Name: protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins ndc10 and ndc80
Uploaded: 2015-05-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
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We thank Dr. Oliver Kerscher for support and advice and members of the Basrai laboratory for their support and comments on the paper. This work was supported by the National Institutes of Health Intramural Research Program.

1. Wachstum von Hefezellen, <ol><li> Inokulieren Hefezellen in 30 ml YPD (Tabelle 1) in einem kleinen Kolben. Inkubation bei 30 ° C über Nacht unter Schütteln. </li><li> Verdünne die Zellen bis zu einer optischen Dichte von 0,2 bei 600 nm (OD 600 = 0,2) in 50 ml YPD und Inkubieren bei 30 ° C unter Schütteln inkubiert. </li><li> Die Kultur auf eine optische Dichte von 1,0 bei 600 nm (OD 600 = 1,0). </li><li> Centrifuge Zellen für 5 min bei 2.000 xg und den Überstand verwerfen. </li><li> Zellpellet in 40 ml sterilem Wasser und Zentrifuge für 5 min bei 2.000 xg, um die Zellen zu waschen. Überstand verwerfen und speichern Sie das Zellpellet bei -20 ° C. </li></ol> 2. Extraktion von Proteinen <ol><li> Die Zellen in 0,5 ml eiskaltem Guanidinpuffer (Tabelle 1) für die Pull-Down-Assay unter Verwendung von Ni-NTA-Superflow Perlen oder Puffer A (Tabelle 1) für die Immunfällung. Halten Röhrchen auf Eis zu allen Zeiten. </li><li> Transfer zu 2 ml Schraubverschluss Röhrchen. </li><li> In die gleiche Menge Glasperlen (Table of Materials). </li><li> Bead-schlagen, die Zellen in einem Mini Bead Beater (Table of Materials) für 2 Minuten bei Raumtemperatur, dann auf Eis legen für 2-3 min. Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal. </li><li> Wirbel mit hoher Geschwindigkeit bei 4 ° C für 30-60 min. Überprüfen Sie die Zellen durch Visualisierung unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, daß die Zellen lysiert. Hinweis: lysierten Zellen werden als dunkle Geister erscheinen und es fehlt ihnen eine Grenze oder definierte Form. In optimaler Weise mindestens 80% der Zellen lysiert werden sollte. </li><li> Punktion ein Loch in den Boden des Röhrchens mit einem Push-Pin und Ort in einer Sammlung enthalten 15 ml konischen Rohr (Schraubdeckel sollte locker sein). </li><li> Zentrifuge bei 1000 × g für 1 min, um das Lysat zu sammeln. </li><li> Transfer des Lysats auf einem Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Zentrifuge bei 15.000 g für 30 min bei 4 ° C, um die extrahierten Proteine ​​zu sammeln. </li><li> Messung der Konzentration der extrahierten Proteine ​​mit dem Protein assay Kit (Table of Materials) und normalisieren extrakte, um die gleiche Menge an Protein enthalten. Bringen des Gesamtvolumens auf 1 ml mit einem geeigneten Puffer. Anmerkung: Etwa 5 mg Gesamtprotein aus 50 OD 600-Zellen erhalten. </li><li> Sparen Sie 50 ul (250 ug Protein, wenn das Gesamtprotein aus Schritt 2.10 extrahiert ist 5 mg) als Gesamtzellextrakt (WCE). Dann werden 50 ul 2x Laemmli Probenpuffer (Tabelle 1) und Inkubation bei 100 ° C in einem Heizblock für 3-5 min. Last 10 ul jeder Probe in einem SDS-PAGE-Gel für Western Blot-Analyse (Abschnitt 5: Western-Blot-Analyse). </li></ol> 3. Reinigung von HF-Smt3 Konjugate <ol><li> Besorgen Sie sich die Ni-NTA-Superflow-Perlen (Table of Materials) für die Versuche (100 &amp; mgr; l Kügelchen pro Probe) durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit (800-1500 xg) für 1 min notwendig. Entfernen Sie den Überstand. </li><li> Wash Perlen 5x mit 1 ml PBS (Table of Materials): Invert top-Über-unten, bis die Kügelchen wieder suspendiert werden, sammeln Perlen durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit, und entfernen Sie den Überstand. </li><li> Aussetzen Kügelchen in 1 ml Guanidin-Puffer (Tabelle 1) und aliquotiert sie in der Anzahl der Rohre entsprechenden Proben zu verarbeiten. Sammle Perlen durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit, und entfernen Sie den Überstand. Mischen Sie die Perlen auch durch Umdrehen über top-bottom. Hinweis: Mischen Sie Perlen gut durch Umkehren oben über Boden. </li><li> Für jede Probe wird mit 950 &amp; mgr; l der verbleibenden WCE (aus Schritt 2.11: Extraktion der Proteine) zu 100 ul Ni-NTA Superflow Beads. </li><li> Inkubieren auf einer Schüttelplattform bei 4 ° C für mindestens 4 Stunden oder über Nacht. </li><li> Zentrifuge bei 800-1500 x g für 1 Minute bei 4 ° C. </li><li> Sparen Sie 50 ul als Überstand (SUP). Dann werden 50 ul 2x Laemmli Probenpuffer und Inkubation bei 100 ° C in einem Heizblock für 3-5 min. Last 10 ul jeder Probe in einem SDS-PAGE-Gel für Western Blot-Analyse (Abschnitt 5: Western-Blot-anallyse). </li><li> Wasch Kügelchen einmal mit 1 ml Guanidin-Puffer für 5-10 min auf einer