Wir danken allen Mitgliedern der Kerscher Labor für ihre Unterstützung. Wir danken Mark für Hochstrasser Hefestamm MHY3765. Diese Arbeit wurde von der NSF 1051970 (OK) und Howard Hughes Medical Institute Undergraduate Reisestipendium und Monroe Scholars Program Grant (ES) unterstützt.

Reinigung von 6xHis-markierte Proteine ​​in Hefe-Zellen unter nativen Bedingungen ausgedrückt 1. Wachstum von Hefe-Zellen und Induktion der Proteinexpression (Geändert von 2) Optional: Verwenden logarithmisch wachsenden Hefekulturen Ausdruck Protein von Interesse anstelle der Galaktose-induzierten Kulturen beschrieben. <ol><li> Verwandeln Zellen eines Gal + Hefestamm mit einem Plasmid, das ein Galaktose-induzierbaren 6XHIS-markierten Protein der Wahl. Siehe zum Beispiel Reagenzien Liste. </li><li> Impfen Transformanten in 5 ml geeigneten selektiven Medien (z. B. SD-Uracil) mit 2% Saccharose. Inkubation bei 30 ° CO / N, rotierend. </li><li> Verdünnen O / N-Kultur, so dass die optische Dichte bei 600 nm 0,3 (OD 600 = 0,3) misst in 33 ml selektivem Medium mit 2% Saccharose. Wachsen bei 30 ° C, Zittern (Δ150 rpm). </li><li> Wenn die Kultur hat OD 600 = 0,8 erreichte-1.5, Induzieren die Expression des gewünschten Proteins durch Zugabe von 17 ml YEP 3x mit 6% Galactose (in der nachfolgenden Tabelle 1) bei einer endgültigen Konzentration von 1x YEP mit 2% Galaktose. Insgesamt Kultur Volumen ist nun 50 ml. Inkubieren, Schütteln, bei 30 ° C für weitere 5-6 Stunden. Hinweis: das Kulturvolumen variiert werden kann. In Schritt 1.3, verdünnt in zwei Drittel der gewünschte Endvolumen. In Schritt 1.4, fügen Sie ein Drittel der endgültigen Volumen von 3x YEP / 6% Galaktose. </li><li> Messen der OD 600 der induzierten Kultur und Zentrifuge Δ150-200 OD 600 Einheiten von Zellen für 5 min bei 5000 rpm bei 4 ° C. </li><li> Zellpellet mit 1 ml eiskaltem 1x PBS mit 1x Proteaseinhibitorcocktail und Transfer zu einem 2 ml Schraubdeckel Rohr. </li><li> Zentrifuge Zellen für 1 min bei 15.000 rpm bei 4 ° C. Überstand dekantieren. </li><li> Schnellfrostmedium Zellpellet in flüssigem Stickstoff gefolgt von unmittelbarer Zelllyse oder Lagerung bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung. </li></ol><ol><li> Um dem gefrorenen Zellpellets aus dem vorherigen Schritt, 200 ul acid-washed Glasperlen und 500 ul eiskaltem Lysepuffer (Rezept in Tabelle 1 oder verwenden Zelllysepuffer der Wahl). </li><li> Kurz und Abpipettieren. Es ist nicht erforderlich, um vollständig Zellpellet. Halten Röhrchen auf Eis zu allen Zeiten. Hinweis: Das Ende der Pipettenspitze kann, bevor und Abpipettieren geschnitten werden. </li><li> Bei 4 ° C, statt die Röhre (n) mit Zellen in der Kugelmühle, Balance, Schloss, und führen Sie die Maschine gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Führen Sie die Kugelmühle mit der Röhre (n) für 20 Sekunden bei 5,5 m / sec, dann auf matschigen Eis legen für 1 min. Wiederholen 6x insgesamt. </li><li> Löschen der extrahierten Proteine ​​durch Zentrifugation