.</li>
	<li>Sanft glätten Sie das Hirngewebe und entfernen Sie verbleibenden Meningen und olfaktorischen Birnen mit Pinzette.</li>
	<li>Legen Sie die kortikalen Hirngewebe in ein gekühltes Glas-Mörtel. Der Mörtel 5,0 mL BMB enthaltenden Proteaseinhibitor cocktail hinzufügen.</li>
	<li>Mit einer Oberleitung Homogenisator, Homogenisieren Sie das Hirngewebe mit 15 nach oben und unten Schlaganfälle bei 3.700 u/min. Führen Sie Homogenisierung mit 10 mL Mörser und Stößel-Gewebe-Mahlwerk. Zwischen jeder einzelnen Probe Homogenisierung reinigen Sie die Stößel mit 70 % Ethanol. Hinweis: Homogenisierung Striche in Bezug auf Tempo entsprechen müssen und Größenordnung.</li>
	<li>Gießen Sie das Homogenat in beschrifteten Zentrifuge Röhren.</li>
</ol>4. Zentrifugation Schritte
<ol><li>Jede beschriftete Zentrifugenröhrchen mit Gehirn Homogenat fügen Sie 8,0 mL 26 % Dextran-Lösung hinzu.</li>
	<li>Invertieren die Röhre zweimal und dann gründlich Wirbel der Probe. Führen Sie den Vortexen jeder Probe mit mehreren Winkeln, gewährleisten eine gute Durchmischung des Gehirns Homogenat Lösung mit 26 % Dextran-Lösung.</li>
	<li>Zentrifuge Proben bei 5.000 X g für 15 min bei 4 ° C. Hinweis: Für einige Analysen ist es sinnvoll, Gehirn mikrogefäßen mit in Anwesenheit von vergleichen. Die Beurteilung der Proteinexpression in Anwesenheit von sein sollte kann erforderlich, überstand aus dieser Zentrifugationsschritt (z. B. Gehirn parenchymatösen Bruch) werden gesammelt und bei-80 ° C für eine spätere Verwendung gespeichert.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand mit einer Vakuum-Sauger und Glas Pasteurpipette. Hinweis: Vorsicht muss genommen werden, um die Pellets nicht zu stören. Andernfalls wird Menge an das Gehirn mikrogefäßen gesammelt die verringert deutlich der Proteinausbeute aus diesem Verfahren reduziert werden.</li>
	<li>Das Pellet in 5,0 mL BMB enthaltenden Proteaseinhibitor cocktail (d. h. 1,0 μl Protease-Inhibitor cocktail pro 1,0 mL BMB Puffer) aufzuwirbeln. Wirbel der Pellet um gute Durchmischung zu gewährleisten.</li>
	<li>8,0 mL 26 % Dextran hinzu kommen jedem Zentrifugenröhrchen und Wirbel wie 4.1-4.2 dieses Protokolls beschrieben.</li>
	<li>Zentrifuge Proben bei 5.000 X g für 15 min bei 4 ° C.</li>
	<li>Mit einer Thermoskanne und Glaspipette, Aspirieren überstand und stellen Sie sicher, dass Pellet mit Gehirn kapilläre nicht gestört wird. Hinweis: Überschüssige Material, das an der Rohrwand gehalten hat mikrogefäßen nicht enthalten und sollten sorgfältig gereinigt und entfernt.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritte 4,5 bis 4,8 eine zusätzliche zwei Mal.</li>
	<li>Einmal 4 Dextran Zentrifugation Schritte abgeschlossen wurden, 5,0 mL BMB zu jeder Pellet und Wirbel um die Probe erneut hinzufügen. Hinweis: Nach Abschluss von Schritt 4.10, können ganze mikrogefäßen für Analyse von Protein-Lokalisierung gesammelt werden. Dies kann erreicht werden, indem man eine 50 μL aliquoten neu suspendierten kapilläre Pellet und Verschmieren auf einen Glas-Objektträger. Mikrogefäßen sind dann Hitze fixiert, bei 95 ° C für 10 min auf einem Heizblock gefolgt von Fixierung in eiskaltem Ethanol für eine zusätzliche 10 min. Rutschen dann bei 4 ° C bis zur bildgebenden Verfahren erforderlich gespeichert werden können.</li>
</ol>5. Ultrazentrifugation, Proben von insgesamt mikrovaskuläre Hirnhäute vorzubereiten
<ol><li>Übertragen Sie Proben auf den gekühlten Glas-Homogenisator.</li>
	<li>Mit einer Oberleitung Homogenisator, Homogenisieren Sie Hirngewebe mit 8-10 nach oben und unten Schlaganfälle bei 3.000 u/min. Homogenisierung erfolgt mittels einer 10 mL-Mörser und Stößel Gewebe-Schleifmaschine. Reinigen Sie den Stößel mit 70 % Ethanol nach Homogenisierung jeder einzelnen Probe.</li>
	<li>Übertragen Sie Proben Ultrazentrifugen Rohre zu reinigen. Nummer und wiegen jedes einzelne Rohr. Auszugleichen und die Rohre vor der Verladung in den Ultrazentrifugen Rotor zu koppeln. Hinweis: Alle wiegen und Paarung von Ultrazentrifugen Rohre müssen mit den Kappen auf durchgeführt werden um genaue Messung der Röhre Gewichte zu gewährleisten.</li>
	<li>Zentrifuge Proben bei 150.000 X g für 1 h bei 4 ° C.</li>
	<li>Mit einer Thermoskanne und Glas Pasteurpipette, Aspirieren überstand mit sorgen die Kapillare Membran Pellet zu stören.</li>
	<li>Basierend auf der Größe der Pellets, fügen Sie eine entsprechende Volumen der Puffer speichern, die im Verhältnis 1:1 (V/V) von entionisiertem Wasser und BMB besteht. Pellets sind in der Regel in 400-500 μL der Puffer speichern Nukleinsäuretablette. Der Speicher-Puffer in einem Verhältnis von 1,0 μl pro 1,0 mL Puffer speichern Protease Inhibitor Cocktail hinzufügen.</li>
	<li>Vortex Proben zu Pellets im Puffer speichern aufzuwirbeln.</li>
	<li>Mit ein Glas Pasteurpipette übertragen Sie Kapillare Membran Proben zu einem beschrifteten 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.</li>
	<li>Pass-Probe durch eine Nadel Spritze 5 X, damit die Probe gut durchmischt ist und keine zelluläre Aggregate vorhanden sind.</li>
	<li>Speichern Sie die Proben bei-80 ° C bis zur Analyse erforderlich. Hinweis: Proteingehalt der Samples kapilläre Membran bemisst sich nach der Methode von Bradford.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rolfe, D. F., Brown, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+energy+utilization+and+molecular+origin+of+standard+metabolic+rate+in+mammals.">Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals.</a> Physiol Rev. 77 (3), 731-758 (1997).</li><li>Brzica, H., Abdullahi, W., Ibbotson, K., Ronaldson, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Transporters+in+Central+Nervous+System+Drug+Delivery+and+Blood-Brain+Barrier+Protection:+Relevance+to+Treatment+of+Stroke.">Role of Transporters in Central Nervous System Drug Delivery and Blood-Brain Barrier Protection: Relevance to Treatment of Stroke.</a> J Cent Nerv Syst Dis. 9, 1179573517693802 (2017).</li><li>Ronaldson, P. T., Davis, T. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor-beta+signaling+alters+substrate+permeability+and+tight+junction+protein+expression+at+the+blood-brain+barrier+during+inflammatory+pain.">Transforming growth factor-beta signaling alters substrate permeability and tight junction protein expression at the blood-brain barrier during inflammatory pain.