Schwingplattform. </li><li> Wash Perlen 5x mit 1 ml Aufbruchpuffer (Tabelle 1) für 5-10 min auf einem Wippschüttler. </li><li> Resuspendieren Perlen in 90 ul 2x Laemmli-Probenpuffer. </li><li> Zugabe von 10 ul 1 M Imidazol. Hinweis: Imidazol hilft, die His-Tag-Protein aus der Ni-NTA-Perlen aufgrund konkurrierender Wechselwirkungen zwischen Imidazol und die Perlen zu distanzieren. </li><li> Inkubation bei 100 ° C in einem Heizblock für 3-5 min. </li><li> Vortex, dann bei 13.000 xg zentrifugieren für 30 Sekunden. Den Überstand in ein frisches Röhrchen. </li><li> Last 10-20 ul jeder Probe in einem SDS-PAGE-Gel für Western Blot-Analyse (Abschnitt 5: Western-Blot-Analyse). Anmerkung: 10-20 ul entspricht 0,5-1,0 mg Eingang, wenn 5 mg WCE verwendet. </li></ol> 4. Immunpräzipitation von Myc-markierten Proteine ​​Kinetochor <ol><li> Erhalten anti-c-Myc Agarose Affinitätsgel eintibody (Table of Materials) für die Versuche (25 ul Harz pro Probe) durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit (800-1500 xg) notwendig. Entfernen Sie den Überstand. </li><li> Wash Harz 5x mit 1 ml Puffer A: Invert Top-über-Boden, bis das Harz suspendiert, sammeln Harz durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit, und entfernen Sie den Überstand. </li><li> Aussetzen Harz in 1 ml Puffer A und aliquotiert sie in der Anzahl der Rohre entsprechenden Proben zu verarbeiten. Sammeln Harz durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit, und entfernen Sie den Überstand. Hinweis: Mischen Sie das Harz auch durch Umkehren Top-über-Boden. </li><li> Add 950 ul der verbleibenden WCE (aus Schritt 2.11: Extraktion der Proteine) zu 25 &amp; mgr; l des Harzes. </li><li> Inkubieren auf einer Schüttelplattform bei 4 ° C über Nacht. </li><li> Zentrifuge bei 800-1500 x g für 1 Minute bei 4 ° C. </li><li> Sparen Sie 50 ul als Überstand (SUP). Dann werden 50 ul 2x Laemmli Probenpuffer und Inkubation bei 100 ° C in einem Heizblock für 3-5 min. Load 10 ul jeder Probe in einem SDS-PAGE-Gel für Western Blot-Analyse (Abschnitt 5: Western-Blot-Analyse). </li><li> Wash Harz 5x mit 1 ml Puffer A: Invert Top-über-Boden, bis das Harz suspendiert, sammeln Harz durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit, und entfernen Sie den Überstand. </li><li> Resuspendieren des Harzes in 100 ul SUMEB Probenpuffer (Tabelle 1). Hinweis: SUMEB Probenpuffer enthält 8 M Harnstoff und 1% SDS (starke Denaturierung Bedingung). </li><li> Inkubation bei 100 ° C in einem Heizblock für 3-5 min. </li><li> Vortex, dann bei 13.000 xg zentrifugieren für 30 Sekunden. Den Überstand in ein frisches Röhrchen. </li><li> Last 10-20 ul jeder Probe in einem SDS-PAGE-Gel für Western Blot-Analyse (Abschnitt 5: Western-Blot-Analyse). Anmerkung: 10-20 ul entspricht 0,5-1,0 mg Eingang, wenn 5 mg WCE verwendet. </li></ol> 5. Western Blot-Analyse <ol><li> Laden Sie die Proteinextrakte auf 4-12% Bis-Tris-Gelen (Table of Materials) und perform Elektrophorese bei 120 V für 90 Minuten (Laufpuffer: Table of Materials). </li><li> Übertragen Sie die Proteine ​​aus Gel auf eine Nitrocellulosemembran (Table of Materials) mit einem Übertragungsgerät bei 30 V für 90 min (Transfer-Puffer: Table of Materials). </li><li> Blockieren die Membran in 5% Milch / 1x TBST (Tabelle 1) für 1 h bei Raumtemperatur. </li><li> Inkubieren Membran mit dem primären Antikörper (Table of Materials) in 5% Milch / 1x TBST über Nacht bei 4 ° C. Für primäre Antikörper, verwenden Sie eine Verdünnung von 1: 1000 (Anti-Flag und Anti-Ub-Antikörper) oder 1: 5000 (Anti-Myc-Antikörper). </li><li> Für jeweils 10 min mit 1x TBST waschen Membran 3x. </li><li> Inkubieren Membran mit Sekundärantikörper (Table of Materials) in 5% Milch / 1x TBST für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Verwenden Sie eine 1: 5000 Verdünnung des sekundären Antikörper. </li><li> Für jeweils 10 min mit 1x TBST waschen Membran 3x. </li><li> Inkubieren Membran mit ECL working-Lösung (Table of Materials) für 5 min. </li><li> Setzen Sie die Membran auf blauempfindlichen Röntgenfilm (Table of Materials) und die Entwicklung unter Verwendung einer automatischen Entwickler (Table of Materials). </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Epitop-Tags, wie HA, Myc, Flagge, und GST sind weit verbreitet für die biochemische Analyse von Proteinen verwendet. Konstruktion von Stämmen mit HF-Smt3 und Myc-markierten kinetochore Proteine ​​wie Ndc10 und Ndc80, erleichtert den Nachweis von PTMs wie sumoylation und Ubiquitinierung. HF-Smt3 Pulldown Assay erlaubt den Nachweis von sumoyliert Kinetochor-Proteinen, Ndc10 und Ndc80 (Abbildung 1). Der Affinitätsreinigungsprotokoll und Western Blot-Analyse unter Verwendung von Anti-Flag-Antikörper...

