J. Chua, D. Chabot und A. Friedlander entwarfen die im Manuskript beschriebenen Verfahren. J. Chua und T. Putmon-Taylor führten die Experimente durch. D. Chabot führte eine Datenanalyse durch. J. Chua schrieb das Manuskript.
Die Autoren danken Kyle J. Fitts für die hervorragende technische Unterstützung.
Die Arbeit wurde von der Defense Threat Reduction Agency unterstützt. VAXBT.03.10.RD.015, Plannummer 921175.
Meinungen, Interpretationen, Schlussfolgerungen und Empfehlungen sind die der Autoren und werden nicht unbedingt von der US-Armee unterstützt. Der Inhalt dieser Veröffentlichung spiegelt nicht unbedingt die Ansichten oder Richtlinien des Verteidigungsministeriums wider, noch impliziert die Erwähnung von Handelsnamen, kommerziellen Produkten oder Organisationen eine Billigung durch die US-Regierung.

In Übereinstimmung mit dem Tierschutzgesetz, der Politik des öffentlichen Gesundheitswesens und anderen Bundesgesetzen und -vorschriften für Tiere und Tierversuche wurde die hier beschriebene Forschung im Rahmen eines vom Institutionellen Tierpflege- und Nutzungsausschuss genehmigten Protokolls durchgeführt. Die Einrichtung, in der diese Forschung durchgeführt wurde, ist von der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care, International akkreditiert und hält sich an die Grundsätze, die im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren, National Research Council, 201124, angegeben sind.
1. Kultur und Pflege der Zelllinie, RAW 264.7
HINWEIS: Die folgenden Verfahren müssen mit aseptischen Techniken durchgeführt werden.
<ol><li>Erhitzen Sie das fetale Rinderserum (FBS) in einem 56 °C-Wasserbad für 30 min, um die Komplementzulage zu inaktivieren. HINWEIS: Die Inaktivierungszeit von 30 min beginnt, wenn FBS 56 °C erreicht. Um die Temperatur zu überwachen, erhitzen Sie eine ähnliche Wassermenge in einem Becher im selben Wasserbad. Sobald das Wasser 56 °C erreicht, beginnen Sie den 30 min Countdown für FBS. Alternativ ist auch die wärmeinaktivierte FBS im Handel erhältlich.</li>
	<li>Bereiten Sie Medium für RAW 264.7 Zellen vor, indem Sie 90% DMEM mit hoher Glukose und 10% hitzeinaktiviertem FBS (v/v) kombinieren. L-Glutamin zu einer Endkonzentration von 6 mM hinzufügen. HINWEIS: DMEM mit hoher Glukose wird mit 4 mM L-Glutamin formuliert. Die Ergänzung von L-Glutamin zu 6 mM fördert das gleichmäßige Zellwachstum. 100 U/ml Penicillin und 100 g/ml Streptomycin können hinzugefügt werden, um eine Kontamination zu verhindern. Eine andere häufige murine Zelllinie, J774A.1, kann auch verwendet werden und wird unter ähnlichen Bedingungen angebaut.</li>
	<li>Eine gefrorene Durchstechflasche mit Zellen in einem 37 °C-Wasserbad auftauen und aus dem Bad entfernen, sobald sie schmilzt. Fügen Sie den Inhalt aseptisch zu 5 ml komplettem Medium in einem konischen Rohr hinzu. Konische Röhre zweimal inumieren und bei 300 x g für 5 min zu Pelletzellen drehen.</li>
	<li>Aspirieren Sie das Medium mit einer sterilen Pasteur-Pipette, die an einem Vakuum befestigt ist, um Gefriermittel zu entfernen. Zellpellet in 5 ml frischem Medium resuspendieren.</li>
	<li>Transfer Suspension zu einem Gewebe Kultur behandelt Kolben oder Schale. Fügen Sie genügend Medium hinzu, um den Boden des Kolbens vollständig zu bedecken und wirbeln, um Zellen gleichmäßig zu verteilen. Geben Sie die Durchgangsnummer an, die mit "1" beginnt.</li>
	<li>Inkubationszellen bei 37 °C in Gegenwart von 5%CO2 und Feuchtigkeit bis 95% bis 100% Konfluenz erreicht wird. Überprüfen Sie die Zellen täglich unter dem Mikroskop, beginnend mit dem zweiten Tag der Inkubation. Lassen Sie die Zellen nicht >100% Konfluenz erreichen, da dies dazu führt, dass die Zellen abheben und absterben. HINWEIS: Die Zeit, die benötigt wird, um die Konfluenz zu erreichen, hängt davon ab, wie viele lebende Zellen plattiert wurden und die Wachstumsfläche des Kolbens. Daher ist es ratsam, die Zellen täglich zu überprüfen.</li>
	<li>Subkulturzellen durch Abkratzen und Verdünnen des Zellbestands in frischem Medium, wodurch mindestens zwei Tage Wachstum zwischen den Abkratzungen möglich sind. Erhöhen Sie die Durchgangszahl um 1 mit jeder Subkultur. HINWEIS: Das Passieren und sofortiges Abkratzen am nächsten Tag führt zu einem schnelleren Verlust der allgemeinen Zellhaftung im Laufe der Zeit. RAW 264.7-Zellen sollten nur bis etwa Durchgang 15 verwendet werden.</li>
	<li>Um RAW 264.7-Zellen für den OAA-Assay zu verplatten, ersetzen Sie es durch frisches Medium und verwenden Sie einen Zellschaber, um Zellen vorsichtig vom Kolben abzukratzen. Pipette nach oben und unten, um die Zellklumpen für eine einfachere Zellzählung aufzubrechen. HINWEIS: Die traditionelle Methode zum Unterteilen von RAW 264.7 ist das Abkratzen. Nach unserer Erfahrung führt die Verwendung von Trypsin dazu, dass RAW 264.7-Zellen im Laufe der Zeit schneller an Haftung verlieren als beim Abkratzen.</li>
	<li>Um Zellen zu zählen, verdünnen Sie gleiche Volumen von Zellen und Trypan-Blau-Lösung. Legen Sie 10 L auf ein Hämozytometer. Beobachten und zählen Sie die Anzahl der lebenden Zellen, die den Farbstoff ausschließen, mit einem invertierten zusammengesetzten Mikroskop mit einer 10-fachen Objektivlinse.</li>
	<li>Platte 1,4 x 104 lebensfähige Zellen pro Brunnen in einer 96 gut 0,15 m dicken Glas-Flachbodenplatte (Platte #1). Lassen Sie Zellen für 3 Tage wachsen. Ersetzen Sie das Medium einen Tag vor der Ausführung von OAA. HINWEIS: Nach 3 Tagen inkubationszeit, sollte die Anzahl der Zellen etwa 5 x 104/ well sein.</li>
</ol>2. Bakterielle Kultur und Präparate
HINWEIS: Die in diesem Protokoll verwendete Bakterienart ist ein verkapselter virulenter Stamm, B. anthracis Ames. Alle Manipulationen mit dieser Art erfordern angemessene Biosicherheits- und Sicherheitsabstände und müssen in einem biologischen Sicherheitsschrank der Klasse II oder Klasse III in einem BSL-3-Labor durchgeführt werden. Befolgen Sie die institutionellen Betriebsverfahren für BSL-3-Arbeiten und für die Verwendung persönlicher Schutzausrüstung enden, wenn Sie mit Bakterien umgehen.
<ol><li>Bereiten Sie die Gehirnherzinfusion (BHI) Brühe vor, indem Sie 37 g BHI-Pulver in 1 L Wasser auflösen und 15 min bei 121 °C autoklavieren. Brühe bei Umgebungstemperatur aufbewahren.</li>
	<li>8% Natriumbicarbonatlösung in Wasser vorbereiten und mit einer 0,20 m Filterspritze sterilisieren. Lösung bei 4 °C lagern und innerhalb von 1 Tag verwenden.</li>
	<li>8 g Nährwertbrühe, 3 g Hefeextrakt und 15 g Agar in 1 L Wasser mischen, um NBY-Agarplatten zuzubereiten. Autoklav bei 121 °C für 15 min. Gießen Sie in Petrischalen und lassen Sie zu erstarren. Platten bei 4 °C lagern. HINWEIS: NBY-Agarplatten können mit oder ohne Natriumbicarbonat hergestellt werden. Die Zugabe von Natriumbicarbonat zu Brühe nümern und Agarplatten induziert das Wachstum von Schleimhautkolonien, die aus verkapselten Bazillen bestehen. Die Endkonzentration von Natriumbicarbonat in flüssigen und festen Medien beträgt 0,8%.</li>
	<li>Bereiten Sie Kulturbrühe für B. Anthracis vor, indem Sie 50% autoklavierte BHI-Brühe, 40% FBS und 10% Natriumbicarbonatlösung (v/v) mischen. HINWEIS: Diese Brühe ist formuliert, um kurze Ketten von gekapselten Bazillen zu produzieren.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Master-Platte von B. anthracis vor, indem Sie sie für die Isolierung auf einer NBY-Agarplatte von einem Sporenbestand einen Tag vor der Kultivierung in brüten. Bei 37 °C inkubieren.</li>
	<li>30 ml Kulturbrühe in einem entlüfteten 250 ml Kolben mit mehreren Kolonien von B. anthracisimpfen. HINWEIS: Ein bestimmtes Volumen-Oberflächen-Verhältnis von Brühe, wie hier angegeben, ist erforderlich, um maximal gekapselte Bazillen zu produzieren.</li>