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1084-1098 (2009).</li><li>Seelbach, M. J., Brooks, T. A., Egleton, R. D., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+inflammatory+hyperalgesia+modulates+morphine+delivery+to+the+brain:+a+role+for+P-glycoprotein.">Peripheral inflammatory hyperalgesia modulates morphine delivery to the brain: a role for P-glycoprotein.</a> J Neurochem. 102 (5), 1677-1690 (2007).</li><li>Ronaldson, P. T., Finch, J. D., Demarco, K. M., Quigley, C. E., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+pain+signals+an+increase+in+functional+expression+of+organic+anion+transporting+polypeptide+1a4+at+the+blood-brain+barrier.">Inflammatory pain signals an increase in functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier.</a> J Pharmacol Exp Ther. 336 (3), 827-839 (2011).</li><li>Pop, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+brain+injury+alters+the+blood-brain+barrier+phenotype+in+parallel+with+beta-amyloid+and+cognitive+changes+in+adulthood.">Early brain injury alters the blood-brain barrier phenotype in parallel with beta-amyloid and cognitive changes in adulthood.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 33 (2), 205-214 (2013).</li><li>Thompson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia/reoxygenation+stress+signals+an+increase+in+organic+anion+transporting+polypeptide+1a4+(Oatp1a4)+at+the+blood-brain+barrier:+relevance+to+CNS+drug+delivery.">Hypoxia/reoxygenation stress signals an increase in organic anion transporting polypeptide 1a4 (Oatp1a4) at the blood-brain barrier: relevance to CNS drug delivery.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 34 (4), 699-707 (2014).</li><li>Tome, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P-glycoprotein+traffics+from+the+nucleus+to+the+plasma+membrane+in+rat+brain+endothelium+during+inflammatory+pain.">P-glycoprotein traffics from the nucleus to the plasma membrane in rat brain endothelium during inflammatory pain.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 36 (11), 1913-1928 (2016).</li><li>Slosky, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetaminophen+modulates+P-glycoprotein+functional+expression+at+the+blood-brain+barrier+by+a+constitutive+androstane+receptor-dependent+mechanism.">Acetaminophen modulates P-glycoprotein functional expression at the blood-brain barrier by a constitutive androstane receptor-dependent mechanism.</a> Mol Pharmacol. 84 (5), 774-786 (2013).</li><li>Artus, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Wnt/planar+cell+polarity+signaling+pathway+contributes+to+the+integrity+of+tight+junctions+in+brain+endothelial+cells.">The Wnt/planar cell polarity signaling pathway contributes to the integrity of tight junctions in brain endothelial cells.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 34 (3), 433-440 (2014).</li><li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+exposure+to+ethanol+downregulates+tight+junction+proteins+through+the+protein+kinase+Calpha+signaling+pathway+in+human+cerebral+microvascular+endothelial+cells.">Long-term exposure to ethanol downregulates tight junction proteins through the protein kinase Calpha signaling pathway in human cerebral microvascular endothelial cells.</a> Exp Ther Med. 14 (5), 4789-4796 (2017).</li><li>Abdullahi, W., Brzica, H., Ibbotson, K., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+protein-9+increases+the+functional+expression+of+organic+anion+transporting+polypeptide+1a4+at+the+blood-brain+barrier+via+the+activin+receptor-like+kinase-1+receptor.">Bone morphogenetic protein-9 increases the functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier via the activin receptor-like kinase-1 receptor.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 37 (7), 2340-2345 (2017).</li><li>Mesev, E. V., Miller, D. S., Cannon, R. 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M., Decleves, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+drug+transporters+at+the+blood-brain+barrier+using+an+optimized+isolated+rat+brain+microvessel+strategy.">Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy.</a> Brain Res. 1134 (1), 1-11 (2007).</li><li>McCaffrey, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+junctions+contain+oligomeric+protein+assembly+critical+for+maintaining+blood-brain+barrier+integrity+in+vivo.">Tight junctions contain oligomeric protein assembly critical for maintaining blood-brain barrier integrity in vivo.</a> J Neurochem. 103 (6), 2540-2555 (2007).</li><li>Brzica, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+liver+and+kidney+expression+of+sulfate+anion+transporter+sat-1+in+rats+exhibits+male-dominant+gender+differences.">The liver and kidney expression of sulfate anion transporter sat-1 in rats exhibits male-dominant gender differences.</a> Pflugers Arch. 457 (6), 1381-1392 (2009).</li><li>Ronaldson, P. T., Bendayan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+viral+envelope+glycoprotein+gp120+produces+oxidative+stress+and+regulates+the+functional+expression+of+multidrug+resistance+protein-1+(Mrp1)+in+glial+cells.">HIV-1 viral envelope glycoprotein gp120 produces oxidative stress and regulates the functional expression of multidrug resistance protein-1 (Mrp1) in glial cells.</a> J Neurochem. 106 (3), 1298-1313 (2008).</li><li>Pustylnikov, S., Sagar, D., Jain, P., Khan, Z. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+C-type+lectins-mediated+host-pathogen+interactions+with+dextran.">Targeting the C-type lectins-mediated host-pathogen interactions with dextran.</a> J Pharm Pharm Sci. 17 (3), 371-392 (2014).</li><li>Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development,+maintenance+and+disruption+of+the+blood-brain+barrier.">Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier.</a> Nat Med. 19 (12), 1584-1596 (2013).</li><li>Abdullahi, W., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Expression+of+P-glycoprotein+and+Organic+Anion+Transporting+Polypeptides+at+the+Blood-Brain+Barrier:+Understanding+Transport+Mechanisms+for+Improved+CNS+Drug+Delivery?.">Functional Expression of P-glycoprotein and Organic Anion Transporting Polypeptides at the Blood-Brain Barrier: Understanding Transport Mechanisms for Improved CNS Drug Delivery?.</a> AAPS J. 19 (4), 931-939 (2017).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