Ubiquitinierung und sumoylation ermöglicht die Konjugation von Ubiquitin and Small Ubiquitin-like Modifier (SUMO; Smt3 in S. cerevisiae 1) an ein Zielprotein auf. PTMs der Kinetochor-Proteinen beeinflussen ihre zellulären Ebenen und Protein-Protein-Interaktionen in verschiedenen Zellzyklusphasen treu Chromosomensegregation zu gewährleisten. Beispielsweise sind Zellebenen Cse4 / CENP-A und äußeren Kinetochorenprotein DSN1 durch Ubiquitin-vermittelte Proteolyse zur Sicherstellung Genomstabilität 2-5 geregelt. Destabilisierung der falsche Kinetochor-Mikrotubuli-Anhänge erfordert die Ipl1 / Aurora B-Kinase, die Dam1 und Ndc80 Komplexe, die direkt mit den Mikrotubuli interagieren 6-8 phosphoryliert. Obwohl die Identifizierung von mehr als siebzig kinetochore Proteinen gibt es sehr wenige Untersuchungen, die die Modifikationen dieser Proteine ​​mit PTMs zB Ubiquitin und SUMO untersuchen. Eine wichtige Einschränkung ist die Fähigkeit, die PTM zu bewahrens während der Reinigung und dem Mangel an individuelle Antikörper zum Nachweis von PTMs wie sumoylation, Phosphorylierung, Methylierung, und andere. Charakterisierung von sumoyliert Kinetochor-Proteinen Ndc10, Cep3, genutzt Bir1 und Ndc80 eine benutzerdefinierte Antikörpers 9. Zusätzlich hat Ndc10 als Substrat für Ubiquitinierung 10 in Verbindung gebracht. Menschliche Hec1 (Ndc80 in S. cerevisiae) wird auch für die Ubiquitinierung Substrat durch APC / C-hCdh1 E3-Ligase 11 geregelt. Daher Ndc10 und Ndc80 sind gute Kandidaten für die Optimierung des Protokolls sowohl sumoylation und Ubiquitinierung in S. erkennen cerevisiae. Um die Identifizierung von Sumoylierung zu erleichtern, konstruierten wir Stämme, die HF-Smt3 und Myc-tagged Ndc10 oder Ndc80 auszudrücken. Die Verwendung von Epitop-Tags (HF: His6-Flag) minimiert den Hintergrund aufgrund von Kreuzreaktivität, die häufig in polyklonales Serum gegen einen Kandidaten-Protein erzeugt wurden beobachtet. Wir entwickelten ein Protokoll zur Affinitätsreinigen HF-Smt3 Konjugate und dann verwendet kommerziellen anti-Flag und Anti-Myc-Antikörper, die Anwesenheit von sumolyated Ndc10 und Ndc80 im gereinigten Präparat Smt3 detektieren. Für Ubiquitinierung, entwickelten wir eine modifizierte Immunpräzipitationsprotokoll die Ubiquitinierung des Myc-tagged Kinetochor-Proteinen konserviert und Western Blot-Analyse durchgeführt, mit kommerziellen anti-Ub-Antikörper gegen Ubiquitinierung von Ndc10 und Ndc80 zu erkennen.