	<li>Schütteln Sie die BrüheKultur bei 125 Rpm, 37 °C mit 20%CO2 und Luftfeuchtigkeit für 18–24 h. HINWEIS: Der Anbau von B. Anthracis bei Temperaturen über 37 °C kann die Kapselproduktion hemmen.</li>
	<li>Verwenden Sie negative Färbung mit Indientinte, um eine ausreichende Verkapselung zu gewährleisten und sicherzustellen, dass Bazillen in kurzen Ketten (1–5 Bacilli/Kette) vor der Fixierung sind (siehe Abschnitt 3).</li>
	<li>Um koloniebildende Einheiten (CFU) zu bestimmen, verdünnen Sie seriell 100 l Kultur 1:10 in Phosphatgepufferte Kochin (PBS) Lösung und Plattenkultur Verdünnungen auf Schafsblut Agarplatten. 12–18 h bei 37 °C inkubieren. Zählen Sie KBE und bestimmen Sie die Anzahl der Bakterien pro ml Kultur. HINWEIS: Die Zählung kann auch mit einem Hämozytometer unter dem Mikroskop durchgeführt werden, sobald die Bakterien fixiert sind. Dies wird jedoch nicht empfohlen, da die Bazillen bei geringer Vergrößerung schwer zu erkennen sind.</li>
	<li>Fügen Sie 16% Paraformaldehyd (PF) in das gesamte Volumen der Bakterienkultur mit einer Endkonzentration von 4% PF hinzu, um die Bacilli zu fixieren. Langsam auf einem Shaker bei Umgebungstemperatur für 7 Tage bewegen. HINWEIS: Sieben Tage Inkubation in 4% PF basiert auf dem institutionellen Standardverfahren DER USAMRIID zur Fixierung vegetativer Bazillen.</li>
	<li>Um das Fixativ zu entfernen und sterilitätsprüfen, waschen Sie dreimal 4 ml (10 % Volumen) fester bakterieller Suspension in einem 50 ml konischen Rohr durch Zentrifugation bei ≥3000 x g für 45 min und mit einer 30 ml/Waschanlage mit PBS. Bewahren Sie die verbleibende Probe in 4% PF bei 4 °C auf. HINWEIS: Nach dem Pellet ist das bakterielle Pellet aufgrund des Vorhandenseins einer Kapsel flauschig. Achten Sie darauf, das Pellet beim Waschen nicht zu stören. Es ist notwendig, alle fixativen zu entfernen, so dass es nicht mit der Rentabilität sprossierung stört. Erhöhen Sie bei Bedarf die Anzahl der Wähbe.</li>
	<li>Für die Wirtschaftlichkeitsprüfung 40 ml eines bakteriellen Wachstumsmediums (z. B. BHI-Brühe) mit 4 ml gewaschener Suspension (≤ 10% des Brühevolumens) impfen und 7 Tage lang bei 37 °C inkubieren. Überprüfen Sie die optische Dichte bei 600 nm vor und nach 7 Tagen, um die Trübung zu messen.</li>
	<li>Nach 7 Tagen Inkubation in der Brühekultur ≥100 L Brühe auf eine Agarplatte und brüten weitere 7 Tage. Wenn keine Zunahme der Trübung und kein Wachstum auf Platten zu sehen sind, gilt die ursprüngliche Kultur als steril und kann in ein BSL-2 Labor übertragen werden. HINWEIS: Das Federal Select Agent Program22 schreibt vor, dass inaktivierte B. anthracis nur aus BSL-3-Labors übertragen werden können, nachdem eine vollständige Sterilität der Probe nachgewiesen wurde. Die Durchführbarkeitsprüfung für inaktivierte B. Anthracis besteht darin, 10% der Probe 7 Tage lang in Brühe zu kultivieren, gefolgt von einer Kultivierung auf festem Medium für weitere 7 Tage22,23. Befolgen Sie die institutionellen Richtlinien, um die Übertragungsgenehmigung zu erhalten, sobald die Sterilität festgelegt ist.</li>
</ol>3. Negative Färbung und Lichtmikroskopie zur Beobachtung von Verkapselungs- und Bazillketten
<ol><li>Mischen Sie die bakterielle Suspension mit 2 L Indien-Tinte auf einem Mikroskopschlitten. Legen Sie ein 1 oder 1,5 m dickes Deckglas auf die Federung, ohne Blasen zu erzeugen. HINWEIS: Nagellack kann verwendet werden, um das Deckglas auf dem Schlitten zu versiegeln.</li>
	<li>Beobachten Sie die bakterielle Suspension mit einer 40x bis 100x Ölobjektivlinse auf einem Lichtmikroskop. Stellen Sie sicher, dass die Bazillen gekapselt werden, indem Sie eine Clearance-Zone (Kapsel ohne Indientinte) um jedes Bakterium herum beobachten und dass die Bacilli-Ketten kurz sind.</li>
</ol>4. FITC-Kennzeichnung von Bakterien
<ol><li>Fluoresceinisothiocyanat (FITC) in Dimethylsulfoxid in einer Konzentration von 2 mg/ml auflösen.</li>
	<li>Messen Sie das Volumen des inaktivierten Bakterienbestands.</li>
	<li>Waschen Sie den Lagerbestand 3x in PBS, um fixative zu entfernen.</li>
	<li>Fügen Sie die FITC-Lösung in einer Endkonzentration von 75 g/ml hinzu. Langsames Rühren für 18–24 h bei 4 °C.</li>
	<li>Dreimal waschen Sie die Bakterien durch Pelletieren bei ≥3000 x g, 45 min und mit 30 ml PBS/Wash, um überschüssiges FITC zu entfernen. Stellen Sie sicher, dass das flauschige Pellet beim Waschen nicht gestört wird. Setzen Sie die Bacilli in PBS im gleichen Startvolumen wieder aus.</li>
	<li>Aliquot und lagern Sie die Bazillen in Mikroröhren bei -20 °C bis zur Verwendung. Bhasillen nicht mehrmals einfrieren/tauen, da die Bazillen die Kapsel verlieren können.</li>
</ol>5. Bakterielle Opsonisierung
<ol><li>Wärme inaktivieren ein kleines Volumen von Testsera (von NHPs) bei 56 °C für 30 min in einem Wärmeblock.</li>
	<li>FITC-markierte Bakterien mit PBS 2x durch Granulieren bei 15000 x g für 3–5 min auftauen und waschen. Resuspend ieren in PBS im gleichen Startvolumen.</li>
	<li>In einer 96 gut runden Bodenplatte (Platte #2) werden die Testseren im Zellmedium seriell verdünnt. In einem weiteren 96 gut runden Bodenplatte (Platte #3) 10 l verdünnte Testseren in jeden Brunnen geben. HINWEIS: In jeder Platte wurden PBS und normale Affenseren anstelle von verdünnten Testseren als Negativkontrollen einbezogen. Wir haben auch ein Testserum als Positivkontrolle gewählt, um eine Standardkurve zu generieren, um alle Assays zu normalisieren, die an verschiedenen Tagen durchgeführt werden. Das Positivkontroll-Testserum wurde willkürlich gewählt, weil es reichlich vorhanden war.</li>
	<li>Auf Platte #3, fügen Sie 10 l frisch rekonstituierte Baby Kaninchen Ergänzung. HINWEIS: Nach der Rekonstituiertwerden, entsorgen Sie die verbleibenden Babykaninchen Komplement; nicht wieder einfrieren und auftauen.</li>
	<li>Um platte #3, fügen Sie das entsprechende Volumen von FITC-markierten Bazillen für eine Vielzahl von Infektionen von 1:20. Fügen Sie beispielsweise das Volumen hinzu, das 5 x 104 x 20 Bacilli für 5 x 104 Zellen enthält. Jeden Brunnen in der Platte #3 mit dem entsprechenden Volumen des Zellmediums auf insgesamt 105 l ab. ANMERKUNG: Die Platte #1, die Zellen enthält, erhält 100 L opsonisierte Bakterien, wobei die restlichen 5 l als Leervolumen enthalten sind. Wir haben jede Verdünnung der Testseren in doppelter Ausführung getestet.</li>
	<li>Inkubationsplatte #3 bei 37 °C für 30 min in Gegenwart von 5%CO2 mit Feuchtigkeit, um Bazillen zu opsonisieren.</li>
</ol>6. Adherence Assay und fluoreszierende Kennzeichnung von Säugetierzellen
<ol><li>Halten Sie alle Reagenzien vor der Anwendung bei 37 °C auf.</li>
	<li>Platte #1, die haftende Zellen enthält, auf einen 37 °C-Wärmeblock legen.</li>
	<li>Verwenden Sie einen Mehrkanalpipetten, um verbrauchte Mittel aus Brunnen zu entfernen und schnell durch 100 l opsonisierte Bakterien aus platte#3 zu ersetzen. Stellen Sie sicher, dass während des Pipetierens keine Blasen in den Brunnen erzeugt wurden. Inkubationsplatte #1 bei 37 °C mit 5%CO2 und Feuchtigkeit für 30 min zur Haftung.</li>
	<li>Waschen Sie jeden Brunnen 5x mit 150 L PBS auf einem 37 °C-Wärmeblock, um ungebundene Bazillen zu entfernen. HINWEIS: Es muss darauf geachtet werden, dass die Zellen beim Waschen nicht versehentlich dispergiert werden.</li>
	<li>Verdünnen Sie 16% PF mit PBS 1:4, um 4% PF zu machen. Fixzellen mit 4% PF für 1 h, indem Sie jedem Brunnen 150 l hinzufügen. Waschen Sie Zellen 2x mit PBS.</li>
	<li>Mischen Sie 2 l HCS (High-Content-Screening) Orange Cell Stain in 10 ml PBS. Fügen Sie 150 l dieser Färbelösung zu festen Zellen hinzu und brüten sie 30 min bei Umgebungstemperatur.</li>