In diesem Artikel wird eine einfache und effektive Methode der Membrane Protein Probenvorbereitung von mikrogefäßen frisch von Ratte Gehirngewebe isoliert beschrieben. In der Literatur13,20,21,22 wurden mehrere Ansätze zur Isolierung der Ratte Gehirn mikrogefäßen oder Generierung von Membran-Zubereitungen aus isolierten Microvasculature gemeldet. , 24. zw...

Die Blut - Hirn-Schranke (BBB) ist an der Schnittstelle zwischen dem zentralen Nervensystem (ZNS) und die systemische Zirkulation vorhanden und spielt eine wesentliche Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase des Gehirns. Insbesondere die BBB-Funktionen, um präzise Kontrolle gelösten Konzentrationen im Gehirn extrazellulären Flüssigkeit und effizient diese Nährstoffe liefern, die von Hirngewebe benötigt werden, um die erheblichen metabolischen Anforderungen der CNS1zu erfüllen. Diese Rollen implizieren, dass die BBB, die in erster Linie auf der Ebene der mikrovaskuläre Endothelzellen existiert, diskrete Mechanismen besitzen muss, die es einige Substanzen in Anwesenheit von ermöglichen gleichzeitig sicherstellen, dass potenziell schädliche XENOBIOTIKA können nicht zugreifen akkumulieren. In der Tat Gehirn mikrovaskuläre Endothelzellen sind nicht gefenstert und begrenzten Pinozytose, sorgt für einen Mangel an nicht-selektive Durchlässigkeit2weisen. Darüber hinaus äußern Gehirn kapilläre Endothelzellen engen Kreuzung und Adherens Junction Proteine, die handeln in Form eine körperlichen "Siegel" zwischen benachbarten endothelial Zellen und parazellulär Diffusion von Blut übertragbare Substanzen ins Gehirn stark einschränken Parenchym. In der Tat erfordert selektive Durchlässigkeit der endogene und exogene Stoffe funktionelle Expression von Aufnahme und Efflux-Transporter3. Insgesamt, engen Kreuzungen, Adherens Junctions und Transportern arbeiten gemeinsam, um die einzigartige Barriereeigenschaften der BBB zu pflegen.
Die BBB ist eine dynamische Barriere, die auf physiologischen, pathophysiologischen und pharmakologische Reize reagiert. Z. B. Hypoxie/flussbettfilters Stress erwiesenermaßen modulieren Ausdruck der kritischen tight Junction-Proteine (z.B. occludin, Zonulae Occluden-1 (ZO-1)), die erhöhte parazellulär Durchlässigkeit für solche vaskuläre Marker zugeordnet ist als Saccharose4,5,6. Ähnliche Beobachtungen wurden an der BBB in der Umgebung von Schädel-Hirn-Verletzung-7 und peripheren entzündliche Schmerzen8,9. Diese gleichen Krankheiten können auch Transportmechanismen an der BBB10,11,12,13,14modulieren. In der Tat, Hypoxie/flussbettfilters Verletzungen verbessert funktionelle Expression von Bio Anion Transport Polypeptid 1a4 (Oatp1a4) an der BBB führen kann zu einem signifikanten Anstieg in der Blut-Hirn-Transport von bestimmten Oatp Transport Substrate wie Taurocholate und Atorvastatin13. BBB-Eigenschaften können auch durch Pharmakotherapie selbst, einen Mechanismus geändert werden, die eine Grundlage für beide tief greifende Veränderungen in der Wirksamkeit der Droge im Gehirn und Wechselwirkungen bilden können. Z.B. Paracetamol Ziele nuklearen Rezeptoren Signalisierung Mechanismen im Gehirn der mikrovaskuläre Endothelzellen, erhöht die funktionelle Expression der kritischen Efflux-Transporter P-Glykoprotein (P-Gp), und ändert zeitabhängige Analgesie Übertragen von Morphin, transportieren ein opioid-Analgetikum und etablierten P-Gp Substrat15. Ein gründliches Verständnis der BBB-Änderungen, die durch Krankheiten oder durch Drogen induziert werden kann, erfordert auch die Identifizierung und Charakterisierung der spezifischen regulatorischen Mechanismen, die diese Änderungen zu kontrollieren. In der Tat, diskrete Signalwege wurden im Gehirn mikrovaskuläre Endothelzellen, die Steuern, die molekulare Ausdruck der engen Kreuzung Proteine16,17 und Transporter15, 18,19. Zusammengenommen zeigen diese Beobachtungen, dass komplexe Molekulare Signalwege in der Verordnung von BBB tight Junctions und Transporter in Gesundheit und Krankheit beteiligt sind.
Eine große Herausforderung in der Studie der BBB ist die absolute Voraussetzung für eine einfache und effektive Methode zur Isolierung von mikrogefäßen aus Hirngewebe von Versuchstieren und anschließende Aufbereitung der Membran Proben abgeleitet. Diese Proben müssen vorbereitet werden, so dass sie sowohl im Gehirn mikrovaskuläre Endothelzellen angereichert und in Anwesenheit von anderen Zelltypen begrenzt. In den vergangenen Jahren wurden mehrere Methoden zur Isolierung von Microvasculature von Nagetier Gehirn in der wissenschaftlichen Literatur13,20,21,22beschrieben. Dieser Artikel beschreibt eine einfache, robuste, und reproduzierbare Methode zur Isolierung von mikrogefäßen aus rattengehirn und zur Vorbereitung von endothelialen Membran angereicherten Proben, die für die Analyse der Proteinexpression verwendet werden können. Vorteil dieses Protokolls kapilläre Isolierung ist die Fähigkeit, eine einzelne Versuchstier Probe Vorbereitungen von hoher Qualität und mit ausreichend Proteinausbeute einzuholen. Dies ermöglicht die Berücksichtigung der Inter Tier Variabilität der Proteinexpression. Solch ein Fortschritt in diesem Protokoll hat die Robustheit des BBB Studien erheblich verbessert, weil Überbewertung oder Unterbewertung das wahre Ausmaß der Protein Veränderungen an der BBB jetzt vermieden werden kann. Darüber hinaus ermöglicht die Aufnahme von mehreren Schritten der Zentrifugation mit Dextran verbesserte Anreicherung von mikrogefäßen im experimentellen Proben und erleichtert die Entfernung von unerwünschten zelluläre Bestandteile wie Neuronen.

