SNX-BARs sind Membran-Remodeling-Proteine, die eine Schlüsselrolle bei menschlichen Krankheiten spielen. Mit unseren Methoden können wir ihre präzisen biophysikalischen Eigenschaften bestimmen, um die Lipidbindung und den Membranumbau zu erleichtern. Die Reinigung der SNB-BAR-Proteine aus Hefezellen ermöglicht den Erwerb nativer Homo- und Hetero-SNX-BAR-Dimere bei gleichzeitiger Minimierung der Toxizität und Unlöslichkeit, die häufig bei nicht nativen Expressionssystemen auftritt.
Unsere Methoden können verwendet werden, um die Lipidspezifitäten aller Hefe-SNX-BARs zu verstehen oder rekombinante SNX-BAR-Proteine aus jedem anderen Organismus zu produzieren. Eine korrekte Extruderbaugruppe ist unerlässlich, um Liposomenverlust während des Extrusionsprozesses zu verhindern. Für Anfänger oder Neulinge im Bereich wird die visuelle Beobachtung der kritischsten Schritte Ihre Erfolgsaussichten erheblich verbessern.
Beginnen Sie mit der Impfung eines großen Tupfers von Hefezellen in einen Kolben mindestens viermal so viel wie das Volumen der Kultur mit 50 MilliliterN Standard-YP-Medium mit 2%Raffinose und 0,1% Glukose als Kohlenstoffquelle ergänzt und wachsen die Kultur über Nacht in einem 30 Grad Celsius Shaker. Am nächsten Morgen impfen Sie die 50-Milliliter-Vorkultur in einem Liter Standard-YP-Medium mit 2%raffinose und 0,1% Glukose in einem 2,8 Liter Volumen verblüfft fernbach Kolben für eine vier- bis fünfstündige Kultur im Schüttel-Inkubator. Wenn die optische Dichte bei 600 Nanometern 0,2 erreicht, fügen Sie Galaktose zu einer Endkonzentration von 2% zu den Zellen für eine Nachtkultur im Schüttelinkubator hinzu.
Am nächsten Morgen ernten Zellen durch Zentrifugation und übertragen sie das Hefepellet in ein 50 Milliliter konisches Rohr. Setzen Sie das Pellet in 15 MilliliterReinigungspuffer auf, um ein Endvolumen von etwa 30 Millilitern zu erreichen, und laden Sie die Zellsuspension auf einen homogenisator, gekühlt auf vier Grad Celsius. Lyse die Proben bei 20 bis 25, 000 Pfund pro Quadratzoll für zwei bis drei Runden und übertragen Sie das Lysat in eine neue 50 Milliliter konische Röhre auf Eis.
Löschen Sie das Zelllysat sofort durch Zentrifugation und übertragen Sie den Überstand vorsichtig in ein neues Rohr. Als nächstes gleicht man 300 Mikroliter IgG Sepharose Perlen mit drei Resuspensionen im Reinigungspuffer aus, bevor die Perlen für eine zweistündige Inkubation mit vier Grad Celsius in das gereinigte Zelllysat eingebracht werden. Am Ende der Inkubation fügen Sie die Perlen zu einer 10-Milliliter-Chromatographiesäule hinzu und lassen Sie das ungebundene Lysat durchfließen.
Waschen Sie die Perlen 10 Mal mit einem Milliliter Waschpuffer pro Wäsche, so dass jede Wäsche vollständig durchfließen kann, bevor sie das nächste Volumen hinzufügt. Nach der letzten Wäsche verwenden Sie eine Pipette und einen frischen Puffer, um die Perlen in ein Mikrozentrifugenrohr zu übertragen. Bringen Sie das Gesamtvolumen der Perlen auf 500 Mikroliter mit frischem Waschpuffer und entfernen Sie die Perlen aus dem Lysat mit zwei Mikrolitern von 10 Milligramm pro Milliliter TEV Protease für eine nächtliche Inkubation mit Rotation bei vier Grad Celsius.
Verwenden Sie am nächsten Morgen eine 27-Spur-Nadel, um den Überstand vollständig zu entfernen und die Proteinreinheit um 10% Polyacrylamid-SDS-Seite zu bewerten. Dann quantifizieren Sie die konzentrierten Proteine mit dem Bradford-Protein-Assay nach Standardprotokollen und speichern Sie das Protein bis zu einer Woche bei vier Grad Celsius. Um die Liposomen vorzubereiten, verwenden Sie Glasspritzen, um Stocklipide in ein sauberes Glaskulturrohr zu übertragen, um eine endgültige Lipidmischung von 1%Phosphatidylinositol-3-Phosphat, 20%Ergosterol, 30%Phosphatidylserin, Phosphatidylcholin, wie in der Tabelle beschrieben, zu erreichen.
Je nach Lösungsmittel nionenin jedem Lipid kann sich das Gemisch bei Zugabe jedes Lipids trüb drehen. Trocknen Sie die Lipidmischungen vorsichtig aus, indem Sie strömungsarmes Stickstoffgas in einer kreisförmigen Bewegung auf die Gemischs lenken, um die Lipide am Boden des Glasrohres gleichmäßig zu behandeln. Dann wickeln Sie das Glaskulturrohr mit Folie, die die Öffnung freigelegt lässt und die Lipide eine Stunde lang in einem Vakuum weiter dehydrieren.
