Este protocolo é significativo porque permite a comparação da microvasculatura entre diferentes regiões do sistema nervoso central, bem como entre diferentes indivíduos. Esta técnica de isolamento de microvessel pode ser completada dentro de um único dia, e elimina a necessidade de ultracentrifugação e dissociação enzimática. Remover as meninges e o plexo coroide pode ser difícil.
Certifique-se de trabalhar devagar e com cuidado para garantir a remoção completa de cada tecido. Para dissecção tecidual CNS de uma pequena amostra de vertebrados lissencéceicos, coloque o cérebro colhido em um tubo cônico de 15 mililitros contendo solução MV-1 no gelo, e use fórceps para recuperar a hipófise da sella turcica do crânio. Coloque a pituitária em um tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitro de solução MV-1 no gelo, e remova a pele e o músculo para expor a coluna vertebral.
Depois de remover os membros, a caixa torácica e os órgãos internos, use uma seringa de 10 mililitros equipada com uma agulha de calibre 18 para lavar a coluna vertebral com uma solução MV-1 fresca, em uma direção caudal-rostral em todo o forame vertebral lombar. Em seguida, coloque a medula espinhal em um tubo de 5 mililitros contendo uma solução MV-1 fresca. Em seguida, coloque o cérebro em uma placa de Petri sob o microscópio dissecando, e remova os meninges com picada de ponta dupla.
Certifique-se de verificar a medula espinhal para garantir que não restam pedaços de meninges. Use os fórceps para separar o hipotálamo, cerebelo, tronco cerebral e córtex. Quando necessário, use fórceps e íris e tesouras de mola para extirir as lâmpadas olfativas e o tálamo, e use o espinho de duas pontas para remover todo o plexo coroide de todos os ventrículos cerebrais.
Para dissecção de tecido CNS de uma grande amostra de vertebrados gyrencecencerásicos, use um microscópio dissecando e um espinho de duas pontas, fórceps e íris e tesoura de mola para remover as meninges de cada tecido CNS, tomando o cuidado de remover quaisquer pedaços de plexo choroide dos ventrículos cerebrais. Para homogeneização dos tecidos CNS colhidos, pique cada região do CNS em pedaços de um a dois milímetros dentro de placas de Petri individuais. Para homogeneizar os tecidos CNS de pequenas amostras de vertebrados, use uma pipeta de transferência para adicionar um mililitro de solução MV-1 para suspender o tecido picado.
Em seguida, use a mesma pipeta de transferência para distribuir o córtex, cerebelo, tronco cerebral, lobo óptico e pedaços de medula espinhal em moedores individuais de tecido de vidro de 10 mililitros, e use um pilão PTFE e cinco mililitros de solução MV-1 para moer cada conjunto de tecidos por cerca de 10 golpes. Transfira cada chorume de tecido para tubos cônicos individuais de 15 mililitros no gelo, e use fórceps para colocar o hipotálamo e a pituitária em 100 microliters de solução MV-1, em tubos individuais de 1,7 mililitros. Em seguida, homogeneize cuidadosamente cada tecido com uma micropéda de vidro.
Para homogeneizar uma grande amostra de vertebrados, use uma pipeta de transferência de corte chanfrada para transferir o tecido picado para um moedor de tecido de vidro de 55 mililitros, e anexar o moedor a um agitador aéreo. Adicione metade do volume recomendado da solução MV-1 de acordo com a parte específica do CNS sendo homogeneizada conforme indicado na tabela, e ligue o agitador aéreo para aproximadamente 150 rotações por minuto. Mova cuidadosamente o tubo de vidro para cima e para baixo por cerca de 30 segundos antes de desligar o agitador aéreo para adicionar mais solução MV-1 para homogeneização adicional, até que um chorume homogêneo seja obtido.
Em seguida, transfira o tecido homogeneizado para um tubo cônico de 50 mililitros no gelo. Para purificação de microvasos, a pelota do tecido CNS homogeneiza por centrifugação e descarta os sobrenantes. Para um pequeno espécime vertebrado isolamento de microvessel, pipeta o córtex, cerebelo, tronco cerebral, lobo óptico e pelotas de medula espinhal, em cinco mililitros de solução MV-2 fresca e gelada por amostra, cerca de 10 vezes, antes de adicionar mais cinco mililitros de solução MV-2 gelada a cada tubo.