<table><tbody><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#P8340</td><td>Component of brain microvessel buffer</td></tr><tr><td>D-mannitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#M4125</td><td>Component of brain microvessel buffer</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#E3889</td><td>Component of brain microvessel buffer</td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#T1503</td><td>Component of brain microvessel buffer</td></tr><tr><td>Dextran (MW 75,000)</td><td>Spectrum Chemical Mftg Corp</td><td>#DE125</td><td>Dextran used in centrifugation steps to separate microvessels from brain parenchyma</td></tr><tr><td>Zetamine</td><td>MWI Animal Health</td><td>#501072</td><td>General anesthetic</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Western Medical Supply</td><td>#5530</td><td>General anesthetic</td></tr><tr><td>0.9% saline solution</td><td>Western Medical Supply</td><td>N/A</td><td>General anesthetic diluent</td></tr><tr><td>Filter Paper (12.5 cm diameter)</td><td>VWR</td><td>#28320-100</td><td>Used for removal of meninges from brain tissue</td></tr><tr><td>Centrifuge Tubes</td><td>Sarstedt</td><td>#60.540.386</td><td>Disposable tubes used for dextran centrifugation steps</td></tr><tr><td>Pierce&amp;trade; Coomassie Plus (Bradford) Assay</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#23236</td><td>Measurement of protein concentration in membrane preparations</td></tr><tr><td>Wheaton Overhead Power Homogenizer</td><td>DWK Life Sciences</td><td>#903475</td><td>Required for homogenization of samples</td></tr><tr><td>10.0ml glass mortar and pestle tissue grinder</td><td>DWK Life Sciences</td><td>#358039</td><td>Required for homogenization of samples</td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#H1758</td><td>Required for pH adjustment of buffers</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#23210</td><td>Protein standard for Bradford Assay</td></tr><tr><td>Standard Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>#91100-12</td><td>Used for dissection of brain tissue</td></tr><tr><td>Friedman-Pearson Rongeurs</td><td>Fine Science Tools</td><td>#16020-14</td><td>Used for opening skull to isolate brain</td></tr><tr><td>50 ml conical centrifuge tubes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#352070</td><td>Used for collection of brain tissue following isolation</td></tr><tr><td>Glass Pasteur Pipets</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#13-678-20C</td><td>Used for aspiration of cellular debris following dextran spins</td></tr><tr><td>Ethanol, anhydrous</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#459836</td><td>Used for cleaning tissue grinder; diluted to 70% with distilled water</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge tubes</td><td>Beckman-Coulter</td><td>#41121703</td><td>Used for ultracentrifugation of samples</td></tr></tbody></table>

