Dieses Protokoll erleichtert die Identifizierung und Isolierung lebender Korallenzellpopulationen auf einer Beschreibungsebene, die bisher nicht möglich war. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie den Zugriff auf eine Ebene der Zellspezifität ermöglicht, die bisher meist unerreichbar war. Demonstriert wird das Verfahren von Dr. Shannon Saigh, einem wissenschaftlichen Mitarbeiter der gemeinsam genutzten Ressource der Durchflusszytometrie am Sylvester Comprehensive Cancer Center.
Um das Durchflusszytometer für die Sortierung von lebenden Korallenzellen einzurichten, öffnen Sie eine neue Projektvorlage in der Durchflusszytometer-Software und wählen Sie die entsprechenden Laser für die Analyse im Laserpanel aus. Erstellen Sie dann ein Seitenstreuungs- oder Vorwärtsstreudiagramm in den entsprechenden Plots zum Einrichten der Gating- und Analysestrategie. Für die zytometrische Analyse und Sortierung der lebenden Korallenzellen laden Sie die Kontrollzelle unbefleckte Zellprobe in die Probenkammer des Zytometers und starten Sie den Lesevorgang.
Da Korallenzellen besonders zerbrechlich sind, halten Sie den Zytometerdruck niedrig, um eine Zelllyse zu verhindern. Passen Sie im Streudiagramm die Fotomultiplikatorspannung an, um die Punkte zu zentrieren, und beginnen Sie mit der Aufzeichnung der Ereignisse. Erstellen Sie im nach vorne gegen seitlichen Streudiagramm ein Tor um die Zellen um die 10 bis 4. Markierung auf der vorwärts streuenden x-Achse.
Ersetzen Sie die Kontrollprobe durch die erste Probe von gebeizten Zellen, und zeichnen Sie vor dem Anhalten etwa 10 000 Zellen auf. Dann richten Sie die Ereignisse, die für die befleckte Probengruppe einzigartig sind. Um lebende Korallenzellen zu sortieren, legen Sie nach der Auswahl der Zellpopulation, die für die Durchflusszytometer-Software von Interesse ist, ein Mikrozentrifugenrohr mit 250 bis 500 Mikrolitern der entsprechenden Sammellösung in die Zytometer-Sammlungskammer für jede zu sortierende Population.
Sobald eine angemessene Zeit vergangen ist, um Schutt auszuspülen, beginnen Sie mit der Sortierung der gewünschten Population, um irgendwo von 10.000 bis mehrere Millionen Zellen zu sammeln. Jedes Mal, wenn ein neuer Fleck, eine neue Art oder ein Sortierer verwendet wird, sortieren Sie mindestens 20.000 von Interesse sindde Zellen in 500 Mikroliter Färbemedium, damit eine Reinheitsprüfung auf der Interessenpopulation durchgeführt werden kann, und analysieren Sie die sortierten Zellen neu, um zu bestätigen, dass die Ereignisse innerhalb des Für die anfängliche Sortierung verwendeten Tores gelesen werden. Für In-vitro-Studien lagern Sie die sortierten Zellen auf Eis, bis sie in einen Inkubator oder eine sterilisierte Umgebung übertragen werden.
Um andere nichtzelluläre Partikel einzubauen, die nicht die gleiche Form oder Granularität wie die Korallenzellen haben, können Sie aus der Analyse entfernt werden, indem eine Torauswahl auf einem vorwärts- und seitlichen Streudiagramm erstellt wird. Die abgestorbenen Zellen können ausgeschlossen werden, indem das DAPI-Signal der ungefärbten und gefärbten Zellsuspensionen mit einem Histogramm verglichen und die hohen DAPI-exemitten Zellen ausgegoben werden. Parallel dazu können Zellen, die Autofluoreszenzsymbiodenesie ausrichten, durch Gating gegen Zellen mit dem hohen Signal im weit roten Kanal entfernt werden.
Nach diesem iterativen Gating-Prozess stellen die verbleibenden Zellen die intakten lebenden Korallenzellpopulationen ohne Symbiodenasie dar. Diese Zellen können dann in verschiedene Zellsubpopulationen eingeteilt werden, indem Sie Merkmale wie die Aktivität reaktiver Sauerstoffspezies und/oder den Lysomgehalt färben. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass einige Zellen zerbrechlicher sind als andere, und diesen Prozess so sorgfältig wie möglich durchzuführen.
Sobald bestimmte Zellen isoliert wurden, können sie für x-vivo-Funktionstests wie das Aufstellen von Zellkulturen und das Erstellen von transkriptomischen Profilen verwendet werden.