	<li>Waschen Sie Brunnen 2x mit PBS.</li>
	<li>Bei 4 °C bis zur Mikroskopie lagern.</li>
</ol>7. Mikroskopie
HINWEIS: Im Allgemeinen erleichtert ein automatisiertes Fluoreszenzmikroskop mit hohem Durchsatz die Bildgebung für die OAA. Wenn ein automatisiertes System nicht verfügbar ist, können fluoreszierende Bilder von haftenden Bazillen manuell aufgenommen werden21. In dieser Studie wurden20,anhähnte Bazillen und Zellmonolayer mit dem Zeiss 700 Laserscanmikroskopiesystem mit spezialisierter Ausrüstung abgebildet; Unser System bestand aus dem invertierten Zeiss Axio Observer Z1 Mikroskop, das mit einer automatisierten Stufe, dem Definite Focus Modul, 40 x NA 0.6 objektiv, axio Cam HRc Kamera und Zen 2012 (Blue Edition) Software ausgestattet ist. Bei den aufgenommenen Bildern handelt es sich um Weitfeldbilder, nicht um konfokale Bilder. Das folgende Protokoll ist als grundlegendes Mikroskop-Setup gedacht, das für eine Vielzahl von automatisierten Mikroskopiesystemen geeignet ist.
<ol><li>Inkubationsplatte #1 bei Umgebungstemperatur für 30 min. Schalten Sie das Mikroskop und die zugehörigen Geräte ein. HINWEIS: Die Akklimatisierung bei Umgebungstemperatur verhindert, dass sich während der Bildgebung Kondensation auf der Glasplatte bildet. Darüber hinaus verhindert es die Defokussierung durch Temperaturverschiebung.</li>
	<li>Platzieren Sie die Platte auf der Bühne und konzentrieren Sie sich auf die Zellen mit hellem Feld- oder Phasenkontrast.</li>
	<li>Wählen Sie 96 Gut-Format als Platteneinstellung. Wählen Sie Kanaleinstellungen aus. HINWEIS: Die Spitzenanregungs- und Emissionswellenlänge von FITC sind 495/519 nm; der HCS Orange-Zell-Fleck sind 556 und 572 nm. Je nach den Filtern, die auf dem Mikroskop verfügbar sind, können andere Fluorophore verwendet werden.</li>
	<li>Wählen Sie die Einstellung auf Kachelmodus aus. Geben Sie die Anzahl der zu erstellenden Bilder an. HINWEIS: Die Kachelfunktion ermöglicht die Erfassung mehrerer Positionen in einem Sample-Brunnen und kann so eingestellt werden, dass ein Bild in einem Kachel- oder Zufallsformat erfasst wird. Wir haben 10 zufällige Bereiche pro Brunnen abgebildet.</li>
	<li>Ändern Sie den Erfassungsmodus in "schwarz & weiß" oder "monochrom" und ≥ 2x2. HINWEIS: Die Einstellung des Binnings von 1x1 auf 2x2 oder 4x4 würde die Mikroskopiegeschwindigkeit erhöhen, aber auch zu einer niedrigeren Auflösung des Bildes führen. Für OAA reicht es aus, diese Einstellungen zu verwenden, da der Assay sowohl die Makrophagen als auch die anhaftenden Bakterien aufzählt.</li>
	<li>Schalten Sie das Autofokus- oder Fokussiermodul ein. Geben Sie an, wie oft die Autofokussierungsfunktion ausgeführt werden soll. Aktivieren Sie die Z-Stack-Funktion, sofern verfügbar. Geben Sie die Anzahl der Z-Stacks an, die die Dicke der Zellmonolayer und der anhaftenden Bacilli erfassen. HINWEIS: Die Anzahl der ausgewählten Z-Stacks erhöht die Mikroskopiezeit, stellt jedoch sicher, dass bei jedem Z-Stack ein Bild mit dem richtigen Fokus aufgenommen wird.</li>
	<li>Legen Sie einen Dateiordner fest, in dem Bilder gespeichert werden sollen. Führen Sie das automatisierte Imaging-Programm aus.</li>
</ol>8. Datenerhebung und -analyse
<ol><li>Zählen Sie die Anzahl der anhaftenden Bacilli- und Säugetierzellen pro Bild. Zählen Sie jede Kette von Bacilli als ein Bakterium.</li>
	<li>Plotten Sie die Bacilli/Zellen des Positivkontroll-Testserums und titer (z. B. 1:10 Verdünnung ist 10 Titereinheiten), um eine Standardkurve in einem entsprechenden Statistikprogramm zu erzeugen.</li>
	<li>Analysieren Sie das Positivkontrolltestserum mithilfe der nichtlinearen Regressionskurvenanpassung. Analysieren Sie dann die restlichen Proben mit der Standardkurve des Positivkontrolltestserums, um die entsprechenden Titer zu bestimmen. HINWEIS: Es ist in der Regel am genauesten, die Probenverdünnungen in der Mitte der Standardkurve zu wählen, wenn Titer bestimmt werden.</li>
	<li>Berechnen Sie den geometrischen Mittelwert der Proben aus jeder Impfstoffgruppe. Berechnen Sie die P-Werte von logtransformierten Titern durch die geringste signifikante Differenz ANOVA-Analyse.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Walters, M. N., Papadimitriou, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis:+a+review.">Phagocytosis: a review.</a> CRC Critical Reviews in Toxicology. 5 (4), 377-421 (1978).</li><li>Metschnikoff, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untersuchurgen+uber+die+intracellulare+Verdauung,+bei+wirbellosen+Thieren.">Untersuchurgen uber die intracellulare Verdauung, bei wirbellosen Thieren.</a> Arbeiten aus dem Zoologischen Instituten der Universit&#228;t Wien. 5, 144 (1883).</li><li>Tauber, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metchnikoff+and+the+phagocytosis+theory.">Metchnikoff and the phagocytosis theory.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (11), 897-901 (2003).</li><li>Janeway, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+system+evolved+to+discriminate+infectious+nonself+from+noninfectious+self.">The immune system evolved to discriminate infectious nonself from noninfectious self.</a> Immunology Today. 13 (1), 11-16 (1992).</li><li>Kumagai, Y., Akira, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+functions+of+pattern-recognition+receptors.">Identification and functions of pattern-recognition receptors.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (5), 985-992 (2010).</li><li>Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+phagocytosis.">The cell biology of phagocytosis.</a> Annual Review of Pathology. 7, 61-98 (2012).</li><li>Candela, T., Fouet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly-gamma-glutamate+in+bacteria.">Poly-gamma-glutamate in bacteria.</a> Molecular Microbiology. 60 (5), 1091-1098 (2006).</li><li>Kocianova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+role+of+poly-gamma-DL-glutamic+acid+in+immune+evasion+and+virulence+of+Staphylococcus+epidermidis.">Key role of poly-gamma-DL-glutamic acid in immune evasion and virulence of Staphylococcus epidermidis.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (3), 688-694 (2005).</li><li>Rothbard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effect+of+hyaluronidase+and+type-specific+anti-M+serum+on+experimental+group+A+Streptococcus+infection+in+mice.">Protective effect of hyaluronidase and type-specific anti-M serum on experimental group A Streptococcus infection in mice.</a> Journal of Experimental Medicine. 88 (3), 325-342 (1948).</li><li>Oh, S. Y., Budzik, J. M., Garufi, G., Schneewind, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+capsular+polysaccharides+enable+Bacillus+cereus+G9241+to+cause+anthrax-like+disease.">Two capsular polysaccharides enable Bacillus cereus G9241 to cause anthrax-like disease.</a> Molecular Microbiology. 80 (2), 455-470 (2011).</li><li>Knuf, M., Kowalzik, F., Kieninger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+effects+of+carrier+proteins+on+vaccine-induced+immune+response.">Comparative effects of carrier proteins on vaccine-induced immune response.</a> Vaccine. 29 (31), 4881-4890 (2011).</li><li>Wang, T. T., Lucas, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+capsule+of+Bacillus+anthracis+behaves+as+a+thymus-independent+type+2+antigen.">The capsule of Bacillus anthracis behaves as a thymus-independent type 2 antigen.</a> Infection &amp; Immunity. 72 (9), 5460-5463 (2004).</li><li>Vogel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+flow+cytometric+analysis+of+opsonophagocytosis+and+killing+of+nonencapsulated+Haemophilus+influenzae+by+human+polymorphonuclear+leukocytes.">Quantitative flow cytometric analysis of opsonophagocytosis and killing of nonencapsulated Haemophilus influenzae by human polymorphonuclear leukocytes.