a simple and reproducible method to prepare membrane samples from freshly isolated rat brain microvessels

Die Blut - Hirn-Schranke (BBB) ist eine dynamische Barriere-Gewebe, die auf verschiedenen pathophysiologischen und pharmakologische Reize reagiert. Solche Veränderungen, die durch diese Reize können stark modulieren Drug-Delivery zum Gehirn und durch Verlängerung, erhebliche Herausforderungen bei der Behandlung des zentralen Nervensystems (ZNS) Krankheiten verursachen. Viele BBB-Veränderungen, die Pharmakotherapie, beeinflussen beinhalten Proteine, die lokalisiert und auf der Ebene der Endothelzellen ausgedrückt. In der Tat hat dieses Wissen über die Physiologie der BBB in Gesundheit und Krankheit erhebliches Interesse an der Erforschung dieser Membran Proteine ausgelöst. Aus Sicht der wissenschaftlichen Grundlagen-Forschung bedeutet dies eine Anforderung für eine einfache, aber robuste und reproduzierbare Methode zur Isolierung von mikrogefäßen aus Hirngewebe von Versuchstieren geerntet. Um Membran Proben aus frisch isolierte mikrogefäßen vorzubereiten, ist es wichtig, dass Probe Vorbereitungen in Endothelzellen bereichert aber in Gegenwart von anderen Zelltypen der Neurovaskuläre Einheit (z.B. Astrozyten, Mikroglia, Neuronen begrenzt, perizyten). Ein weiterer Vorteil ist die Fähigkeit, Proben von einzelnen Tieren vorzubereiten, um die wahre Variabilität der Proteinexpression in einer experimentellen Bevölkerung zu erfassen. In dieser Handschrift sind Einzelheiten über eine Methode, die verwendet wird für die Isolierung der Ratte Gehirn mikrogefäßen und Vorbereitung der Membran-Proben zur Verfügung gestellt. Kapilläre Anreicherung von Proben abgeleitet, ist erreicht, indem vier Zentrifugation Schritte wo Dextran in den Probenpuffer aufgenommen. Dieses Protokoll kann leicht durch andere Labore für ihre eigenen spezifischen Anwendungen angepasst werden. Proben aus diesem Protokoll generiert wurden gezeigt, robuste Versuchsdaten aus Protein-Analyse Experimente liefern, die das Verständnis der BBB Reaktionen auf physiologische und pathophysiologische pharmakologische Reize sehr helfen können.

Der experimentelle Fluss zur Isolierung der Ratte Gehirn mikrogefäßen und für die Probenpräparation kapilläre Membran ist in Abbildung 1dargestellt. Bei der hier vorgestellten Verfahren erfolgreich Isolation intakt mikrogefäßen aus rattengehirn zeigt (Abbildung 2A). Diese Schiffe wurden nach Abschluss der Zentrifugation mit Dextran und unmittelbar vor Beginn der Ultrazentrifugation, Membran-Proben (d. h. nach Abschluss von...