<table><tbody><tr><td>Glass beads</td><td>BioSpec Products</td><td>11079105</td><td>0.5 mm diameter</td></tr><tr><td>Mini beadbeater</td><td>BioSpec Products</td><td>#693</td><td>8 cell disrupter</td></tr><tr><td>Ni-NTA superflow</td><td>Qiagen</td><td>30430</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8215</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Anti-c-Myc agarose affinity gel antbody produced in rabbit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7470</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Monoclonal anti-Flag M2 antibody produced in mouse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1804</td><td>Primary antibody, dilution 1:1,000</td></tr><tr><td>c-Myc antibody (A-14)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-789</td><td>Primary antibody, dilution 1:5,000</td></tr><tr><td>Purified mouse antibody monoclonal 9E10</td><td>Covance</td><td>MMS-150P</td><td>Primary antibody, dilution 1:5,000</td></tr><tr><td>Ubiquitin (P4G7) monoclonal antibody</td><td>Covance</td><td>MMS-258R</td><td>Primary antibody, dilution 1:1,000</td></tr><tr><td>ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>NA934V</td><td>Secondary antibody, dilution 1:5,000</td></tr><tr><td>ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>NA931V</td><td>Secondary antibody, dilution 1:5,000</td></tr><tr><td>DC protein assay</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0116</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose membrane</td><td>Novex</td><td>LC2001</td><td>0.45 mm pore size</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td><td>Novex</td><td>NP0321BOX</td><td>1.0 mm, 10 well</td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS Running Buffer</td><td>Novex</td><td>NP0002</td><td>20x</td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer Buffer</td><td>Novex</td><td>NP0006-1</td><td>20x</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td><td>Thermo Scientific</td><td>34078</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS pH7.4</td><td>GIBCO</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Blue sensitive X-Ray film</td><td>Dbio</td><td>DBOF30003</td><td></td></tr><tr><td>Automatic developer</td><td>Kodak</td><td>M35AX-OMAT</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1404</td><td>50 mg</td></tr><tr><td>MG-132</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S2619</td><td>25 mg</td></tr></tbody></table>

protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins ndc10 and ndc80

Post-translationale Modifikationen (PTMs), wie Phosphorylierung, Methylierung, Acetylierung, Ubiquitinierung und sumoylation, regulieren die zelluläre Funktion von vielen Proteinen. PTMs der Kinetochor-Proteinen, die mit Centromer-DNA assoziieren vermitteln treu Chromosomensegregation auf Genomstabilität zu gewährleisten. Biochemischen Ansätzen wie Massenspektrometrie und Western-Blot-Analyse werden am häufigsten für die Identifizierung von PTMs verwendet. Dabei wird ein Protein-Reinigungsverfahren beschrieben, das den Nachweis von sowohl sumoylation und Ubiquitinierung des kinetochore Proteinen Ndc10 und Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae ermöglicht. Ein Stamm, der zum Ausdruck bringt Polyhistidin-Flag-markierten Smt3 (HF-Smt3) und Myc-tagged Ndc10 oder Ndc80 wurde gebaut und für unsere Studien verwendet. Für den Nachweis von Sumoylierung erarbeiteten wir ein Protokoll zur Affinitätsreinigung His-Tag sumoyliert Proteinen durch Verwendung von Nickel Perlen und verwendet Western Blot-Analyse mit Anti-Myc-Antikörper zu erkennen sumoyliert Ndc10 einnd Ndc80. Für den Nachweis von Ubiquitinierung, entwickelten wir ein Protokoll für die Immunpräzipitation von Myc-markierte Proteine ​​verwendet und Western-Blot-Analyse mit anti-Ub-Antikörper zeigen, dass Ndc10 und Ndc80 werden ubiquitinierten. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Epitop-markiertes Protein von Interesse in der His-Flag markiert Smt3 Stamm erleichtert den Nachweis mehrerer PTMs. Künftige Studien ermöglichen sollten Ausnutzung dieser Technik zur Identifizierung und Charakterisierung Protein-Wechselwirkungen, die abhängig von einem bestimmten PTM sind.

Zu sumoylation von kinetochore Proteine ​​Ndc80 und Ndc10 detektieren Stämme mit HF-Smt3 und Myc-markierten kinetochore Proteine ​​(Ndc80 oder Ndc10) konstruiert (Tabelle 2), wie zuvor beschrieben, 9,12. HF-Smt3 Konjugate wurden Affinität mit Ni-NTA-Perlen gereinigt. Western Blot-Analyse von gereinigtem HF-Smt3 mit einem Anti-Flag-Antikörper erlaubt Detektion sumoylierten Formen SUMO Substrate, die in dem Kontrollstamm ohne HF-Smt3 (1A und 1B, link...

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Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Diese Handschrift beschreibt den Nachweis von Sumoylierung und Ubiquitinierung von Kinetochor-Proteinen, Ndc10 und Ndc80, in der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae.

Protein Purification Technik, die Erkennung von Sumoylierung und Ubiquitinierung von Bäckerhefe Kinetochor Proteine ​​Ndc10 und Ndc80 Erlaubt

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

protein-purification-technique-that-allows-detection-sumoylation

Research

JoVE Journal

Biology

12.0K Aufrufe.  National Cancer Institute, National Institute of Health.  Diese Handschrift beschreibt den Nachweis von Sumoylierung und Ubiquitinierung von Kinetochor-Proteinen, Ndc10 und Ndc80, in der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae. 