für 15 min bei 15.000 rpm bei 4 ° C. OPTIONAL: entfernen kleine Partikel durch Zentrifugation durch ein SpinX Filter. </li><li> Vorbereiten einer Probe der gesamten Zelle eXtract (WCE), um die Anwesenheit des Proteins von Interesse durch Western Blot bestätigen: <ol><li> In WCE entsprechenden OD 600 mit 2 Einheiten von Zellen (zB 5 ul Extrakt gelöscht, wenn 200 OD 600 Einheiten von Zellen wurden geerntet) bis 800 ul 20% Trichloressigsäure (TCA). Vortex mischen. </li><li> Zentrifuge für 2,5 min bei 15.000 rpm bei 4 ° C. Den Überstand umfüllen, aber seien Sie vorsichtig, um das Pellet zu erhalten. </li><li> In 800 ul 2% TCA dem Pellet und Wirbel der Röhre, durch Zentrifugation für 2,5 min bei 15.000 Upm bei 4 ° C. Den Überstand umfüllen, aber seien Sie vorsichtig, um das Pellet zu erhalten. </li><li> In 100 ul TCA Sample Buffer (Rezept in Tabelle 1), Vortex zu Pellets aufzulösen. Hinweis: Wenn die Probenpuffer sauer wird (wird gelb) nach Zugabe zu dem Pellet, fügen Aliquots Δ10 ul Tris base [1M], bis die Probe wieder blau. </li><li> Inkubation in einem 100 ° C Heizblock für 2-5 min. </li><li> Vortex again vollständig auflösen, wenn Reste von Pellet noch vorhanden sind. Pellets nach dieser Methode hergestellt werden, sind bekanntlich schwer vollständig zu lösen. Es kann Δ10 min Vortexen vollständig auflösen Pellets. </li><li> Shop Probe bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung. </li></ol></li><li> Schnellfrostmedium Aliquots restlichen gelöscht WCE in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung. </li></ol> 3. Batch Reinigung von Proteinen aus Hefe Zellhomogenaten Hinweis: Dieses Reinigungsverfahren wurde zur Reinigung von 6xHis-markierten Proteine ​​auf Co 2 + Metall Affinitätsharz optimiert. <ol><li> Resin Equilibration <ol><li> Für eine Probe geräumte WCE von Δ20-40 OD 600 Einheiten von Zellen hergestellt, fügen 50-100 ul Affinitätsharz in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Proteine ​​aus Zellen, die nicht zum Ausdruck hat das gewünschte Protein oder eine unspezifische Harz wie Amylose, extrahiert kann als Kontrolle verwendet werden,s für unspezifische Bindung. </li><li> Waschen Harz 5x mit 1 ml Waschpuffer: invertieren top-over-Boden bis Harz wird suspendiert, und dann drehen für 1 min bei 5.000 rpm bei 4 ° C. Saugen Sie den Überstand. Hinweis: Wenn die Durchführung Extraktion und Reinigung am selben Tag, Harz Äquilibrierung kann vor der Extraktion durchgeführt werden. </li></ol></li><li> Protein Binding für Affinity Purification <ol><li> 100-200 ul geklärte Lysat (Δ20-40 OD 600 Einheiten), 50-100 ul gewaschenen Perlen, und bringen das Gesamtvolumen auf 1 ml mit Lysepuffer. </li><li> Inkubation mit Nutation oder rocking bei 4 ° C für 2-5 Stunden. </li><li> Spin für 1 min bei 5.000 rpm bei 4 ° C. </li><li> Falls gewünscht, Speichern einer Probe der verbliebenen Überstand für die nachfolgende Analyse von ungebundenen Proteinen. TCA ausgefällt wie oben für die WCE (Schritt 2.6). </li><li> Waschen