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 1 (4), 394-400 (1994).</li><li>Salehi, S., Hohn, C. M., Penfound, T. A., Dale, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+Opsonophagocytic+Killing+Assay+Using+HL-60+Cells+for+Detection+of+Functional+Antibodies+against+Streptococcus+pyogenes.">Development of an Opsonophagocytic Killing Assay Using HL-60 Cells for Detection of Functional Antibodies against Streptococcus pyogenes.</a> mSphere. 3 (6), 00617-00618 (2018).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Immunoprotective+Proteins+of+Streptococcus+pneumoniae+Identified+by+Opsonophagocytosis+Killing+Screen.">Novel Immunoprotective Proteins of Streptococcus pneumoniae Identified by Opsonophagocytosis Killing Screen.</a> Infection &amp; Immunity. 86 (9), (2018).</li><li>Humphries, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seroprevalence+of+Antibody-Mediated,+Complement-Dependent+Opsonophagocytic+Activity+against+Neisseria+meningitidis+Serogroup+B+in+England.">Seroprevalence of Antibody-Mediated, Complement-Dependent Opsonophagocytic Activity against Neisseria meningitidis Serogroup B in England.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 22 (5), 503-509 (2015).</li><li>Jansen, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+highly+encapsulated+Streptococcus+pneumoniae+strains+in+a+flow-cytometric+assay+for+assessment+of+the+phagocytic+capacity+of+serotype-specific+antibodies.">Use of highly encapsulated Streptococcus pneumoniae strains in a flow-cytometric assay for assessment of the phagocytic capacity of serotype-specific antibodies.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 5 (5), 703-710 (1998).</li><li>Wang, T. T., Fellows, P. F., Leighton, T. J., Lucas, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+opsonic+antibodies+to+the+gamma-D-glutamic+acid+capsule+of+Bacillus+anthracis+by+immunization+with+a+synthetic+peptide-carrier+protein+conjugate.">Induction of opsonic antibodies to the gamma-D-glutamic acid capsule of Bacillus anthracis by immunization with a synthetic peptide-carrier protein conjugate.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 40 (3), 231-237 (2004).</li><li>Chabot, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+of+rhesus+macaques+against+inhalational+anthrax+with+a+Bacillus+anthracis+capsule+conjugate+vaccine.">Protection of rhesus macaques against inhalational anthrax with a Bacillus anthracis capsule conjugate vaccine.</a> Vaccine. 34 (34), 4012-4016 (2016).</li><li>Chabot, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+a+capsule+conjugate+vaccine+against+inhalational+anthrax+in+rabbits+and+monkeys.">Efficacy of a capsule conjugate vaccine against inhalational anthrax in rabbits and monkeys.</a> Vaccine. 30 (5), 846-852 (2012).</li><li>Chua, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde+and+Glutaraldehyde+Inactivation+of+Bacterial+Tier+1+Select+Agents+in+Tissues.">Formaldehyde and Glutaraldehyde Inactivation of Bacterial Tier 1 Select Agents in Tissues.</a> Emerging Infectious Diseases. 25 (5), 919-926 (2019).</li><li>. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (Eighth Edition) Available from: <a target="_blank" href="https://grants.nih.gov/grants/olaw/guide-for-the-care-and-use-of-laboratory-animals.pdf">https://grants.nih.gov/grants/olaw/guide-for-the-care-and-use-of-laboratory-animals.pdf</a> (2011)</li><li>Durando, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience+with+pneumococcal+polysaccharide+conjugate+vaccine+(conjugated+to+CRM197+carrier+protein)+in+children+and+adults.">Experience with pneumococcal polysaccharide conjugate vaccine (conjugated to CRM197 carrier protein) in children and adults.</a> Clinical Microbiology and Infection. 19, 1-9 (2013).</li><li>Adams, W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decline+of+childhood+Haemophilus+influenzae+type+b+(Hib)+disease+in+the+Hib+vaccine+era.">Decline of childhood Haemophilus influenzae type b (Hib) disease in the Hib vaccine era.</a> JAMA. 269 (2), 221-226 (1993).</li><li>Balmer, P., Borrow, R., Miller, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+meningococcal+C+conjugate+vaccine+in+the+UK.">Impact of meningococcal C conjugate vaccine in the UK.</a> Journal of Medical Microbiology. 51 (9), 717-722 (2002).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+opsonophagocytic+killing+activity+with+pneumococcal+conjugate+vaccine+in+human+immunodeficiency+virus-infected+Ugandan+adults.">Induction of opsonophagocytic killing activity with pneumococcal conjugate vaccine in human immunodeficiency virus-infected Ugandan adults.</a> Vaccine. 26 (38), 4962-4968 (2008).</li><li>Paschall, A. V., Middleton, D. R., Avci, F. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opsonophagocytic+Killing+Assay+to+Assess+Immunological+Responses+Against+Bacterial+Pathogens.">Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), e59400 (2019).</li><li>Ezzell, J. W., Welkos, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+capsule+of+Bacillus+anthracis,+a+review.">The capsule of Bacillus anthracis, a review.</a> Journal of Applied Microbiology. 87 (2), 250 (1999).</li><li>Hanna, P. C., Acosta, D., Collier, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+role+of+macrophages+in+anthrax.">On the role of macrophages in anthrax.</a> Proceedings of the National Academies of Sciences of the United States of America. 90 (21), 10198-10201 (1993).</li><li>Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+HL-60+cell+line+to+measure+opsonic+capacity+of+pneumococcal+antibodies.">Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).</li><li>Chua, J., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+reprograms+waves+of+phosphatidylinositol+3-phosphate+on+phagosomal+organelles.">Mycobacterium tuberculosis reprograms waves of phosphatidylinositol 3-phosphate on phagosomal organelles.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 36982-36992 (2004).</li><li>Chua, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+Alkalinization+by+Chloroquine+Suppresses+Pathogenic+Burkholderia+Type+6+Secretion+System+1+and+Multinucleated+Giant+Cells.">pH Alkalinization by Chloroquine Suppresses Pathogenic Burkholderia Type 6 Secretion System 1 and Multinucleated Giant Cells.</a> Infection &amp; Immunity. 85 (1), (2017).</li><li>Ober, R. J., Radu, C. G., Ghetie, V., Ward, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+promiscuity+for+antibody-FcRn+interactions+across+species:+implications+for+therapeutic+antibodies.">Differences in promiscuity for antibody-FcRn interactions across species: implications for therapeutic antibodies.</a> International Immunology. 13 (12), 1551-1559 (2001).</li><li>Sorman, A., Zhang, L., Ding, Z., Heyman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+antibodies+use+complement+to+regulate+antibody+responses.">How antibodies use complement to regulate antibody responses.</a> Molecular Immunology. 61 (2), 79-88 (2014).</li><li>Henckaerts, I., Durant, N., De Grave, D., Schuerman, L., Poolman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+routine+opsonophagocytosis+assay+to+predict+invasive+pneumococcal+disease+efficacy+of+conjugate+vaccine+in+children.">Validation of a routine opsonophagocytosis assay to predict invasive pneumococcal disease efficacy of conjugate vaccine in children.</a> Vaccine. 25 (13), 2518-2527 (2007).</li><li>Wolf, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Special Considerations for the Nonclinical Safety Assessment of Vaccines. , 243-255 (2013).</li></ol>