Vire cuidadosamente os tubos para misturar, e suspenda as pelotas hipotálamo e pituitária em um mililitro de solução MV-2. Para o isolamento de microvessel de amostras de vertebrados grandes, adicione 20 mililitros de solução MV-2 gelada ao córtex, cerebelo, tronco cerebral e pelotas de microvessel da medula espinhal, e suspenda as pelotas em um revólver de tubo a 40 rotações por minuto por cerca de 5 minutos. No final da re-suspensão, separe os tecidos CNS por centrifugação e gire lentamente cada tubo para permitir que o supernatante passe ao longo da parede para desprender cuidadosamente a espessa e densa camada de mielina na interface líquida das paredes do tubo.
Descarte as interfaces mielina e líquida, e borre a parede interna de cada tubo com uma espátula enrolada com um lenço de papel de fiapo baixo. Em seguida, use uma limpeza de papel de fiapo de baixo fiapo torcido para absorver o excesso de líquido e use pontas de baixa ligação para suspender novamente cada pelota em um mililitro de solução MV-3. Para elução e filtragem de microvalhos, misture alguns mililitros de solução MV-3 fresca para cada pasta de microvessel de tecido CNS, e enquanto se mistura para evitar agregados, coe cada suspensão através de um coador Pruitt em tubos cônicos individuais de 50 mililitros.
Coloque um filtro de rede de nylon de 20 micrômetros em um suporte de filtro modificado por região CNS. Transfira o suporte do filtro para um tubo cônico de 50 mililitros e molhe o filtro com cinco mililitros de solução MV-3 gelada, certificando-se de que o tampão despeje o suporte do filtro, no tubo cônico. Transfira os microvexes elucidos para cada filtro de rede de nylon de 20 micrômetros e enxágue os microvaxes com cinco a dez mililitros de solução MV-3 gelada.
Use fórceps para transferir cada filtro para béquers individuais contendo a solução MV-3 gelada e agite suavemente cada filtro por cerca de 30 segundos para separar os microvexes. Depois de transferir para um tubo cônico de 15 mililitros, colete os microvessels por centrifugação e use uma pipeta de baixa ligação para suspender derreta cada pelota em um mililitro de solução MV-3 gelada. Em seguida, transfira as suspensões de microvaxis de pequenos espécimes vertebrados em um tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitro para centrifugação por cinco minutos a 20.000 vezes G, em quatro graus celsius.
Para grandes espécimes de vertebrados, transfira a suspensão para tubos individuais de centrífugas de cinco mililitros e adicione quatro mililitros de solução MV-3 para centrifugação por cinco minutos a 2.000 vezes G em quatro graus celsius. Os componentes intrínsecos da unidade neurovascular podem ser detectados dentro de microvexilhões, isolados como demonstrado, por imunolabeling para CD31, PDGFR-beta e aquaporina quatro, incluindo os microvessels cortical, cerebelar, pituitário, hipotálamo, tronco cerebral e microvessels espinhais. Da mesma forma, a expressão da proteína de junção de aderentes VE-cadherin, as proteínas de junção apertada CLDN5 e Zonula Occludens-1, a proteína de junção tricelular angulin-1, e as marcas basais chemokine ligand CXCL motivo 12, e gama-glutamyltransferase-1, podem ser visualizadas.
Além disso, a maioria dos microvaxes são desprovidos da expressão de actina muscular suave alfa, indicando que este protocolo de isolamento tem como alvo seletivamente microvessels de pequeno calibre. Microvaxes obtidos de outros pequenos vertebrados lissencéceicos, como aves, mentirosos, sapos e peixes, compartilham algumas características morfológicas, sugerindo que este método é útil para uma caracterização adicional das diferenças nas unidades neurovasculares entre as espécies. A quantificação das mudanças na expressão proteica revela um aumento na molécula de adesão celular vascular um, e a molécula de adesão juncional B ao longo de microvexes da medula espinhal, durante o pico da encefalomielite autoimune experimental.
No entanto, a molécula de adesão celular vascular um também é significativamente aumentado em microvessels pituitários, e diminuiu nos microvessels hipotálamo e tronco cerebral. Além disso, alterações são observadas na molécula de adesão celular vascular uma expressão durante encefalomielite autoimune experimental crônica em todos os tecidos CNS, e na expressão da molécula de adesão da junção B nos microvessels hipotálamo e pituitário. Análises quantitativas, como a mancha ocidental, a PCR e a imunohistoquímica, podem ser realizadas após este procedimento para revelar insights sobre padrões de expressão genética e proteica dentro da barreira hematoencefálica.
Paraformaldeído é um reagente agudamente tóxico, e deve ser sempre manuseado sob o capô da fumaça enquanto usa EPI adequado.
