Dieses Protokoll kann für die Biosynthese von Cercosporinen durch mikrobielle Fermentation verwendet werden, die wiederum verwendet werden kann, um stickstoffhaltige Heterozyklen unter grünen und milden Bedingungen zu synthetisieren. Ein Vorteil dieser Technik ist, dass sie als Brücke zwischen den mikrobiellen Fermentationsmethoden und den organischen Synthetisierungsprozessen verwendet werden kann. Stickstoffhaltige Heterozyklen sind nicht nur ein wichtiges Skelett für viele Naturprodukte mit Bioaktivitäten, sondern sie sind synthetische Vorläufer für viele Agrochemikalien und Medikamente.
Das Verfahren mit Philippe Icyishaka demonstriert Yan Zhang, ein Techniker aus meinem Labor. Für die Alpha-Halo-N-Acyl-Hydrazone-Präparation 10 Millimolar Keton und 10 Millimolar Benzoylhydrazin in einen Kolben wiegen. 20 Milliliter Methanol in den Kolben geben und den Kolben mit einer Rührstange und einem Gummistopfen ausstatten.
250 Mikroliter Salzsäure langsam in das Gemisch injizieren und den Kolben bei Raumtemperatur in die Luft gießen. Nach einer Stunde den Niederschlag nach der Reaktion durch Filtration sammeln und das Produkt mit Aceton waschen. Trocknen Sie dann den Niederschlag durch Vakuum, und identifizieren Sie das Produkt durch NMR.
Um Cercosporin vorzubereiten, laden Sie einen Dreiliter-Schüttelkolben mit einem Liter S-7 Medium auf und impfen Sie die Cercosporin-produzierende Sorte in den Schüttelkolben. Kultur die Mischung unter Lichtbedingungen bei 135 Umdrehungen pro Minute und 25 Grad Celsius für zwei Wochen. Am Ende der Inkubation verwenden Sie eine Vakuumpumpe, um die Fermentationsbrühe einer Vakuumfiltration zu unterwerfen, und extrahieren Sie das Pellet und den Überstand separat mit drei 50-Milliliter-Volumen Dichlormethan.
Sammeln Sie das Pellet zum Trocknen in einem Gefriertrockner und kombinieren Sie die organischen Phasen. Waschen Sie die organischen Phasen mit Wasser zwei bis drei Mal, und konzentrieren Sie die Lösung unter Vakuum. Lösen Sie den Rückstand mit analytischem Methanol auf und filtern Sie das Produkt durch eine organische Mikrofiltrationsmembran mit 18 Mikrometern.
Reinigen Sie dann das Cercosporin mit einer Sephadex LH-20-Säule und identifizieren Sie das Produkt per HPLC nach Standardprotokollen. Zur Zubereitung von 1, 2, 3-Thiadiazol das gesamte Volumen des Alpha-Halo-N-Acyl-Hydraons, ein Milligramm Cercosporin, 27 Milligramm Kaliumtert-Butoxid und 39 Milligramm Kaliumthiocyanat in ein 10-Millimeter-Schlenk-Rohr mit Gummistopfen und Rührstab geben. Reinigen Sie das Schlenk-Rohr dreimal mit Sauerstoff, bevor Sie zwei Milliliter trockenes Acetonitril in das Rohr injizieren.
Unterziehen Sie das Rohr 16 Stunden lang einer fünf Watt,blauen LED von unten, bevor Sie viermal mit 15 Millilitern gesättigter Natriumchloridlösung waschen. Nach der letzten Wäsche die wässrige Phase kombinieren und die wässrige Phase mit vier 15-Milliliter-Volumen Ethylacetat wiederextrahieren. Kombinieren Sie die organische Phase und trocknen Sie mit wasserfreiem Natriumsulfat.
Entfernen Sie das Lösungsmittel mit einem Vakuumverdampfer. Um das Produkt mit dünnschichtiger Chromatographie zu reinigen, zeichnen Sie eine gerade Linie auf die Kieselsäureplatte und fügen Sie das gelöste Produkt in die Linie ein. Legen Sie die Kieselsäureplatte in den Chromatographiezylinder mit 10 bis 1 PE auf EA. Danach die Kieselsäure in DCM auflösen.
Entfernen Sie das Kieselsäure aus dem Produkt durch Filtration, und trocknen Sie das DCM mit einem Rotationsverdampfer. Identifizieren Sie dann die Verbindung durch NMR nach Standardprotokoll. Zur Vorbereitung von 1, 4, 5, 6-Tetrahydropyridazin das gesamte Volumen der Alpha-Halo-N-Acyl-Hydrazone, 2,7 Milligramm Cercosporin und 195 Milligramm Cäsiumcarbonat in ein 10-Milliliter-Schlenk-Rohr mit Gummistopfen und Rührstab geben.
Spülen Sie das Schlenk-Rohr dreimal mit Stickstoff und injizieren Sie zwei Milliliter Acetonitril in Wasser in die Röhre. Unterziehen Sie das Schlenk-Rohr 16 Stunden lang einer fünf Watt,blauen LED von unten, gefolgt von vier Wäschen mit 15 Millilitern gesättigtem Natriumchlorid pro Wäsche. Kombinieren Sie die wässrige Phase und extrahieren Sie die wässrige Phase mit vier 15-Milliliter-Volumen Ethylacetat.
Kombinieren Sie die organische Phase und trocknen Sie mit wasserfreiem Natriumsulfat. Entfernen Sie das Lösungsmittel mit einem Vakuumverdampfer. Um das Produkt mit dünnschichtiger Chromatographie zu reinigen, zeichnen Sie eine gerade Linie auf die Kieselsäureplatte und fügen Sie das gelöste Produkt in die Linie ein.
Legen Sie die Kieselsäureplatte in den Chromatographiezylinder mit 10 bis 1 PE auf EA. Danach die Kieselsäure in DCM auflösen. Entfernen Sie das Kieselsäure aus dem Produkt mit Filtration, und trocknen Sie das DCM mit einem Rotationsverdampfer. Identifizieren Sie dann die Verbindung durch NMR nach Standardprotokoll.
Diese repräsentativen Ergebnisse zeigen, wie 4-Aryl-1, 2, 3-Thiadiazole und 1, 4, 5, 6-Tetrahydropyridazine bequem durch Cercosporin-katalysierte photokatalytische Reaktionen aus Alpha-Halo-N-Acyl-Hydraon synthetisiert werden können. Das Erfassungsverfahren 4-aryl-1, 2, 3-thiadiazoles eignet sich für Substrate, die sowohl elektronen- als auch elektronenakzeptierende Gruppen im Phenylring tragen und die gewünschten Produkte mit moderaten bis guten Erträgen liefern. Denken Sie immer daran, Stickstoff und Sauerstoff für zwei verschiedene Kategorien der Reaktionen zu verwenden.