Die Autoren haben keine kommerzielle oder andere Assoziation, die einen Interessenkonflikt darstellen könnte.

Kapselbasierte Impfstoffe haben sich als wirksam gegen zahlreiche bakterielle Krankheitserreger erwiesen, und viele sind für den Einsatz beim Menschen zugelassen25,26,27. Diese Impfstoffe wirken, indem sie Antikörper erzeugen, die auf die Kapsel abzielen, und viele dieser Studien verwenden das OPKA, um die opsonophagozytischen Funktionen der Antikörper13,14,</sup...

Erkennung, Adhärenz, Internalisierung und Abbau eines Erregers sind integraler Bestandteil der Phagozytose1, ein markanter Weg im Wirt angeborene Immunantwort zuerst beschrieben von Ilya Metchnikoff in 18832,3. Phagozytäre Leukozyten, sowie andere Zellen des Immunsystems, sind sehr diskriminierend in ihrer Auswahl von Zielen; sie sind in der Lage, zwischen "infektiösem Nicht-Selbst" und "nicht-infektiöses Selbst" durch pathogene assoziierte molekulare Muster durch ihr Repertoire an Mustererkennungsrezeptoren (PRRs)4,5zu unterscheiden. Die Wirterkennung eines Erregers kann auch mit der Bindung von Wirtsopsoninen, wie Komplement undAntikörpern 6auftreten. Dieser Prozess, der als Opsonisierung bezeichnet wird, beschichtet den Erreger mit diesen Molekülen und verbessert die Internalisierung bei Bindung an Opsonic-Rezeptoren (z. B. Komplement- und Fc-Rezeptoren) auf phagozytären Zellen6. Damit ein Erreger an einer Phagozyten haften kann, ist eine kollektive Bindung mehrerer Rezeptoren mit ihren Cognate-Ninentinanden erforderlich. Nur dann kann die Adhärenz Signalkaskaden innerhalb der Hostzelle auslösen und aufrechterhalten, um die Internalisierung zu initiieren6.
Aufgrund der Bedeutung der Phagozytose für die Clearance von Krankheitserregern und die Prävention von Infektionen haben extrazelluläre Krankheitserreger zahlreiche Wege entwickelt, diesen Prozess zu untergraben, um ihr Überleben zu verlängern. Eine Strategie von Bedeutung ist die Herstellung einer anionischen Polymerkapsel (z. B. Polysaccharid oder Polyaminosäure), die aufgrund ihrer Ladung antiphagozytisch ist, schlecht immunogen ist und Moleküle auf der bakteriellen Hülle aus PRRs6,7abschirmt. Pathogene wie Cryptococcus neoformans und Streptococcus pneumoniae haben Kapseln aus Saccharidpolymeren, während Staphylococcus epidermidis und einige Bacillus-Arten Poly-ɣ-Glutaminsäure (PGGA)7,8produzieren. Doch andere Krankheitserreger produzieren Kapseln, die dem nicht-infektiösen Selbst ähneln. Zum Beispiel haben Streptococcus pyogenes und ein pathogener Stamm von B. cereus eine Hyaluronsäurekapsel, die nicht nur antiphagozytisch ist, sondern auch vom Immunsystem nicht als fremd erkannt werden kann9,10.
Konjugation von Kapsel zu Trägerproteinen wandelt sie von armen, T-unabhängigen Antigenen in hochimmunogene T-abhängige Antigene um, die hohe Serum-Antikapsel-Antikörper-Titers induzieren können11,12. Diese Strategie wird für lizenzierte Impfstoffe gegen S. pneumoniae, Haemophilus influenzaeund Neisseria meningitides11eingesetzt. Die Opsonic-Aktivitäten von Anti-Kapsel-Antikörpern wurden häufig durch opsono-phagozytische Tötungstests (OPKA)13,14,15,16ausgewertet. Diese Assays testen, ob funktionelle Antikörper Phagozytose auslösen und14töten können. Die Verwendung von OPKA mit infektiösen Krankheitserregern wie Tier 1 Biological Select Agents and Toxins (BSAT), einschließlich B. anthracis17, ist jedoch gefährlich und birgt Sicherheitsrisiken; diese Assays erfordern eine umfassende Handhabung eines ausgewählten Agenten. Die Auswahl der Agentenhandhabung kann nur in Laboratorien der biologischen Sicherheitsstufe 3 (BSL-3) erfolgen; Die Arbeit in diesen Bereichen erfordert aufgrund der zahlreichen Sicherheitsvorkehrungen, die befolgt werden müssen, langwierige Betriebsabläufe. BSL-3-Labore sind in der Regel auch nicht mit den speziellen Geräten für OPKA-Arbeiten wie Mikroskope und Zytometer ausgestattet. So entwickelten wir einen alternativen Assay auf Basis der Verwendung von inaktivierten Bakterien18,19. Wir bezeichnen dies als einen Opsono-Adherence-Assay (OAA), der nicht von Internalisierung und Tötung als Assay-Output sabhängt; Stattdessen wird die Adhärenz von opsonisierten inaktivierten Krankheitserregern als Index der Phagozytose verwendet. Mechanistisch ist OAA ein geeigneter Ersatz, da die Adhärenz a priori auftritt und eng mit Internalisierung und intrazellulärer Tötung verflochten ist. Aus Sicht der Biosicherheit wird OAA bevorzugt, da es einen minimalen Umgang mit einem Infektier erfordert, experimentell kürzer ist als OPKA und in BSL-2-Labors durchgeführt werden kann, nachdem ein Vorrat des inaktivierten Erregers produziert und übertragen wurde.
Wir zeigen die Verwendung von OAA zur Untersuchung der Opsonic-Funktion von Anti-Kapsel-Antikörpern, die in Seren von nichtmenschlichen Primaten (NHPs) gefunden wurden, die mit einem Kapselkonjugat geimpft sind [d.h. PGGA von B. anthracis konjugiert mit dem äußeren Membranproteinkomplex (OMPC) von Neisseria Meningitiden]20. Serum-opsonisierte Bazillen wurden mit einer anhaftenden Mausmakrophagenzelllinie, RAW 264.7, inkubiert. Nach der Fixierung wurden die Zellmonolayer und die anhaftenden Bazillen durch Fluoreszenzmikroskopie abgebildet. Die bakterielle Adhärenz nahm zu, wenn die Bazillen mit Serum von NHPs inkubiert wurden, die mit dem Kapselkonjugat geimpft wurden, verglichen mit Kontrollserum20. Die Einhaltung korrelierte mit dem Überleben der Milzbrand-Herausforderung20,21. So charakterisierte die Verwendung von OAA die Funktion von Anti-Kapsel-Antikörpern und erleichterte die Prüfung unseres Impfstoffkandidaten erheblich.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1520px;" width="1520">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:380px;">0.20 &#181;m syringe filter (25mm, regenerated cellulose)</td>
			<td style="width:483px;">Corning, Corning, NY</td>
			<td style="width:267px;">431222</td>
			<td style="width:391px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10 mL syringe (Luer-Lok tip)</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">15&#181; 96 well black plates (plate #1 for imaging)</td>
			<td>In Vitro Scientific, Sunnyvale, CA</td>
			<td>P96-1-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">16% paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Science, Hatfield, PA</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">75 cm sq. tissue culture treated flask</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>430641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agar (powder)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A1296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Baby Rabbit Complement</td>
			<td>Cedarlane Labs, Burlington, NC</td>
			<td>CL3441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bacto Yeast Extract</td>
			<td>BD, Sparks, MD</td>
			<td>288620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BBL Brain Heart Infusion (BHI)</td>
			<td>BD, Sparks, MD</td>
			<td>211059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Blood Agar (TSA with Sheep Blood) plates</td>
			<td>Remel, Lenexa, KS</td>
			<td>R01198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell scraper</td>
			<td>Sarstedt, Newton, NC</td>
			<td>83.183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Costar 96 well cell culture plates (plates #2 &#38; 3 for dilutions)</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>3596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cover glass</td>
			<td>Electron Microscopy Science, Hatfield, PA</td>
			<td>72200-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Difco Nutrient Broth</td>
			<td>BD, Sparks, MD</td>
			<td>234000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>contains 4500 mg/L glucose, 4 mM L-glutamine, Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EVOS FL Auto Cell Imaging System (fluorescence microscope)</td>
			<td>Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>AMAFD1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>not gamma irradiated, not heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescein isothiocyanate</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>F143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HCS Cell Mask Orange Cell Stain</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>H32713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">hemocytometer (Improved Neubauer)</td>
			<td>Hausser Scientific, Horsham, PA</td>
			<td>3900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">India Ink solution</td>
			<td>BD, Sparks, MD</td>
			<td>261194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L- glutamine (200 mM)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham MA</td>
			<td>25030081</td>
			<td>supplement medium with additional 2mM L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nikon Eclipse TE2000-U (inverted compound microscope)</td>
			<td>Nikon Instruments, Melville, NY</td>
			<td>TE2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS without Calcium or Magnesium</td>
			<td>Lonza, Walkersville, MD</td>
			<td>17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin-Streptomycin Solution, 100x</td>
			<td>Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">petri dishes (100 x 15 mm)</td>
			<td>Falcon, Corning, Durham, NC</td>
			<td>351029</td>
			<td>for agar plates</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RAW 264.7 macrophage cell line (Tib47)</td>
			<td>ATCC, Manassas, VA</td>
			<td>ATCC TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Slides</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>16004-422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypan Blue Solution (0.4%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zeiss 700 Laser Scanning Microscopy (confocal microscope)</td>
			<td>Carl Zeiss Microimaging, Thornwood, NY</td>
			<td>4109001865956000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