mit Harz gebundenen Proteine ​​5x mit 1 ml Waschpuffer durch einen Spin für 1 min bei 5.000 rpm bei gefolgt4 ° C. Die Proben Kälte während Wäschen. </li></ol></li><li> Elution der gebundenen Proteine <ol><li> In 150 ul Elutionspuffer zum Harz, nutieren bei 4 ° C für 5 min, Spin für 1 min bei 5.000 rpm bei 4 ° C und speichern Sie den Überstand in ein neues Röhrchen. OPTIONAL: Wiederholen 2x und Pool Elutionen. </li><li> Bereiten eluierten Probe für Western-Blot: Um 25 ul eluierten Proteine, fügen Sie 25 ul 2x Lithiumdodecylsulfat (LDS) Probenpuffer mit 2 ul β-Mercaptoethanol (BME) und Inkubation in einem 100 ° C Heizblock für 2 min. Hinweis: Standard-2X Laemmli Probenpuffer können ebenfalls verwendet werden. </li><li> Schnellfrostmedium überschüssige eluierte Protein in flüssigem Stickstoff. OPTIONAL: strip restlichen Proteine ​​aus Harz mit dem gleichen Volumen 2x LDS-Probenpuffer bei 65 ° C für 5 min, entfernen Sie die LDS-eluierten Proteine ​​in ein neues Röhrchen, dann fügen Sie 2 ul BME zu den eluierten Proteine, nicht an das Harz. Dieser Auftrag ist auf das Entfernen von Ionen oder Antikörper, die Konjugation sind zu vermeidented zu den Perlen. </li><li> Proben bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung. </li></ol></li><li> Western Blot und Sonde mit entsprechenden Antikörpern Proteine ​​zu visualisieren. <ol><li> Legen 10-20 ul (Δ1-3 OD 600 Einheiten) jeder Probe und 3-10 ul eines Proteins Leiter in einem SDS-PAGE-Gel der Wahl. Gels routinemäßig für dieses Protokoll verwendet werden, umfassen 4-12% Bis-Tris und 8% Tris-Glycin. </li><li> Führen Gel bei 200 V für 50 min. </li><li> Übertragen Proteine ​​aus Gel auf eine PVDF-Membran durch halbtrockenen Transfer bei 19 V für 20-30 min (Rezept in Tabelle 1). </li><li> Blockieren Membran in 4% milk/1x Tris gepufferte Kochsalzlösung-Tween (TBST) für 1 h bei RT oder O / N bei 4 ° C (in der nachfolgenden Tabelle 1). </li><li> Dazu werden die Membranen mit primären Antikörpers an das Epitop-markierten Proteins von Interesse in 4% milk/1x TBST für 1-3 Stunden bei Raumtemperatur oder O / N bei 4 ° C. </li><li> Waschen Sie die Membran 3x für jeweils 5 min mit 1x TBST. </li><li> Inkubieren Membran mit geeignetensekundären Meerrettich-Peroxidase (HRP)-konjugierten Antikörper für 1-3 h bei RT. </li><li> Waschen Sie die Membran 3x für je 15 min in einem großen Volumen von 1x TBST. </li><li> Titelbild Membran mit ECL Substrat und wickeln Sie sie in Frischhaltefolie. </li><li> Expose Membran zu filmen und zu entwickeln, um Proteine ​​zu visualisieren. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+construction+inSaccharomyces+cerevisiae.">Cell wall construction inSaccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 23 (3), 185-202 (2006).</li><li>Gelperin, D. M., White, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+genetic+analysis+of+the+yeast+proteome+with+a+movable+ORF+collection.">Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection.</a> Genes Dev. 19 (23), 2816-2826 (2005).</li><li>Caserta, E., Haemig, H. A. 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T., Lewis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+SUMO-modified+proteome+by+multiple+approaches+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Defining the SUMO-modified proteome by multiple approaches in Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Biol. Chem. 280 (6), 4102-4110 (2005).</li><li>Xie, Y., Rubenstein, E. M., Matt, T., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-independent+in+vivo+activity+of+a+SUMO-targeted+ubiquitin+ligase+toward+a+short-lived+transcription+factor.">SUMO-independent in vivo activity of a SUMO-targeted ubiquitin ligase toward a short-lived transcription factor.</a> Genes Dev. 24 (9), 893-903 (2010).</li><li>Daum, G. G., B&#246;hni, P. C. P., Schatz, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Import+of+proteins+into+mitochondria.+Cytochrome+b2+and+cytochrome+c+peroxidase+are+located+in+the+intermembrane+space+of+yeast+mitochondria.">Import of proteins into mitochondria. Cytochrome b2 and cytochrome c peroxidase are located in the intermembrane space of yeast mitochondria.</a> J. Biol. Chem. 257 (21), 13028-13033 (1982).</li><li>Deutscher, M. 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T. M., Cox, L. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+affinity+of+cholera+toxin+for+Ni2++ion.">The affinity of cholera toxin for Ni2+ ion.</a> Protein Eng. 11 (7), 577-581 (1998).</li><li>Hautbergue, G. G., Goguel, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+C-type+cyclin+Ctk2p+is+phosphorylated+and+rapidly+degraded+by+the+ubiquitin-proteasome+pathway.">The yeast C-type cyclin Ctk2p is phosphorylated and rapidly degraded by the ubiquitin-proteasome pathway.</a> Mol. Cell. Biol. 19 (4), 2527-2534 (1999).</li><li>Elmore, Z. C., Donaher, M., Matson, B. C., Murphy, H., Westerbeck, J. W., Kerscher, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sumo-dependent+substrate+targeting+of+the+SUMO+protease+Ulp1.">Sumo-dependent substrate targeting of the SUMO protease Ulp1.</a> BMC Biol. 9, 74 (2011).</li><li>Xie, Y., Kerscher, O., Kroetz, M. B., McConchie, H. F., Sung, P., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+Hex3.Slx8+heterodimer+is+a+ubiquitin+ligase+stimulated+by+substrate+sumoylation.">The yeast Hex3.Slx8 heterodimer is a ubiquitin ligase stimulated by substrate sumoylation.</a> J. Biol. Chem. 282 (47), 34176-34184 (2007).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Herstellung von intakten, nativen und posttranslational modifizierte Proteine ​​von Hefe-Zellen für down-stream Applikationen. Bevor dieses Protokoll, ist es wichtig zu bestimmen, ob das Protein von Interesse kann leicht in Proteinextrakte unter denaturierenden Bedingungen 12 hergestellt detektiert werden. Wenn polyklonale Antikörper nicht verfügbar sind, kann es vorteilhaft sein, Epitop-Markierung des Proteins von Interesse, so dass das Fusionsprotein auf Wes...