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A Simple and Reproducible Method to Prepare Membrane Samples from Freshly Isolated Rat Brain Microvessels

Hier wird eine Methode zur Isolierung der Ratte Gehirn mikrogefäßen und für die Vorbereitung der Membran Proben beschrieben. Dieses Protokoll hat den klaren Vorteil zur Herstellung von angereichertem kapilläre Proben mit akzeptablen Protein von einzelnen Tieren ergeben. Proben können dann für robuste Protein Analysen auf das Gehirn mikrovaskulären Endothel verwendet werden.

Eine einfache und reproduzierbare Methode, Membran-Proben von frisch isolierte Ratte Gehirn Mikrogefäßen vorzubereiten

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic barrier tissue that responds to various pathophysiological and pharmacological stimuli. Such changes resulting ...

a-simple-reproducible-method-to-prepare-membrane-samples-from-freshly

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.1K Aufrufe.  University of Arizona, Tucson. Hier wird eine Methode zur Isolierung der Ratte Gehirn mikrogefäßen und für die Vorbereitung der Membran Proben beschrieben. Dieses Protokoll hat den klaren Vorteil zur Herstellung von angereichertem kapilläre Proben mit akzeptablen Protein von einzelnen Tieren ergeben. Proben können dann für robuste Protein Analysen auf das Gehirn mikrovaskulären Endothel verwendet werden.

Serie: A Simple and Reproducible Method to Prepare Membrane Samples from Freshly Isolated Rat Brain Microvessels

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and characterize a highly reproducible rat syngeneic in vitro model of the BBB using co-cultures of primary rat brain endothelial cells (RBEC) and astrocytes to study receptors involved in transcytosis across the endothelial cell monolayer. Astrocytes were isolated by mechanical dissection following trypsin digestion and were frozen for later co-culture. RBEC were isolated from 5-week-old rat cortices. The brains were cleaned of meninges and white matter, and mechanically dissociated following enzymatic digestion. Thereafter, the tissue homogenate was centrifuged in bovine serum albumin to separate vessel fragments from nervous tissue. The vessel fragments underwent a second enzymatic digestion to free endothelial cells from their extracellular matrix. The remaining contaminating cells such as pericytes were further eliminated by plating the microvessel fragments in puromycin-containing medium. They were then passaged onto filters for co-culture with astrocytes grown on the bottom of the wells. RBEC expressed high levels of tight junction (TJ) proteins such as occludin, claudin-5 and ZO-1 with a typical localization at the cell borders. The transendothelial electrical resistance (TEER) of brain endothelial monolayers, indicating the tightness of TJs reached 300 ohm&#183;cm2 on average. The endothelial permeability coefficients (Pe) for lucifer yellow (LY) was highly reproducible with an average of 0.26 &#177;&#160;0.11 x 10-3 cm/min. Brain endothelial cells organized in monolayers expressed the efflux transporter P-glycoprotein (P-gp), showed a polarized transport of rhodamine 123, a ligand for P-gp, and showed specific transport of transferrin-Cy3 and DiILDL across the endothelial cell monolayer. In conclusion, we provide a protocol for setting up an in vitro BBB model that is highly reproducible due to the quality assurance methods, and that is suitable for research on BBB transporters and receptors.

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The aim of the present study was to validate the reproducibility of an in vitro BBB model involving a rat syngeneic co-culture of endothelial cells and astrocytes. The endothelial cell monolayer presented high TEER and low LY permeability. Expression of specific TJ proteins, functional responses to inflammation and functionality of transporters and receptors were assessed.

Einrichten einer<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell der Ratte Blut-Hirn-Schranke (BBB): Ein Fokus auf BBB-Undurchlässigkeit und Rezeptor-vermittelten Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Forschung

Medizin

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant cell type in the brain, neurons are the most widely studied of these cell types given their direct role in impacting behaviors. Other cell types in the brain also impact neuronal function and behavior via the signaling molecules they produce. Neuroscientists must understand the interactions between the cell types in the brain to better understand how these interactions impact neural function and disease. To date, the most common method of analyzing protein or gene expression utilizes the homogenization of whole tissue samples, usually with blood, and without regard for cell type. This approach is an informative approach for examining general changes in gene or protein expression that may influence neural function and behavior; however, this method of analysis does not lend itself to a greater understanding of cell-type-specific gene expression and the effect of cell-to-cell communication on neural function. Analysis of behavioral epigenetics has been an area of growing focus which examines how modifications of the deoxyribonucleic acid (DNA) structure impact long-term gene expression and behavior; however, this information may only be relevant if analyzed in a cell-type-specific manner given the differential lineage and thus epigenetic markers that may be present on certain genes of individual neural cell types. The Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) technique described below provides a simple and effective way to isolate individual neural cells for the subsequent analysis of gene expression, protein expression, or epigenetic modifications of DNA. This technique can also be modified to isolate more specific neural cell types in the brain for subsequent cell-type-specific analysis.

The goal of this protocol is to use the fluorescence activated cell sorting (FACS) technique to sort specific types of neural cells for subsequent analysis of cell-type-specific gene expression, epigenetic markers, and or protein expression.