Am Ende der Inkubation 400 Mikroliter Bindungspuffer in jede Durchstechflasche geben, um die Lipide bei einer endgültigen Liposomenkonzentration von 2,5 Millimolar vollständig zu rehydrieren, bevor die Lipide bei mittlerer Geschwindigkeit auf einem Wirbel bei Raumtemperatur 30 Minuten wieder aufgesetzt werden. Der Puffer sollte trüb werden, wenn die Lipide resuspendiert werden. Die resuspendierten Liposomen in ein Mikrozentrifugenrohr übertragen und die Rohre in flüssigem Stickstoff einfrieren, gefolgt vom Sieben- bis Achtfachen Auftauen in einem 37 Grad Celsius Wasserbad.
Reinigen Sie in einer chemischen Rauchhaube zwei Ein-Milliliter-Glasspritzen mit einem vollen Chloroformvolumen dreimal pro Spritze, um Restlipide zu entfernen und jede Spritze mit zwei Volumen Reinstwasser und zwei Volumen Bindungspuffer auszustatten. Montieren Sie einen Mini-Extruder gemäß den Empfehlungen des Herstellers. Dann tauchen Sie zwei Teile filterträger in einer 200 Nanometer Membran in Bindungspuffer.
Es ist wichtig, den Mini-Extruder so zu montieren, dass er vollständig luftdicht ist. Und eine gute Möglichkeit, auf Lecks zu überprüfen, ist Puffer durch das Gerät zu übergeben. Sandwich die Membran zwischen den Filterstützen und legen Sie die Membran in den Mini-Extruder.
Mit einer der gleichförmigen Ein-Milliliter-Spritzen, übergeben Sie ein Volumen von Bindungspuffer ähnlich dem Volumen der Liposomenmischung durch den Mini-Extruder und verwenden Sie die andere Spritze, um die Liposomenmischung invertieren das Mikrozentrifugenrohr fallen zu lassen, um die letzten Liposomen in die Rohrkappe für ihre Sammlung zu sammeln. Dann extrudieren Sie die Liposomen 19 bis 21 Mal durch die 200-Nanometer-Membran und sammeln Sie die extrudierten Liposomen in ein neues Mikrozentrifugenrohr. Vor der Durchführung der SNX-BAR Liposomenbindungs- und Tubulationstests sollten Sie das gereinigte Protein durch Ultrazentrifugation vorklären und das Überstand in ein neues Mikrozentrifugenrohr übertragen, ohne das Pellet zu stören.
Als nächstes inkubieren Sie vier Mikromolar von gereinigtem SNX4-ATG20 und 2,5 Millimolar Liposomen in einem Gesamtreaktionsvolumen von 20 Mikrolitern für eine 30-minütige Inkubation bei 30 Grad Celsius. Um die Liposomentubulation am Ende der Inkubation zu visualisieren und zu quantifizieren, erkennen Sie die Proben sofort auf einem kohlenstoffbeschichteten Kupfernetzgitter und negativem Fleck mit 1%uranylacetat. Analysieren Sie dann die Proben auf einem Transmissionselektronenmikroskop mit 200 Kilovolt.
Zur Liposomenbindung und Sedimentation 20 Mikroliter der Reaktion auf ein Polycarbonatzentrifugenrohr übertragen und die Probe mit einem kompatiblen Router in einer Ultrazentrifuge drehen. Am Ende der Zentrifugation den Überstand vorsichtig auf ein neues Mikrozentrifugenrohr übertragen und das Pellet in 40 MikroliterS SDS-Seitenprobenpuffer wieder aufhängen. Übertragen Sie die Pelletsuspension in ein neues Mikrozentrifugenrohr und fügen Sie dem Überstand 20 Mikroliter Probenpuffer hinzu.
Dann laden Sie gleichwertige Probenvolumina von Pellet und Überstand auf ein 10%Polyacrylamid SDS Seitengel und führen Sie Coomassie Färbung durch, um die an die Liposomen gebundenen SNX-BARs zu visualisieren. Um die korrekte Induktion der SNX-BAR-Expression zu überprüfen, kann ein westlicher Fleck gegen das Tandem-Affinitätsreinigungs-Tag verwendet werden, da der Proteingehalt der SNX-BARs nicht über Coomassie-Färbung nachgewiesen werden kann. Nach der Reinigung des SNX-BAR Heterodimers sollten die Bänder der beiden SNX-BARs in einem eins-zu-eins stoichiometrischen Verhältnis erscheinen und es sollte wenig bis gar keine kontaminierenden Bänder geben.
In dieser repräsentativen Analyse wurden SNX-BAR-Heterodimere exprimiert, gereinigt und an synthetische Liposomen gebunden, wie gezeigt. Beachten Sie, dass MVP1 Homodimere bildete und wie erwartet in Bakterien exprimiert wurde. SNX-BAR-Bindung an unterschiedliche Liposomenzusammensetzungen könnte durch Densitometrie quantifiziert werden, um die Wirkung von Phosphatidylserin beispielsweise auf die Liposomenbindung zu bewerten.
Die Elektronenmikroskopie-Bildgebung ermöglicht die Messung von SNX4-ATG20-Liposomen-Tubuli mit den meisten Tubuli, die typischerweise Durchmesser zwischen 14 und 26 Nanometern besitzen. Beachten Sie, dass gereinigte SNX-BARs mit Frachterfassungskomplexen auf Liposomen rekonstituiert werden können, um zu verstehen, wie vollständige Baugruppen den Membranumbau beeinflussen können. Beim Vergleich der Bindung verschiedener Kombinationen von gereinigten SNX-BAR-Dimern an synthetische Liposomen, die aus verschiedenen Lipiden bestehen, wurden SNX-BAR-Proteine mit unterschiedlichen Lipidbindungspräferenzen gefunden.
Arbeiten Sie immer in einer Haube beim Umgang mit Chloroform und achten Sie darauf, die richtige PSA zu tragen, wenn Sie mit Scharfen oder Glasmaterial umgehen.