Die gewaltige Kraft der Hefegenetik ist legendär, aber die Vorbereitung und Analyse von nativen Proteinen aus Bäckerhefe, Saccharomyces cerevisiae, ist oft mit Problemen behaftet. Letzteres ist aufgrund der hohen mechanischen Festigkeit und Elastizität der Hefezellwand 1. Verschiedene Mittel sind für die enzymatische, chemische, mechanische und Druck auf die Unterbrechung des Hefe-Zellen zu erhalten, Ganzzell-Proteinextrakt 2-6 beschrieben. Diese Techniken sind sehr unterschiedlich in ihrer Wirksamkeit zu Zell-Vertreter, native Protein-Extrakte, die für spätere Analysen oder Reinigungsschritte verwendet werden können, zu erhalten. Zum Beispiel kann das Hefe-Zellwand mit lytischen Enzymen (zB Zymolyase) und die daraus resultierenden Sphäroblasten entfernt werden kann durch Scherung, Detergenzien oder osmotische Lyse, um Proteine ​​freizusetzen werden. Dieser Ansatz wurde erfolgreich als Ausgangspunkt für viele subzelluläre Fraktionierung eingesetzt, aber es erfordert langwierige Inkubationendie nicht kompatibel sind mit der Stabilität einiger Proteine ​​7. Proprietary Hefelyse Reagenzien (z. B. Waschmittel) für die chemische Extraktion von Proteinen von Hefezellen sind im Handel erhältlich, aber die Wirksamkeit dieser Reagenzien in Protein-Extraktion und ihre Wirkung auf nachfolgende biochemische Charakterisierung von Proteinen ist nicht immer klar, 8. Hochdruckhomogenisatoren, die oft als Französisch Pressen bezeichnet, effektiv zu brechen Hefezellen durch sie einer ersten hohen Druck und anschließend extrudiert durch eine kleine Öffnung in einer Druckzelle. Diese Technik produziert hochwertige Extrakte aber die Ausrüstung ist sehr teuer und nicht geeignet für kleine Mengen von Zellen oder mehrere Proben 9. Daher ist die mechanische Störung der Hefezellen in einer Kugelmühle oft die Methode der Wahl für die native Hefeprotein Zubereitungen 10. Diese Technik beinhaltet mechanische Zerstörung des Hefe-Zellwand mit Säure-waSchuppen Glasperlen, die mit einer Vielzahl von Schüttler, Vortexer oder Kugelmühlen durchgeführt werden kann. Insbesondere kann dieses Verfahren verwendet werden, um gleichzeitig zu verarbeiten mehrere kleine Proben (1 ml Zellen oder weniger) ist. Viele verschiedene Perlen oder Kugelmühle Störung Matrizen sind jetzt im Handel erhältlich für fast jede Art von Zelltyp in 2-ml-Röhrchen zu stören. Unter Berücksichtigung der sonstigen Techniken und Ausrüstung hat eine Perlmühle den zusätzlichen Vorteil, dass die Unterbrechung des Hefe-Zellen sehr schnell, die hilft, posttranslationale Modifikationen wie sumoylation erhalten auftritt, vor allem, wenn die entsprechenden Puffer mit Protease-und / oder Proteasom-Inhibitoren verwendet werden, und die Temperatur der Extrakte gesteuert wird. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die schnelle, effektive und zuverlässige Extraktion von endogenen und überexprimierten Proteine ​​unter schonenden Bedingungen mit dem Ziel, um Protein-Funktion, Interaktionen und post-translationale Modifikationen erhalten. Nährmedien, ZelllysepufferZusammensetzungen und Perlmühle Einstellungen optimiert, um Protein-Wechselwirkungen und posttranslationale Modifikationen wie sumoylation und Ubiquitinierung halten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1039">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Omni Bead Ruptor 24</td>
			<td style="width:124px;">Omni International</td>
			<td style="width:119px;">19-010</td>
			<td style="width:580px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Yeast ORF strain in BG1805</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>YSC3869</td>
			<td>GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pYES2.1 TOPO vector</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K4150-01</td>
			<td>GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction; contains a V5/6xHIS tag</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail (100x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1860932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">2.0 ml Skirted Tube with Tethered Screw Cap</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td style="width:119px;">C-3369-3</td>
			<td>Make sure that the tube properly fits in the bead ruptor</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glass beads, acid-washed, 425-600 &#181;m (30-40 US sieve)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">CLS8161</td>
			<td>Use for additional filtering of clarified lysate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TALON Metal Affinity Resin</td>
			<td style="width:124px;">Clontech</td>
			<td>635502</td>
			<td>For the purification of 6xHIS tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td>
			<td style="width:124px;">Life Technologies</td>
			<td>NP0007</td>
			<td>To prepare and/or elute samples prior to SDS-PAGE and Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel</td>
			<td style="width:124px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">NP0321BOX</td>
			<td>Precast gels often used for SDS-PAGE prior to Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Simply Blue</td>
			<td style="width:124px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">#LC6060</td>
			<td>Protein gel stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mammalian Lysis Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:119px;">G9381</td>
			<td>Alternative commercial lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-V5 agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A7345</td>
			<td>Method of immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ECL</td>
			<td style="width:124px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">WBKL S0 050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PVDF membrane</td>
			<td style="width:124px;">Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BIS-TRIS gels</td>
			<td style="width:124px;">Life Technologies</td>
			<td>NP0321BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">anti-myc antibody</td>
			<td style="width:124px;">Covance</td>
			<td style="width:119px;">mms-150R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">secondary antibody</td>
			<td style="width:124px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab97040</td>
			<td>Goat pAb to mouse IgG (HRP)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications

Homogenisierung Wulst Prügel ist eine schnelle und effiziente Möglichkeit, DNA, RNA, Proteine ​​und Metaboliten aus Hefe-Zellen, die notorisch schwer zu stören sind freizugeben. Hier beschreiben wir die Verwendung einer Perlmühle homogenisiert zur Gewinnung von Proteinen in Puffer optimiert, um die Funktionen, die Interaktion und post-translationalen Modifikationen von Proteinen zu erhalten. Logarithmisch wachsenden Zellen, die das Protein von Interesse in einem flüssigen Wachstumsmedium Wahl geworden. Die Nährmedien mit Reagenzien können ergänzt werden, um die Proteinexpression von Promotoren (zB Galaktose) zu induzieren, synchronisieren Zellzyklusstadium (zB Nocodazol) oder hemmen Proteasom-Funktion (zB MG132). Die Zellen werden dann pelletiert und in einem geeigneten Puffer, der Protease und / oder Phosphatase-Inhibitoren und entweder sofort verarbeitet oder in flüssigem Stickstoff für eine spätere Verwendung. Homogenisierung wird durch sechs Zyklen von 20 sec erreicht bead-Schlagen (5,5 m / sec), die jeweils von einem minütigen Inkubation auf Eis. Das erhaltene Homogenisat wird durch Zentrifugation geklärt und kleine Partikel kann durch Filtration entfernt werden. Die resultierende gelöscht Ganzzellextrakt (WCE) ausgefällt mit 20% TCA zur direkten Analyse des gesamten Proteine ​​durch SDS-PAGE, gefolgt von Western-Blotting. Extrakte eignen sich auch zur Affinitätsreinigung von spezifischen Proteinen, die Detektion von post-translationalen Modifikationen, oder der Analyse der Co-Reinigung von Proteinen. Wie bei den meisten Proteinreinigung Protokolle können einige Enzyme und Proteine ​​eine eindeutige Bedingungen oder Puffer-Zusammensetzungen für die Reinigung und andere möglicherweise instabil oder unlöslich ist unter den angegebenen Bedingungen. Im letzteren Fall kann das Protokoll präsentiert einen nützlichen Ausgangspunkt, um empirisch die besten Perlen-Prügel Strategie für Protein Extraktion und Reinigung. Wir zeigen die Extraktion und Reinigung eines epitopmarkierter SUMO E3 Ligase Siz1 ein Zellzyklusreguliertes Protein, das sowohl sumoyliert und phosphoryliert, sowie eine gezielte SUMO-Ubiquitin-Ligase-Untereinheit Slx5 wird.