opsono-adherence assay to evaluate functional antibodies in vaccine development against bacillus anthracis and other encapsulated pathogens

Der Opsono-Adhärenz-Assay ist ein funktioneller Test, der die Bindung bakterieller Krankheitserreger an professionelle Phagozyten aufzählt. Da die Einhaltung der Phagozytose und Tötung erforderlich ist, ist der Assay eine alternative Methode zu opsono-phagozytischen Tötungstests. Ein Vorteil des Opsono-Adhärenz-Assays ist die Möglichkeit, inaktivierte Krankheitserreger und Säugetierzelllinien zu verwenden, was eine Standardisierung über mehrere Experimente hinweg ermöglicht. Die Verwendung eines inaktivierten Erregers im Test erleichtert auch die Arbeit mit Infektionserregern der Biosicherheitsstufe 3 und anderen virulenten Krankheitserregern. In unserer Arbeit wurde der Opsono-Adhärenz-Test verwendet, um die funktionelle Fähigkeit von Antikörpern von Tieren zu bewerten, die mit einem Impfstoff auf Milzbrandkapsel-Basiert immunisiert wurden, um die Einhaltung der festen Bacillus-Anthrakis an einer Maus-Makrophagenzelllinie, RAW 264.7, zu induzieren. Automatisierte Fluoreszenzmikroskopie wurde verwendet, um Bilder von Bazillen zu erfassen, die an Makrophagen haften. Erhöhte Adhärenz wurde mit dem Vorhandensein von Anti-Kapsel-Antikörpern im Serum korreliert. Nichtmenschliche Primaten, die hohe Serum-Antikapsel-Antikörperkonzentrationen aufwiesen, wurden vor Milzbrand-Herausforderungen geschützt. So kann der Opsono-Adhärenz-Test verwendet werden, um die biologischen Funktionen von antigenspezifischen Antikörpern in seren zu klären, die Wirksamkeit von Impfstoffkandidaten und anderen Therapeutika zu bewerten und als mögliches Korrelat der Immunität zu dienen.

Dieser Abschnitt zeigt repräsentative Mikrographen, die während eines OAA-Experiments gesammelt wurden, zusammen mit Ergebnissen, die zeigen, dass die OAA zur Untersuchung der biologischen Funktion von Antikörpern verwendet werden kann. Hier wurde der Assay erfolgreich eingesetzt, um die Wirksamkeit eines Milzbrand-Impfstoffkandidaten zu bewerten. Es ist wichtig, den Zustand der Verkapselung auf den Bazillen zu überprüfen, da wenig bis keine Verkapselung dazu führt, dass sie an Wirtszellen haften, wodurch ein hoher...

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Opsono-Adherence Assay to Evaluate Functional Antibodies in Vaccine Development Against Bacillus anthracis and Other Encapsulated Pathogens

Der Opsono-Adhärenz-Assay ist eine alternative Methode zum opsono-phagozytischen Tötungstest zur Bewertung der Opsonic-Funktionen von Antikörpern in der Impfstoffentwicklung.