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Neurowissenschaften

Purification of Mouse Brain Vessels

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and immune cells between the brain and the blood. Moreover, the huge neuronal metabolic demand requires a moment-to-moment regulation of blood flow. Notably, abnormalities of these regulations are etiological hallmarks of most brain pathologies; including glioblastoma, stroke, edema, epilepsy, degenerative diseases (ex: Parkinson&#8217;s disease, Alzheimer&#8217;s disease), brain tumors, as well as inflammatory conditions such as multiple sclerosis, meningitis and sepsis-induced brain dysfunctions. Thus, understanding the signaling events modulating the cerebrovascular physiology is a major challenge. Much insight into the cellular and molecular properties of the various cell types that compose the cerebrovascular system can be gained from primary culture or cell sorting from freshly dissociated brain tissue. However, properties such as cell polarity, morphology and intercellular relationships are not maintained in such preparations. The protocol that we describe here is designed to purify brain vessel fragments, whilst maintaining structural integrity. We show that isolated vessels consist of endothelial cells sealed by tight junctions that are surrounded by a continuous basal lamina. Pericytes, smooth muscle cells as well as the perivascular astrocyte endfeet membranes remain attached to the endothelial layer. Finally, we describe how to perform immunostaining experiments on purified brain vessels.

We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain's vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.

Reinigung von Maus-Hirngefäße

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Preparation of Newborn Rat Brain Tissue for Ultrastructural Morphometric Analysis of Synaptic Vesicle Distribution at Nerve Terminals

Our laboratory and many others have exploited the high resolving power of transmission electron microscopy to study the morphology and spatial organization of synaptic vesicles. In order to obtain high-quality electron micrographs that can yield the degree of morphological detail necessary for quantitative analysis of pre-synaptic vesicle distribution, optimal specimen preparation is critical. Chemical fixation is the first step in the process of specimen preparation, and of utmost importance to preserve fine ultrastructure. Vascular fixation with a glutaraldehyde-formaldehyde solution, followed by treatment of vibratome-sectioned specimens with osmium tetroxide, stabilizes the maximum number of molecules, especially proteins and lipids, and results in superior conservation of ultrastructure. Tissue is then processed with counterstaining, sequential dehydration and resin-embedding. En bloc staining with uranyl acetate (i.e., staining of vibratome-sectioned tissue before resin embedding) enhances endogenous contrast and stabilizes cell components against extraction during specimen processing. Contrast can be further increased by applying uranyl acetate as a post-stain on ultrathin sections. Double-staining of ultrathin sections with lead citrate after uranyl acetate treatment also improves image resolution, by intensifying electron-opacity of nucleic acid-containing structures through selective binding of lead to uranyl acetate. Transmission electron microscopy is a powerful tool for characterization of the morphological details of synaptic vesicles and quantification of their size and spatial organization in the terminal bouton. However, because it uses fixed tissue, transmission electron microscopy can only provide indirect information regarding living or evolving processes. Therefore, other techniques should be considered when the main objective is to study dynamic or functional aspects of synaptic vesicle trafficking and exocytosis.

We describe procedures for processing newborn rat brain tissue to obtain high-resolution electron micrographs for morphometric analysis of synaptic vesicle distribution at nerve terminals. The micrographs obtained with these methods can also be used to study the morphology of a number of other cellular components and their dimensional structural relationships.

Vorbereitung des Neugeborenen Ratsprofels für die ultrastrukturelle Morphometrische Analyse der Verbreitung synaptischer Bläschen an Nerven-Terminals

Our laboratory and many others have exploited the high resolving power of transmission electron microscopy to study the morphology and spatial ...

Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the lumen of blood vessels and command changes in vascular diameter as needed to meet the metabolic demand of neurons. Primary endothelial-dependent signaling pathways of hyperpolarization of membrane potential (Vm) and nitric oxide typically operate in parallel to mediate vasodilation and thereby increase blood flow. Although integral to coordinating vasodilation over several millimeters of vascular length, components of endothelium-derived hyperpolarization (EDH) have been historically difficult to measure. These components of EDH entail intracellular Ca2+ [Ca2+]i increases and subsequent activation of small- and intermediate conductance Ca2+-activated K+ (SKCa/IKCa) channels.
Here, we present a simplified illustration of the isolation of fresh endothelium from mouse cerebral arteries; simultaneous measurements of endothelial [Ca2+]i and Vm using Fura-2 photometry and intracellular sharp electrodes, respectively; and a continuous superfusion of salt solutions and pharmacological agents under physiological conditions (pH 7.4, 37 &#176;C). Posterior cerebral arteries from the Circle of Willis are removed free of the posterior communicating and the basilar arteries. Enzymatic digestion of cleaned posterior cerebral arterial segments and subsequent trituration facilitates removal of adventitia, perivascular nerves, and smooth muscle cells. Resulting posterior cerebral arterial endothelial &#34;tubes&#34; are then secured under a microscope and examined using a camera, photomultiplier tube, and one to two electrometers while under continuous superfusion. Collectively, this method can simultaneously measure changes in endothelial [Ca2+]i and Vm in discrete cellular locations, in addition to the spreading of EDH through gap junctions up to millimeter distances along the intact endothelium. This method is expected to yield a high-throughput analysis of the cerebral endothelial functions underlying mechanisms of blood flow regulation in the normal and diseased brain.