Unsere repräsentative Ergebnisse zeigen, dass die beschriebenen Perlen-Schläge und Protein Extraktionsprotokoll nützlich für die reproduzierbare Herstellung von Proteinen für eine Vielzahl von Downstream-Anwendungen (in Tabelle 2). SDS-PAGE, gefolgt von Coomassie-Färbung von WCES gefolgt zeigen, dass eine Vielzahl von Proteinen (~ 12 bis&gt; 250 kDa) reproduzierbar aus Hefezellen (1A) extrahiert werden. Diskrete Bands über einen Bereich von Molekulargewichten sind bezeichnend fü...

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Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Die Herstellung von hochwertigen Hefezelle Extrakte ist ein notwendiger erster Schritt in der Analyse einzelner Proteine ​​oder ganze Proteomen. Hier beschreiben wir eine schnelle, effiziente und zuverlässige Homogenisierung Protokoll für Hefe-Zellen, die optimiert wurde, um Protein-Funktionen, Interaktionen und post-translationale Modifikationen erhalten.

Bäckerhefe Protein Extraktion und Reinigung für das Studium der Funktion, Wechselwirkungen, und post-translationale Modifikationen

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

budding-yeast-protein-extraction-purification-for-study-function

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JoVE Journal

Biology

24.8K Aufrufe.  The College of William & Mary.  Die Herstellung von hochwertigen Hefezelle Extrakte ist ein notwendiger erster Schritt in der Analyse einzelner Proteine ​​oder ganze Proteomen. Hier beschreiben wir eine schnelle, effiziente und zuverlässige Homogenisierung Protokoll für Hefe-Zellen, die optimiert wurde, um Protein-Funktionen, Interaktionen und post-translationale Modifikationen erhalten. 

Serie: Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

Mess-replikative Lebensspanne in der Hefe

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

Forschung

Biologie

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

Die Analyse der Entwicklung eines morphologischen Phänotyp als Funktion der Protein-Konzentration in Hefezellen

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 base pairs of DNA associated with two each of histones H2A, H2B, H3, and H41. The N-terminal tails of histones are rich in lysine and arginine and are modified post-transcriptionally by acetylation, methylation, and other post-translational modifications (PTMs). The PTM configuration of nucleosomes can affect the transcriptional activity of associated DNA, thus providing a mode of gene regulation that is epigenetic in nature 2,3. We developed a method called nucleosome ELISA (NU-ELISA) to quantitatively determine global PTM signatures of nucleosomes extracted from cells. NU-ELISA is more sensitive and quantitative than western blotting, and is useful to interrogate the epiproteomic state of specific cell types. This video journal article shows detailed procedures to perform NU-ELISA analysis.

Nucleosome ELISA (NU-ELISA) is a sensitive and quantitative method to detect global patterns of post-translational modifications in preparations of native, intact nucleosomes. These modifications include methylations, acetylations, and phosphorylations at specific histone amino acid residues, and hence NU-ELISA provides a global proteomic assay of the overall chromatin modification states of specific cell types.

Erkennung von Post-translationale Modifikationen auf Native Intact Nukleosomen mittels ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to infection via the recruitment and activation of immune complexes. Activation of immune complexes is associated with post-translational modifications (PTMs) of proteins, such as phosphorylation, glycosylation, or ubiquitination. Understanding how these PTMs are choreographed will lead to a better understanding of how resistance is achieved.
Here we describe a protein purification method for nucleotide-binding leucine-rich repeat (NB-LRR)-interacting proteins and the subsequent identification of their post-translational modifications (PTMs). With small modifications, the protocol can be applied for the purification of other plant protein complexes. The method is based on the expression of an epitope-tagged version of the protein of interest, which is subsequently partially purified by immunoprecipitation and subjected to mass spectrometry for identification of interacting proteins and PTMs.
This protocol demonstrates that: i). Dynamic changes in PTMs such as phosphorylation can be detected by mass spectrometry; ii). It is important to have sufficient quantities of the protein of interest, and this can compensate for the lack of purity of the immunoprecipitate; iii). In order to detect PTMs of a protein of interest, this protein has to be immunoprecipitated to get a sufficient quantity of protein.

We describe here a protocol for the purification and characterization of plant protein complexes. We demonstrate that by immunoprecipitating a single protein within a complex, so we can identify its post-translational modifications and its interacting partners.

Bezeichnung des Post-translationale Modifikationen von Pflanzenproteinkomplexe

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

Die Kombination von Einzelmolekül-Imaging und Manipulation für das Studium der Protein-DNA-Wechselwirkungen

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Discovering Protein Interactions and Characterizing Protein Function Using HaloTag Technology

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous proteomes, including those from viruses, bacteria, and yeast.&#160; In comparison, analysis of the human proteome lags behind, partially due to the sheer number of proteins which must be studied, but also the complexity of networks and interactions these present. To specifically address the challenges of understanding the human proteome, we have developed HaloTag technology for protein isolation, particularly strong for isolation of multiprotein complexes and allowing more efficient capture of weak or transient interactions and/or proteins in low abundance. &#160;HaloTag is a genetically encoded protein fusion tag, designed for covalent, specific, and rapid immobilization or labelling of proteins with various ligands. Leveraging these properties, numerous applications for mammalian cells were developed to characterize protein function and here we present methodologies including: protein pull-downs used for discovery of novel interactions or functional assays, and cellular localization. We find significant advantages in the speed, specificity, and covalent capture of fusion proteins to surfaces for proteomic analysis as compared to other traditional non-covalent approaches. We demonstrate these and the broad utility of the technology using two important epigenetic proteins as examples, the human bromodomain protein BRD4, and histone deacetylase HDAC1.&#160; These examples demonstrate the power of this technology in enabling &#160;the discovery of novel interactions and characterizing cellular localization in eukaryotes, which will together further understanding of human functional proteomics. &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;