Opsono-Adherence Assay zur Bewertung funktioneller Antikörper in der Impfstoffentwicklung gegen Bacillus anthracis und andere verkapselte Pathogene

The opsono-adherence assay is a functional assay that enumerates the attachment of bacterial pathogens to professional phagocytes. Because adherence is ...

opsono-adherence-assay-to-evaluate-functional-antibodies-vaccine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Opsono-Adherence Assay to Evaluate Functional Antibodies in Vaccine Development Against Bacillus anthracis and Other Encapsulated Pathogens

3.3K Aufrufe.  United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases. Der Opsono-Adhärenz-Assay ist eine alternative Methode zum opsono-phagozytischen Tötungstest zur Bewertung der Opsonic-Funktionen von Antikörpern in der Impfstoffentwicklung.

Serie: Opsono-Adherence Assay to Evaluate Functional Antibodies in Vaccine Development Against Bacillus anthracis and Other Encapsulated Pathogens

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating histoplasmosis caused by the fungus Histoplasma capsulatum and 2) to examine the role of virulence factors as target for therapy. To generate mAbs, mice are immunized, the immune responses are assessed using a solid phase ELISA system developed in our laboratory, and the best responder mice are selected for isolation of splenocytes for fusion with hybridoma cells. C57BL/6 mice have been extensively used to study H. capsulatum pathogenesis and provide the best model for obtaining the data required. In order to assess the role of the mAbs in infection, mice are intraperitoneally administered with either mAb to H. capsulatum or isotype matched control mAb and then infected by either intravenous (i.v.), intraperitoneal (i.p.), or intranasal (i.n.) routes. In the scientific literature, efficacy of mAbs for fungal infections in mice relies on mortality as an end point, in conjunction with colony formin units (CFU) assessments at earlier time points. Survival (time to death) studies are necessary as they best represent human disease. Thus, efficacy of our intervention would not adequately be established without survival curves. This is also true for establishing efficacy of vaccine or testing of mutants for virulence. With histoplasmosis, the mice often go from being energetic to dead over several hours. The capacity of an intervention such as the administration of a mAb may initially protect an animal from disease, but the disease can relapse which would not be realized in short CFU experiments. In addition to survival and fungal burden assays, we examine the inflammatory responses to infection (histology, cellular recruitment, cytokine responses). For survival/time to death experiments, the mice are infected and monitored at least twice daily for signs of morbidity. To assess fungal burden, histopathology, and cytokine responses, the mice are euthanized at various times after infection. Animal experiments are performed according to the guidelines of the Institute for Animal Studies of the Albert Einstein College of Medicine.

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

C57BL/6 mice have been used to study Hc pathogenesis and provide the best model. We are exploring the potential benefits of humoral immunity against this fungus and generated several mAbs [to histone H2B and a heat shock protein 60kDa] that we tested for their protective efficacy after intraperitoneal administration.

Passive Verwaltung von monoklonalen Antikörpern gegen H. capsulatum Ua Pilzpathogene

The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, it is therefore important to have a quick and reliable way of measuring transcriptional activity in infected cells. Traditionally, transcription has been measured either by incorporation of radioactive nucleosides such as 3H-uridine followed by detection via autoradiography or scintillation counting, or incorporation of halogenated uridine analogs such as 5-bromouridine (BrU) followed by detection via immunostaining. The use of radioactive isotopes, however, requires specialized equipment and is not feasible in a number of laboratory settings, while the detection of BrU can be cumbersome and may suffer from low sensitivity.
The recently developed click chemistry, which involves a copper-catalyzed triazole formation from an azide and an alkyne, now provides a rapid and highly sensitive alternative to these two methods. Click chemistry is a two step process in which nascent RNA is first labeled by incorporation of the uridine analog 5-ethynyluridine (EU), followed by detection of the label with a fluorescent azide. These azides are available as several different fluorophores, allowing for a wide range of options for visualization.
This protocol describes a method to measure transcriptional suppression in cells infected with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12 using click chemistry. Concurrently, expression of viral proteins in these cells is determined by classical intracellular immunostaining. Steps 1 through 4 detail a method to visualize transcriptional suppression via fluorescence microscopy, while steps 5 through 8 detail a method to quantify transcriptional suppression via flow cytometry. This protocol is easily adaptable for use with other viruses.

This method describes the use of click chemistry to measure changes in host cell transcription after infection with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12. Results can be visualized qualitatively via fluorescence microscopy or obtained quantitatively through flow cytometry. This method is adaptable for use with other viruses.

Mit Klick-Chemie, um die Wirkung von Viral Infection auf Host-Zell-RNA Synthese Messen

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells to kill CD4+ T cells loaded with their cognate peptide. Target CD4+ T cells are divided into two populations, labeled with two different concentrations of CFSE. One population is pulsed with the peptide of interest (CFSE-low) while the other remains un-pulsed (CFSE-high). Pulsed and un-pulsed CD4+ T cells are mixed at an equal ratio and incubated with an increasing number of purified CD8+ T cells. The specific killing of autologous target CD4+ T cells is analyzed by flow cytometry after coculture with CD8+ T cells containing the antigen-specific effector CD8+ T cells detected by peptide/MHCI tetramer staining. The specific lysis of target CD4+ T cells measured at different effector versus target ratios, allows for the calculation of lytic units, LU30/106 cells. This simple and straightforward assay allows for the accurate measurement of the intrinsic capacity of CD8+ T cells to kill target CD4+ T cells.

This protocol describes a sensitive, cell-based cytotoxicity assay. By enumerating the decrease in frequency of live target CD4+ T cells in the presence of an increasing number of effector CD8+ T cells, this assay allows for the direct assessment of cytolytic activity of antigen-specific CD8+ T cells.

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

Ein Hochdurchsatz-Assay unterstützte Wirksamkeit von Medikamenten gegen Makrophagen agierten zur Bewertung<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional Chinese medicine and food safety/toxicology. Many of the classical analysis techniques require expensive equipment and/or expertise. Notably, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) have become an emerging method for the analysis of foods and natural products. This method is based on antibody-mediated detection of the target components. However, as many of the bioactive components in natural products are small (&lt;1,000 Da) and do not induce an immune response, creating monoclonal antibodies (mAbs) against them is often difficult. In this protocol, we provide a detailed explanation of the steps required to generate mAbs against target molecules as well as those needed to create the associated indirect competitive (ic)ELISA for the rapid analysis of the compound in multiple samples. The procedure describes the synthesis of the artificial antigen (i.e., the hapten-carrier conjugate), immunization, cell fusion, monoclonal hybridoma preparation, characterization of the mAb, and the ELISA-based application of the mAb. The hapten-carrier conjugate was synthesized by the sodium periodate method and evaluated by MALDI-TOF-MS. After immunization, splenocytes were isolated from the immunized mouse with the highest antibody titer and fused with the hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT)-sensitive mouse myeloma cell line Sp2/0 -Ag14 using a polyethylene glycol (PEG)-based method. The hybridomas secreting mAbs reactive to the target antigen were screened by icELISA for specificity and cross-reactivity. Furthermore, the limiting dilution method was applied to prepare monoclonal hybridomas. The final mAbs were further characterized by icELISA and then utilized in an ELISA-based application for the rapid and convenient detection of the example hapten (naringin (NAR)) in natural products.

This article provides a detailed protocol for the preparation and evaluation of monoclonal antibodies against natural products for use in various immunoassays. This procedure includes immunization, cell fusion, indirect competitive ELISA for positive clone screening, and monoclonal hybridoma preparation. The specifications for antibody characterization using MALDI-TOF-MS and ELISA analyses are also provided.