Demonstrated here are protocols for (1) freshly isolating intact cerebral endothelial "tubes" and (2) simultaneous measurements of endothelial calcium and membrane potential during endothelium-derived hyperpolarization. Further, these methods allow for pharmacological tuning of endothelial cell calcium and electrical signaling as individual or interactive experimental variables.

Gleichzeitige Messung von intrazellulären Calcium und Membrane Potential in frisch isolierte und intakte Maus zerebralen Endothel

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the ...

Biologie

A High Output Method to Isolate Cerebral Pericytes from Mouse

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood brain barrier formation and physiology is now demonstrated but its molecular basis remains largely unknown. As the pathophysiological role of cerebral pericytes in neurological disorders is intriguing and of great importance, the in vitro models are not only sufficiently appropriate but also able to incorporate different techniques for these studies. Several methods have been proposed as in vitro models for the extraction of cerebral pericytes, although an antibiotic-free protocol with high output is desirable. Most importantly, a method that has increased output per extraction reduces the usage of more animals.
Here, we propose a simple and efficient method for extracting cerebral pericytes with sufficiently high output. The mouse brain tissue homogenate is mixed with a BSA-dextran solution for the separation of the tissue debris and microvascular pellet. We propose a three-step separation followed by filtration to obtain a microvessel rich filtrate. With this method, the quantity of microvascular fragments obtained from 10 mice is sufficient to seed 9 wells (9.6 cm2 each) of a 6-well plate. Most interestingly with this protocol, the user can obtain 27 pericyte rich wells (9.6 cm2 each) in passage 2. The purity of the pericyte cultures are confirmed with the expression of classical pericyte markers: NG2, PDGFR-&#946; and CD146. This method demonstrates an efficient and feasible in vitro tool for physiological and pathophysiological studies on pericytes.

We present a protocol for the extraction of murine cerebral pericytes. Based on an antibiotic-free enrichment oriented pericyte extraction, this protocol is a valuable tool for in vitro studies providing high purity and high yield, thus decreasing the number of experimental animals used.

Eine High Output-Methode zum Isolieren von zerebralen Pericyten von der Maus

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood ...

Endothelial Cell Culture from Rat Brain Microvessels: A Procedure to Isolate and Culture Endothelial Cells from Microvessels of Rat Brain

Source: Molino, Y. et al. <a href="https://www.jove.com/v/51278/setting-up-an-vitro-model-rat-blood-brain-barrier-bbb-focus-on-bbb">Setting-up an&#160;In Vitro&#160;Model of Rat Blood-Brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport.</a> J. Vis. Exp.&#160;(2014)
This video presents the isolation of microvessels from a rat brain using a combination of density gradient centrifugation and enzymatic digestion mehods. The isolated microvessels can be cultured in a culture flask pre-coated with collagen and fibronectin matrix to obtain endothelial cell colonies.

Endothelzellkultur aus Mikrogefäßen des Rattengehirns: Ein Verfahren zur Isolierung und Kultivierung von Endothelzellen aus Mikrogefäßen des Rattengehirns

Source: Molino, Y. et al. Setting-up an&#160;In Vitro&#160;Model of Rat Blood-Brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Krebsforschung

Cancers of the Nervous System

In vitro studies

Isolation and Culture of Microglia from Rat Brains using Serum-Free Media

Source: Collins, H. Y., et al., <a href="https://app.jove.com/v/57122">Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates a method for isolating and culturing microglia from rat brains. It entails separating microglia from other neuronal and non-neuronal cells using plates coated with a monoclonal antibody specific to microglia.

Isolierung und Kultivierung von Mikroglia aus Rattengehirnen mit serumfreien Medien

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Prepare a Petri Dish for CD11b ...

Neuronal Culture Techniques

Primary Neuronal Culture

Isolating Mouse Brain Vessels: A Protocol to Isolate Intact Vessels from Murine Brain Sample

Source: Boulay, A. C. et al. <a href="https://www.jove.com/video/53208" target="_blank">Purification of Mouse Brain Vessels.</a> J. Vis. Exp. (2015)
This video demonstrates the isolation of intact vessels from a mouse&#39;s brain that constitute the blood-brain barrier (BBB) along with neurons and glial cells. The isolated vessels can be used as an in vitro model to study their role in maintaining brain homeostasis.

Isolierung von Hirngefäßen von Mäusen: Ein Protokoll zur Isolierung intakter Gefäße aus einer Gehirnprobe von Mäusen

Source: Boulay, A. C. et al. Purification of Mouse Brain Vessels. J. Vis. Exp. (2015)
This video demonstrates the isolation of intact vessels from a ...

In vivo studies

Obtaining a Single-Cell Suspension from Frozen Rat Brain Tissue

Source: Rubio, F. J., et. al. <a href="https://app.jove.com/v/54358">Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video demonstrates the dissociation of frozen rat brain tissue into a single-cell suspension using enzymatic digestion and mechanical trituration. The prepared cells are fixed and permeabilized with ethanol for downstream applications like flow cytometry or gene expression analysis.

Source: Rubio, F. J., et. al. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat ...