Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur gleichzeitigen Isolierung von fibroadipogenen, Vorläuferzellen und Muskelstammzellen unter Verwendung von Fluoreszenzaktivatoren der Sortierung. Reine Populationen dieser Zellen sind eine Voraussetzung für das Verständnis ihrer biologischen Rolle unter physiologischen und pathologischen Bedingungen. Mit dieser Technik wurden Forbes und Muskelstammzellen identifiziert und entweder aus Achselhöhlen oder verletzten Muskeln isoliert.
Die hohe gefüllte Straflosigkeit von Forbes- und Muskelstammzellen hat es uns ermöglicht, diese Zellen für verschiedene nachgeschaltete Techniken wie Saccharintransplantation und Mudial-Mix-Analyse zu verwenden. Um zu beginnen, legen Sie die euthanasierte Maus-Rückenlage auf ein Sezierkissen und besprühen Sie sie mit 70% Ethanol Um eine Kontamination zu vermeiden, verwenden Sie eine Pinzette, um die Mitte der Bauchhaut der Maus zu kneifen und schneiden Sie etwa einen Zentimeter Öffnung horizontal. Greifen Sie die Wundränder und die Scheibe in der Maus, indem Sie die Öffnung in die entgegengesetzte Richtung ziehen, um die darunter liegenden Muskeln freizulegen, und legen Sie eine Seite der Hinterbeine frei.
Bevor Sie Muskeln sammeln, entfernen Sie intermuskuläres Fett zwischen den Oberschenkeln am proximalen Ende des Quadrizeps, um die Isolierung von fibroadipogenen Vorläuferzellen und Muskelstammzellen zu verbessern. Als nächstes, ohne das Gewebe zu beschädigen, verwenden Sie scharfe Pinzetten, um die Faszie zu brechen und abzulösen, um die Muskeln unter Tibialis anterior oder TA und Extensor digitorum longus oder EDL freizulegen. Führen Sie die scharfe Spitze der Pinzette unter die TA EDL-Muskeln, um die Muskeln von der Tibia zu lösen.
Schneiden Sie die Sehnen ab, befestigen Sie die TA EDL am Knöchel und während Sie sie mit einer Pinzette halten, trimmen Sie die Muskeln mit einer Schere entlang der Längslinie der TA EDL. Schneiden Sie die Sehnen um das Knie, um die gesamten TA EDL-Muskeln zu lösen. Legen Sie die Muskeln in eine sechs Zentimeter große Schale, die auf Eis gehalten wird.
Um die Gastrocnemius-Muskeln zu isolieren, schneiden Sie alle Sehnen am Knöchel und lösen Sie die Muskeln von Tibia und Fibula. Schneiden Sie um das Knie und übertragen Sie die Muskeln auf die Schale. Ziehen Sie die Faszie um den Quadrizeps ab und trennen Sie sie vom Femur, indem Sie die scharfe Spitze der Pinzette zwischen Muskel und Knochen führen.
Schneiden Sie die Sehnen um das Knie und trimmen Sie den Rest des Muskels, indem Sie entlang des Femurs schneiden, während Sie den Quadrizeps mit einer Pinzette am distalen Ende halten. Legen Sie die Muskeln in die sechs Zentimeter große Schale. Lösen Sie die Oberschenkelmuskulatur und die verbleibenden Muskeln um den Femur herum und übertragen Sie diese auf die Schale.
Sammeln Sie die Muskeln der Hinterbeine in einer auf Eis gehaltenen Schale. Waschmedium aus der Schale aspirieren und ein bis zwei Milliliter Muskeldissoziationspuffer hinzufügen, um die Muskeln feucht zu halten. Als nächstes hacken Sie die Muskeln gründlich Verwenden Sie ein Skalpell, um den Muskel zu reißen und zu schneiden, und schneiden Sie dann mit einer Schere den Muskel ein bis zwei Minuten lang in kleine Stücke, bis Sie eine Güllepaste aus gut gehacktem Gewebe erhalten.