Serie: Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ubiquitinated proteins, peptides with a diglycine remnant conjugated to the epsilon amino group of lysine (&#39;K-&#949;-diglycine&#39; or simply &#39;diGly&#39;) can be used to track back the original modification site. Efficient immunopurification of diGly peptides combined with sensitive detection by mass spectrometry has resulted in a huge increase in the number of ubiquitination sites identified up to date. We have made several improvements to this workflow, including offline high pH reverse-phase fractionation of peptides prior to the enrichment procedure, and the inclusion of more advanced peptide fragmentation settings in the ion routing multipole. Also, more efficient cleanup of the sample using a filter-based plug in order to retain the antibody beads results in a greater specificity for diGly peptides. These improvements result in the routine detection of more than 23,000 diGly peptides from human cervical cancer cells (HeLa) cell lysates upon proteasome inhibition in the cell. We show the efficacy of this strategy for in-depth analysis of the ubiquitinome profiles of several different cell types and of in vivo samples, such as brain tissue. This study presents an original addition to the toolbox for protein ubiquitination analysis to uncover the deep cellular ubiquitinome.

We present a method for the purification, detection, and identification of diGly peptides that originate from ubiquitinated proteins from complex biological samples. The presented method is reproducible, robust, and outperforms published methods with respect to the level of depth of the ubiquitinome analysis.

Nachweis von Protein-Ubiquitinationsstellen durch Peptidanreicherung und Massenspektrometrie

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Forschung

Biochemie

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. This method utilizes a recombinant modified SUMO-trapping protein fragment, kmUTAG, derived from the Ulp1 SUMO protease of the stress-tolerant budding yeast Kluyveromyces marxianus. We have adapted the properties of the kmUTAG for the purpose of studying sumoylation in a variety of model systems without the use of antibodies. For the study of SUMO, KmUTAG has several advantages when compared to antibody-based approaches. This stress-tolerant SUMO-trapping reagent is produced recombinantly, it recognizes native SUMO isoforms from many species, and unlike commercially available antibodies it shows reduced affinity for free, unconjugated SUMO. Representative results shown here include the localization of SUMO conjugates in mammalian tissue culture cells and nematode oocytes.

SUMO is an essential and highly conserved, small ubiquitin-like modifier protein. In this protocol we are describing the use of a stress-tolerant recombinant SUMO-trapping protein (kmUTAG) to visualize native, untagged SUMO conjugates and their localization in a variety of cell types.

Lokalisierung von SUMO-modifizierten Proteinen mit fluoreszierenden Sumo-Fallen Proteinen

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the cell by controlling protein stability, activity, interactions, and intracellular localization. They enable the cell to respond to signals and to adapt to changes in its environment. Alterations within these mechanisms can lead to severe pathological situations such as neurodegenerative diseases and cancers. The aim of the technique described here is to establish ub/ubls dependent PTMs profiles, rapidly and accurately, from cultured cell lines. The comparison of different profiles obtained from different conditions allows the identification of specific alterations, such as those induced by a treatment for example. Lentiviral mediated cell transduction is performed to create stable cell lines expressing a two-tags (6His and Flag) version of the modifier (ubiquitin or a ubl such as SUMO1 or Nedd8). These tags permit the purification of ubiquitin and therefore of ubiquitinated proteins from the cells. This is done through a two-step purification process: The first one is performed in denaturing conditions using the 6His tag, and the second one in native conditions using the Flag tag. This leads to a highly specific and pure isolation of modified proteins which are subsequently identified and semi-quantified by liquid chromatography followed by tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) technology. Easy informatics analysis of MS data using Excel software enables the establishment of PTM profiles by eliminating background signals. These profiles are compared between each condition in order to identify specific alterations which will then be studied more specifically, starting with their validation by standard biochemistry techniques.

This protocol aims at establishing ubiquitin (Ub) and ubiquitin-likes (Ubls) specific proteomes in order to identify alterations of these kind of post-translational modifications (PTMs), associated with a specific condition such as a treatment or a phenotype.

Profilierung von Ubiquitin und Ubiquitin-ähnlichen abhängigen posttranslationalen Änderungen und Identifizierung signifikanter Änderungen

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. They include ubiquitin-activating enzyme E1, ubiquitin-conjugating enzyme E2, and ubiquitin ligase E3. Unlike to E1 and E2, E3 ubiquitin ligases display substrate specificity. On the other hand, numerous deubiquitylating enzymes have roles in processing polyubiquitinated proteins. Ubiquitination can result in change of protein stability, cellular localization, and biological activity. Mutations of genes involved in the ubiquitination/deubiquitination pathway or altered ubiquitin system function are associated with many different human diseases such as various types of cancer, neurodegeneration, and metabolic disorders. The detection of altered or normal ubiquitination of target proteins may provide a better understanding on the pathogenesis of these diseases. &nbsp;Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro. These protocols are also useful to detect other ubiquitin-like small molecule modification such as sumolyation and neddylation.