Generierung von monoklonalen Antikörpern gegen Naturprodukte

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

Opsonophagocytic Tötung Assay Immunreaktionen gegen bakterielle Krankheitserreger zu bewerten

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

The intestinal &#8216;organoid&#8217; (iHO) system, wherein 3-D structures representative of the epithelial lining of the human gut can be produced from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) and maintained in culture, provides an exciting opportunity to facilitate the modeling of the epithelial response to enteric infections. In vivo, intestinal epithelial cells (IECs) play a key role in regulating intestinal homeostasis and may directly inhibit pathogens, although the mechanisms by which this occurs are not fully elucidated. The cytokine interleukin-22 (IL-22) has been shown to play a role in the maintenance and defense of the gut epithelial barrier, including inducing a release of antimicrobial peptides and chemokines in response to infection.
We describe the differentiation of healthy control hiPSCs into iHOs via the addition of specific cytokine combinations to their culture medium before embedding them into a basement membrane matrix-based prointestinal culture system. Once embedded, the iHOs are grown in media supplemented with Noggin, R-spondin-1, epidermal growth factor (EGF), CHIR99021, prostaglandin E2, and Y-27632 dihydrochloride monohydrate. Weekly passages by manual disruption of the iHO ultrastructure lead to the formation of budded iHOs, with some exhibiting a crypt/villus structure. All iHOs demonstrate a differentiated epithelium consisting of goblet cells, enteroendocrine cells, Paneth cells, and polarized enterocytes, which can be confirmed via immunostaining for specific markers of each cell subset, transmission electron microscopy (TEM), and quantitative PCR (qPCR). To model infection, Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344 are microinjected into the lumen of the iHOs and incubated for 90 min at 37 &#176;C, and a modified gentamicin protection assay is performed to identify the levels of intracellular bacterial invasion. Some iHOs are also pretreated with recombinant human IL-22 (rhIL-22) prior to infection to establish whether this cytokine is protective against Salmonella infection.

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived intestinal organoids offer exciting opportunities to model enteric diseases in vitro. We demonstrate the differentiation of hiPSCs into intestinal organoids (iHOs), the stimulation of these iHOs with cytokines, and the microinjection of Salmonella Typhimurium into the iHO lumen, enabling the study of an epithelial invasion by this pathogen.

Verwendung von humaninduzierten, zellabgeleiteten Intestarz-Organoiden zur Untersuchung und Modifizierung des epithelialen Zellschutzes gegen Salmonellen und andere Krankheitserreger

The intestinal &#8216;organoid&#8217; (iHO) system, wherein 3-D structures representative of the epithelial lining of the human gut can be produced from ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy for the Replacement, Reduction, and Refinement of the laboratory animal testing. The development of in vitro approaches is recommended at the WHO and European levels as alternatives to the NIH test for evaluating the rabies vaccine potency. At the surface of the rabies virus (RABV) particle, trimers of glycoprotein constitute the major immunogen to induce Viral Neutralizing Antibodies (VNAbs). An ELISA test, where Neutralizing Monoclonal Antibodies (mAb-D1) recognize the trimeric form of the glycoprotein, has been developed to determine the contents of the native folded trimeric glycoprotein along with the production of the vaccine batches. This in vitro potency test demonstrated a good concordance with the NIH test and has been found suitable in collaborative trials by RABV vaccine manufacturers and OMCLs. Avoidance of animal use is an achievable objective in the near future.
The method presented is based on an indirect ELISA sandwich immunocapture using the mAb-D1 which recognizes the antigenic sites III (aa 330 to 338) of the trimeric RABV glycoprotein, i.e., the immunogenic RABV antigen. mAb-D1 is used for both coating and detection of glycoprotein trimers present in the vaccine batch. Since the epitope is recognized because of its conformational properties, the potentially denatured glycoprotein (less immunogenic) cannot be captured and detected by the mAb-D1. The vaccine to be tested is incubated in a plate sensitized with the mAb-D1. Bound trimeric RABV glycoproteins are identified by adding the mAb-D1 again, labeled with peroxidase and then revealed in the presence of substrate and chromogen. Comparison of the absorbance measured for the tested vaccine and the reference vaccine allows for the determination of the immunogenic glycoprotein content.

Here we describe an indirect ELISA sandwich immunocapture to determine the immunogenic glycoprotein contents in rabies vaccines. This test uses a neutralizing Monoclonal Antibody (mAb-D1) recognizing glycoprotein trimers. It is an alternative to the in vivo NIH test to follow the consistency of vaccine potency during production.

In Vitro ELISA-Test zur Bewertung der Wirksamkeit von Tollwut-Impfstoffen

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...

Use of an Influenza Antigen Microarray to Measure the Breadth of Serum Antibodies Across Virus Subtypes

The influenza virus remains a significant cause of mortality worldwide due to the limited effectiveness of currently available vaccines. A key challenge to the development of universal influenza vaccines is high antigenic diversity resulting from antigenic drift. Overcoming this challenge requires novel research tools to measure the breadth of serum antibodies directed against many virus strains across different antigenic subtypes. Here, we present a protocol for analyzing the breadth of serum antibodies against diverse influenza virus strains using a protein microarray of influenza antigens.
This influenza antigen microarray is constructed by printing purified hemagglutinin and neuraminidase antigens onto a nitrocellulose-coated membrane using a microarray printer. Human sera are incubated on the microarray to bind antibodies against the influenza antigens. Quantum-dot-conjugated secondary antibodies are used to simultaneously detect IgG and IgA antibodies binding to each antigen on the microarray. Quantitative antibody binding is measured as fluorescence intensity using a portable imager. Representative results are shown to demonstrate assay reproducibility in measuring subtype-specific and cross-reactive influenza antibodies in human sera.
Compared to traditional methods such as ELISA, the influenza antigen microarray provides a high throughput multiplexed approach capable of testing hundreds of sera for multiple antibody isotypes against hundreds of antigens in a short time frame, and thus has applications in sero-surveillance and vaccine development. A limitation is the inability to distinguish binding antibodies from neutralizing antibodies.

We present a protocol for using a protein microarray constructed by printing influenza antigens onto nitrocellulose-coated slides to simultaneously probe serum for multiple antibody isotypes against over 250 antigens from different virus strains, thus allowing measurement of the breadth of serum antibodies across virus subtypes.

Verwendung eines Influenza-Antigen-Mikroarrays zur Messung der Breite von Serum-Antikörpern über Virussubtypen hinweg

The influenza virus remains a significant cause of mortality worldwide due to the limited effectiveness of currently available vaccines. A key challenge ...

Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

Toxoplasma gondii is a protozoan pathogen that widely affects the human population. The current antibiotics used for treating clinical toxoplasmosis are limited. In addition, they exhibit adverse side effects in certain groups of people. Therefore, discovery of novel therapeutics for clinical toxoplasmosis is imperative. The first step of novel antibiotic development is to identify chemical compounds showing high efficacy in inhibition of parasite growth using a high throughput screening strategy. As an obligate intracellular pathogen, Toxoplasma can only replicate within host cells, which prohibits the use of optical absorbance measurements as a quick indicator of growth. Presented here is a detailed protocol for a luciferase-based growth assay. As an example, this method is used to calculate the doubling time of wild-type Toxoplasma parasites and measure the efficacy of morpholinurea-leucyl-homophenyl-vinyl sulfone phenyl (LHVS, a cysteine protease-targeting compound) regarding inhibition of parasite intracellular growth. Also described, is a CRISPR-Cas9-based gene deletion protocol in Toxoplasma using 50 bp homologous regions for homology-dependent recombination (HDR). By quantifying the inhibition efficacies of LHVS in wild-type and TgCPL (Toxoplasma cathepsin L-like protease)-deficient parasites, it is shown that LHVS inhibits wild-type parasite growth more efficiently than &#916;cpl growth, suggesting that TgCPL is a target that LHVS binds to in Toxoplasma. The high sensitivity and easy operation of this luciferase-based growth assay make it suitable for monitoring Toxoplasma proliferation and evaluating drug efficacy in a high throughput manner.

Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

Presented here is a protocol to evaluate the inhibition efficacy of chemical compounds against in vitro intracellular growth of Toxoplasma gondii using a luciferase-based growth assay. The technique is used to confirm inhibition specificity by genetic deletion of the corresponding target gene. The inhibition of LHVS against TgCPL protease is evaluated as an example.

Bestimmung der chemischen Inhibitor-Effizienz gegen intrazelluläre toxoplasma Gondii Wachstum mit einem Luziferase-basierten Wachstumstest

Toxoplasma gondii is a protozoan pathogen that widely affects the human population. The current antibiotics used for treating clinical toxoplasmosis are ...