Dann übertragen Sie die gehackten Muskeln in die konische Röhre, die Muskeldissoziationspuffer enthält. Verschließen Sie die Röhrchen mit Laborfolie und inkubieren Sie sie eine Stunde lang in einem 37 Grad Celsius heißen Wasserbad mit Rührwerk. Nach einer Stunde die Tube aus dem Shaker nehmen und auf 50 Milliliter füllen Mit Waschmedium zweimal vorsichtig umdrehen, um das Mischen zu gewährleisten.
Zentrifugieren Sie die Zellen in einem schwingenden Eimerrotor bei 250 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. 42 Milliliter Überstand in zwei neue Röhrchen überführen und acht Milliliter in der ursprünglichen Röhre belassen. Füllen Sie die neuen Röhrchen mit 21 Milliliter des Überstands bis zu 50 Milliliter mit Waschmedium.
Dann zentrifugieren Sie die Zellen bei 350 mal G für acht Minuten bei vier Grad Celsius. Saugen Sie den Überstand ab und halten Sie die Pellets auf Eis. Als nächstes fügen Sie einen Milliliter Kollagenasen zwei Stamm und einen Milliliter Dis-basierten Bestand in die ursprüngliche Röhre mit acht Milliliter Muskeldissoziationspuffer hinzu.
Mit einer serologischen Fünf-Milliliter-Pipette das Pellet 10 Mal resuspendieren, ohne zu verstopfen. Werfen Sie die Lösung in Richtung der Rohrwand aus und vermeiden Sie die Bildungsblasen. Die Röhrchen mit Laborfolie verschließen und in einem 37 Grad Celsius heißen Wasserbad mit Rühren für 30 Minuten inkubieren.
Nach 30 Minuten den Schlauch aus dem Shaker-Aspirat entfernen und die Muskelsuspension 10 Mal durch eine 10-Milliliter-Spritze mit einer 20-Gauge-Nadel auswerfen, jedes Röhrchen bis zu 50 Milliliter mit Waschmedium füllen und das Röhrchen umkehren. Dann bei 250 mal G fünf Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren und den Überstand in ein neues Röhrchen überführen. Acht Milliliter in der Originalröhre.
Füllen Sie das neue Röhrchen bis zu 50 Milliliter mit Waschmedium, zentrifugieren Sie die Zellen erneut bei 350 mal G für acht Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand und halten Sie das Pellet auf Eis. Legen Sie ein 40-Mikron-Nylonzellensieb in das originale 50-Milliliter-Konikusröhrchen mit acht Milliliter Waschmedium und befeuchten Sie das Sieb mit ein bis zwei Milliliter Waschmedium.
Während Sie das Sieb halten, verwenden Sie eine 10-Milliliter-Pipette, um das Pellet vorsichtig zu resuspendieren. Filtern Sie die Suspension durch das Zellsieb zurück in dasselbe Röhrchen, um den Zellverlust zu minimieren. Filtern Sie die anderen Rohrpellets zurück in das Originalrohr, indem Sie jedem Röhrchen vier bis fünf Milliliter Waschmedium hinzufügen, um die Pellets zu resuspendieren und die Lösung in das im Originalrohr positionierte Selbstsieb zu überführen.
Nachdem Sie alle Pellets in das originale 50-Milliliter-Röhrchen gesammelt haben, spülen Sie das Sieb mit weiteren vier bis fünf Milliliter Waschmedium aus. Verwenden Sie eine 1000-Mikroliter-Pipette, um die gesamte Flüssigkeit von der Unterseite des Selbstsiebs zu sammeln. Füllen Sie jedes Röhrchen mit Waschmedium bis zu 50 Milliliter und drehen Sie das Röhrchen um.
Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 250 mal G fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand sofort, ohne das Pellet zu stören, und resuspendieren Sie das Pellet in 600 Mikroliter Waschmedium. Die Suspension wird in ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt.
Antikörper CD 31 APC CD 45 APC SCA ein Pacific Blue VCAM ein Biotin und alpha sieben Integrin PE in ein zwei Millimeter Röhrchen mit Zellsuspension geben. Mischen und inkubieren Sie die Zellen vorsichtig in einem rotierenden Shaker bei vier Grad Celsius für 45 Minuten, um sie vor Licht zu schützen. Nach der Inkubation alle Röhrchen bis zu zwei Milliliter mit Waschmedium füllen und bei 250 mal G fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius zentrifugieren.
Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 300 Mikrolitern Waschmedium. Als nächstes fügen Sie Streptavidin-Antikörper in Röhrchen hinzu und inkubieren die Zellen in einem rotierenden Shaker bei vier Grad Celsius für 20 Minuten. Nach der Inkubation Röhrchen mit Streptavidin-Antikörpern auf zwei Milliliter mit Waschmedium füllen.
Dann zentrifugieren Sie die Röhrchen und saugen Sie den Überstand vollständig ab. Nach dem zweiten Waschen die Zellen im Versuchsröhrchen in 500 Mikroliter Waschmedium resuspendieren. Vorbefeuchten Sie eine Zellsiebkappe aus einem Fünf-Milliliter-Polystyrol-Rundrohr mit 200 Mikrolitern Waschmedium.
Die Zellsuspension aus dem Versuchsröhrchen in das Fünf-Milliliter-Polystyrol-Rundbodenrohr überführen und durch Schwerkraft filtern lassen. Drucken Sie das Zwei-Milliliter-Röhrchen mit der experimentellen Probensuspension mit 300 Mikrolitern Waschmedium aus und führen Sie es durch dieselbe Siebkappe. Verwenden Sie eine 200-Mikroliter-Pipette, um die gesamte Flüssigkeit von der Unterseite des Zellsiebs zu sammeln.
Verschließen Sie mit einer Kappe, lassen Sie die Schläuche auf Eis und schützen Sie sie vor Licht. Die Gating-Strategie für die Isolierung von fibroadipogenen Vorläufer- und Muskelstammzellen wird hier gezeigt. Das PD GFR alpha E G F P Knock in Reportermäusen exprimiert das H two B E G F P Fusionsgen aus dem endogenen PD G FFR Alpha-Locus, was eine effiziente und spezifische Markierung der PD G GFR alpha-Linie ermöglicht.
Die Reinheit der isolierten Zellpopulationen wurde durch Immunfärbung von GFP-positiven fibroadipogenen Vorläuferzellen und Muskelstammzellen mit PAC-seven-Antikörpern bestätigt. GFP-positiver fibroadipogener Vorläufer exprimierte den PAC-Seven-Marker nicht, während Muskelstammzellen mit diesem Antikörper reagierten. Alle GFP-exprimierenden Zellen waren positiv für SCA one und negativ für CD 31, CD 45 VCAM one und alpha seven Integrin.
Der fibroadipogene Vorläufer und die Muskelstammzellen, die von Mäusen isoliert wurden, die sieben Tage nach der Verletzung mit intramuskulären Injektionen von keinem Toxin verletzt wurden, werden gezeigt. Wenn Muskelstammzellen aktiviert werden, wird eine Zunahme der Zellgröße aktiviert. Es ist wichtig, die Parameter F SCA und SS CA anzupassen und das Gate zu erweitern, um diese Zellen in der Mitte einzubeziehen.
Die Quantifizierung von fibroadipogenen Vorläufer- und Muskelstammzellen in unverletzten und sieben Tage nach der Verletzung von TA-Muskeln wird hier gezeigt. Obwohl der Höhepunkt und die Proliferation zwischen den Tagen zwei und drei beobachtet wurden, war eine geringe Rate proliferierender Zellen sieben Tage nach der Verletzung immer noch bemerkenswert. Die Durchführung des richtigen Muskelhackens ist von entscheidender Bedeutung, um eine einzelne Zelle freizusetzen.
Darüber hinaus wird die Mononukleotidzellisolierung erreicht, indem die Suspension mit einer 20-Gau-Nadel zu einer 10-Milliliter-Spritze geführt wird. Diese Technik wird Wissenschaftlern helfen, das biologische transkriptionelle und epigenomische Profil von Forbes und Muskelstammzellen unter normalem Zustand und während der tieferen Stadien der Muskelregeneration zu untersuchen.