Ubiquitination is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. Mutations of genes involved in this modification are associated with many different human diseases. Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro.

Detektion von Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Biologie

Evaluation of Substrate Ubiquitylation by E3 Ubiquitin-ligase in Mammalian Cell Lysates

Ubiquitylation is a post-translational modification which occurs in eukaryotic cells that is critical for several biological pathways' regulation, including cell survival, proliferation, and differentiation. It is a reversible process that consists of a covalent attachment of ubiquitin to the substrate through a cascade reaction of at least three different enzymes, composed of E1 (Ubiquitin-activation enzyme), E2 (Ubiquitin-conjugating enzyme), and E3 (Ubiquitin-ligase enzyme). The E3 complex plays an important role in substrate recognition and ubiquitylation. Here, a protocol is described to evaluate substrate ubiquitylation in mammalian cells using transient co-transfection of a plasmid encoding the selected substrate, an E3 ubiquitin ligase, and a tagged ubiquitin. Before lysis, the transfected cells are treated with the proteasome inhibitor MG132 (carbobenzoxy-leu-leu-leucinal) to avoid substrate proteasomal degradation. Furthermore, the cell extract is submitted to small-scale immunoprecipitation (IP) to purify the polyubiquitylated substrate for subsequent detection by western blotting (WB) using specific antibodies for ubiquitin tag. Hence, a consistent and uncomplicated protocol for ubiquitylation assay in mammalian cells is described to assist scientists in addressing ubiquitylation of specific substrates and E3 ubiquitin ligases.

We provide a detailed protocol for a ubiquitylation assay of a specific substrate and an E3 ubiquitin-ligase in mammalian cells. HEK293T cell lines were used for protein overexpression, the polyubiquitylated substrate was purified from cell lysates by immunoprecipitation, and resolved in SDS-PAGE. Immunoblotting was used to visualize this post-translational modification.

Evaluierung der Substratubiquitylierung mittels E3-Ubiquitin-Ligase in Säugetierzelllysaten

Ubiquitylation is a post-translational modification which occurs in eukaryotic cells that is critical for several biological pathways' regulation, ...

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate protein. The ubiquitination process occurs intracellularly in eukaryotes and regulates almost all basic cellular biological processes. Purification of ubiquitinated proteins aids the investigation of the role of ubiquitination in controlling the function of substrate proteins. Here, a step-by-step procedure to purify ubiquitinated proteins in mammalian cells is described with the p53 tumor suppressor protein as an example. Ubiquitinated p53 proteins were purified under stringent nondenaturing and denaturing conditions. Total cellular Flag-tagged p53 protein was purified with anti-Flag antibody-conjugated agarose under nondenaturing conditions. Alternatively, total cellular His-tagged ubiquitinated protein was purified using nickel-charged resin under denaturing conditions. Ubiquitinated p53 proteins in the eluates were successfully detected with specific antibodies. Using this procedure, the ubiquitinated forms of a given protein can be efficiently purified from mammalian cells, facilitating studies on the roles of ubiquitination in regulating protein function.

The protocol describes a step-by-step method to purify ubiquitinated proteins from mammalian cells using the p53 tumor suppressor protein as an example. Ubiquitinated p53 proteins were purified from cells under stringent nondenaturing and denaturing conditions.