HaloTag technology is a multifunctional technology which has shown significant success in isolation of both small and large protein complexes from mammalian cells.&#160; Here we highlight the advantages of this technology compared to existing alternatives and demonstrate its utility to study numerous aspects of protein function inside eukaryotic cells.

Die Entdeckung und Charakterisierung von Protein-Wechselwirkungen Protein-Funktion Mit HaloTag Technologie

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular function of many proteins. PTMs of kinetochore proteins that associate with centromeric DNA mediate faithful chromosome segregation to maintain genome stability. Biochemical approaches such as mass spectrometry and western blot analysis are most commonly used for identification of PTMs. Here, a protein purification method is described that allows the detection of both sumoylation and ubiquitination of the kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae. A strain that expresses polyhistidine-Flag-tagged Smt3 (HF-Smt3) and Myc-tagged Ndc10 or Ndc80 was constructed and used for our studies. For detection of sumoylation, we devised a protocol to affinity purify His-tagged sumoylated proteins by using nickel beads and used western blot analysis with anti-Myc antibody to detect sumoylated Ndc10 and Ndc80. For detection of ubiquitination, we devised a protocol for immunoprecipitation of Myc-tagged proteins and used western blot analysis with anti-Ub antibody to show that Ndc10 and Ndc80 are ubiquitinated. Our results show that epitope tagged-protein of interest in the His-Flag tagged Smt3 strain facilitates the detection of multiple PTMs. Future studies should allow exploitation of this technique to identify and characterize protein interactions that are dependent on a specific PTM.

This manuscript describes the detection of sumoylation and ubiquitination of kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

Protein Purification Technik, die Erkennung von Sumoylierung und Ubiquitinierung von Bäckerhefe Kinetochor Proteine ​​Ndc10 und Ndc80 Erlaubt

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone function is mediated by extensive post-translational modification by a myriad of nuclear proteins. These modifications are critical for nuclear integrity as they regulate chromatin structure and recruit enzymes involved in gene regulation, DNA repair and chromosome condensation. Even though a large part of the scientific community adopts antibody-based techniques to characterize histone PTM abundance, these approaches are low throughput and biased against hypermodified proteins, as the epitope might be obstructed by nearby modifications. This protocol describes the use of nano liquid chromatography (nLC) and mass spectrometry (MS) for accurate quantification of histone modifications. This method is designed to characterize a large variety of histone PTMs and the relative abundance of several histone variants within single analyses. In this protocol, histones are derivatized with propionic anhydride followed by digestion with trypsin to generate peptides of 5 - 20 aa in length. After digestion, the newly exposed N-termini of the histone peptides are derivatized to improve chromatographic retention during nLC-MS. This method allows for the relative quantification of histone PTMs spanning four orders of magnitude.

This protocol outlines a fully integrated workflow for characterizing histone post-translational modifications using mass spectrometry (MS). The workflow includes histone purification from cell cultures or tissues, histone derivatization and digestion, MS analysis using nano-flow liquid chromatography and instructions for data analysis. The protocol is designed for completion within 2 - 3 days.

Komplette Workflow zur Analyse von Histon-post-translationale Modifikationen Mit Bottom-up-Massenspektrometrie: Von Histone Extraktion in Datenanalyse

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

Anwendungen von pHluorin für Quantitative, Kinetic und Hochdurchsatz-Analyse von Endozytose in Bäckerhefe

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...