Aufreinigung ubiquitinierter p53-Proteine aus Säugetierzellen

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

Messung von ubiquitylierten, SUMOylierten und ADP-ribosylierten DNA-Protein-Vernetzungen

Quantitative Detection of DNA-Protein Crosslinks and Their Post-Translational Modifications

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, methyltransferases, etc.) malfunctioning, or exogenous agents such as chemotherapeutics and crosslinking agents. Once DPCs are induced, several types of post-translational modifications (PTMs) are promptly conjugated to them as early response mechanisms. It has been shown that DPCs can be modified by ubiquitin, small ubiquitin-like modifier (SUMO), and poly-ADP-ribose, which prime the substrates to signal their respective designated repair enzymes and, in some cases, coordinate the repair in sequential manners. As PTMs transpire quickly and are highly reversible, it has been challenging to isolate and detect PTM-conjugated DPCs that usually remain at low levels. Presented here is an immunoassay to purify and quantitatively detect ubiquitylated, SUMOylated, and ADP-ribosylated DPCs (drug-induced topoisomerase DPCs and aldehyde-induced non-specific DPCs) in vivo. This assay is derived from the RADAR (rapid approach to DNA adduct recovery) assay that is used for the isolation of genomic DNA containing DPCs by ethanol precipitation. Following normalization and nuclease digestion, PTMs of DPCs, including ubiquitylation, SUMOylation, and ADP-ribosylation, are detected by immunoblotting using their corresponding antibodies. This robust assay can be utilized to identify and characterize novel molecular mechanisms that repair enzymatic and non-enzymatic DPCs&#160;and has the potential to discover small molecule inhibitors targeting specific factors that regulate PTMs to repair DPCs.

Autor im Rampenlicht: Quantitativer Nachweis von DNA-Protein-Vernetzungen und deren posttranslationale Modifikationen  

The present protocol highlights a modified method to detect and quantify DNA-protein crosslinks (DPCs) and their post-translational modifications (PTMs), including ubiquitylation, SUMOylation, and ADP-ribosylation induced by topoisomerase inhibitors and by formaldehyde, thereby allowing the study of the formation and repair of DPCs and their PTMs.

Quantitativer Nachweis von DNA-Protein-Vernetzungen und deren posttranslationale Modifikationen

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

Bäckerhefe Protein Extraktion und Reinigung für das Studium der Funktion, Wechselwirkungen, und post-translationale Modifikationen

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Protein Purification Technik, die Erkennung von Sumoylierung und Ubiquitinierung von Bäckerhefe Kinetochor Proteine Ndc10 und Ndc80 Erlaubt

Zusammenfassung

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Nachweis von Protein-Ubiquitinationsstellen durch Peptidanreicherung und Massenspektrometrie

Lokalisierung von SUMO-modifizierten Proteinen mit fluoreszierenden Sumo-Fallen Proteinen

Profilierung von Ubiquitin und Ubiquitin-ähnlichen abhängigen posttranslationalen Änderungen und Identifizierung signifikanter Änderungen

Detektion von Protein Ubiquitination

Evaluierung der Substratubiquitylierung mittels E3-Ubiquitin-Ligase in Säugetierzelllysaten

Aufreinigung ubiquitinierter p53-Proteine aus Säugetierzellen

Quantitativer Nachweis von DNA-Protein-Vernetzungen und deren posttranslationale Modifikationen

Quantitativer Nachweis von DNA-Protein-Vernetzungen und deren posttranslationale Modifikationen

Quantitativer Nachweis von DNA-Protein-Vernetzungen und deren posttranslationale Modifikationen

Bäckerhefe Protein Extraktion und Reinigung für das Studium der Funktion, Wechselwirkungen, und post-translationale Modifikationen

Protein Purification Technik, die Erkennung von Sumoylierung und Ubiquitinierung von Bäckerhefe Kinetochor Proteine ​​Ndc10 und Ndc80 Erlaubt

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Nachweis von Protein-Ubiquitinationsstellen durch Peptidanreicherung und Massenspektrometrie

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Aufreinigung ubiquitinierter p53-Proteine aus Säugetierzellen

Quantitativer Nachweis von DNA-Protein-Vernetzungen und deren posttranslationale Modifikationen

Quantitativer Nachweis von DNA-Protein-Vernetzungen und deren posttranslationale Modifikationen

Quantitativer Nachweis von DNA-Protein-Vernetzungen und deren posttranslationale Modifikationen

Bäckerhefe Protein Extraktion und Reinigung für das Studium der Funktion, Wechselwirkungen, und post-translationale Modifikationen

Protein Purification Technik, die Erkennung von Sumoylierung und Ubiquitinierung von Bäckerhefe Kinetochor Proteine Ndc10 und Ndc80 Erlaubt