Das Protokoll ermöglicht die Bewertung von Wirtsreaktionen auf eine Vielzahl von Krankheitserregern und Impfstoffformulierungen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie die Bewertung der bakteriellen Belastung und Immunantworten in vivo ermöglicht, mit einem landebaren Tiermodell. Das demonstriert Kacy Yount, eine Studentin aus meinem Labor.
Bestätigen Sie für die Immunisierung einen Mangel an Reaktion auf Zehenkniff in einer anästhesierten, sechs bis zwölf Wochen alten Maus, und laden Sie eine Insulinspritze mit einem Milliliter, die mit einer 28,5-Meter-Nadel mit einem 0,1 Milliliter des Interessenimpfstoffs ausgestattet ist. Halten Sie die Spritze in einem 45-Grad-Winkel, wobei die Abschrägung nach oben gerichtet ist, legen Sie die Nadel etwa fünf Millimeter in das Delta der Maus ein und injizieren Sie den Impfstoff. Halten Sie die Nadel in den Muskel für fünf bis zehn Sekunden eingeführt, dann drehen Sie die Spritze um 180 Grad, so dass die Abschrägung nach unten, um eine Dichtung zu schaffen, und um Impfstoff Leckage zu verhindern, bevor langsam die Nadel von der Injektionsstelle zurück.
Dann kehren Sie die Maus in ihren Käfig zurück, mit Überwachung, bis zur vollständigen Wiederherstellung. Etwa zwei Wochen nach dem Aufsteigern, immunisierte Mäuse infizieren. Greifen Sie eine anästhesierte Maus durch die Schürzung des dorsalen Thorax, hinter den Schulterblättern und Hals, und positionieren Sie die Maus aufrecht, um auf die Nase zuzugreifen.
Mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze, langsam 20 bis 25 Mikroliter des bakteriellen Inokulums von Interesse auf jeden Nare des Tieres auftragen, halten Sie die Maus, bis das gesamte Inokulum eingeatmet wurde. Dann liefern Sie eine gleiche Menge an sterilem PBS an eine Gruppe von Mäusen als negative Kontrolle. Legen Sie am entsprechenden experimentellen Endpunkt eine infizierte Maus-Ventralseite auf eine Sezierplatte und sichern Sie die Gliedmaßen.
Befeuchten Sie den Körper mit 70% Ethanol, und verwenden Sie Zangen, um die Haut unter dem Bauch in der Mitte des Beckens zu umklammern. Mit einer scharfen Schere, machen Sie einen vertikalen Schnitt bis zum Unterkiefer, und sezieren Sie die Haut von der Peritonealwand. Bewegen Sie die Haut an die Seiten des Schlachtkörpers, um ein ungehindertes Feld für die sterile Organernte zu schaffen, und greifen Sie das intakte Peritoneum unterhalb des Brustkorbs, an oder in der Nähe der Leber.
Schneiden Sie das Peritoneum in Richtung des Brustkorbs, um den unteren Verdauungstrakt freizulegen, und bewegen Sie den Doppelpunkt nach links, um die Milz zu offenbaren. Mit gekrümmten Zangen, greifen Sie die Milz, und sezieren Sie das Bindegewebe mit der Schere. Dann legen Sie die Milz in eine 15 Milliliter konische Röhre mit 3 Milliliter RPMI und 5% fetalem Rinderserum auf Eis.
Verwenden Sie Zangen, um den Brustkorb beim Xyphoidenprozess zu stabilisieren, und schneiden Sie die Membran auf. Die Lunge sollte sich entleeren und in Richtung Der Wirbelsäule fallen. Schneiden Sie den Brustkorb an den Seiten, um die Brustplatte zu entfernen, und schneiden Sie die Lungenarterien und Venen, um den oberen Lappen der rechten Lunge zu isolieren und zu entfernen.
Fixieren Sie den Lappen in einem 15 Milliliter konischen Rohr von 10%neutral gepuffertem Formalin bei Raumtemperatur für mindestens 24 Stunden, und isolieren Sie die verbleibenden Lappen der rechten und linken Lunge. Dann legen Sie Lappen in einem 15 Milliliter konischen Rohr, enthält zwei Milliliter von 1%Casein in PBS auf Eis. Verwenden Sie einen Ein-Milliliter-Pipettier mit Spitze, um das Blut zu sammeln, das die Brusthöhle füllt, und übertragen Sie das Blut in eine vorbeschriftete 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhre auf Eis.
Entfernen Sie die Ohrspeicheldrüsen, sublingualen und submaxillären Drüsen und Lymphknoten, die die Luftröhre bedecken, und öffnen und entfernen Sie die Schutzmembranen, die die Luftröhre umgeben. Mit feinen Zangen und Scheren, trennen Sie sorgfältig die Luftröhre von der Speiseröhre, und jedes andere Bindegewebe von der Oberseite der Schlüsselbeine bis zum Boden des Unterkiefers. Verwenden Sie Zangen, um die Luftröhre zu halten, und schneiden Sie die Luftröhre an der Oberseite des Schlüsselbeins.
Ziehen Sie die Luftröhre nach unten, um die Elastizität zu maximieren, und schneiden Sie die Luftröhre an der Unterkieferunterkiefer, direkt über dem Kehlkopf, isolieren etwa einen Zentimeter Gewebe. Legen Sie das Organ dann in ein vorbeschriftetes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr, das 0,3 Milliliter 1%Casein in PBS auf Eis enthält. Drehen Sie nun die Maus für einen klaren Zugang zur Nase und sprühen Sie den Kopf mit 70% Ethanol.
Greifen Sie das Tier direkt hinter dem Schädel manuell und schneiden Sie mit einer Schere das weiche Fleisch der Schnarbe weg, beginnend vom Nasenboden und nach oben. Entfernen Sie das Fell, die Haut und die Schnurrhaare um die Nase herum, und legen Sie die Spitzen einer gekrümmten Schere in die Nares mit den nach unten gerichteten Kurven ein. Öffnen Sie den Nasengang zu den Augen und bilden Sie eine V-ähnliche Formation.
Verwenden Sie dann feine Zangen, um das Nasenseptum und Weichgewebe innerhalb der Formation zu sammeln, und legen Sie das Gewebe in einem vorbeschrifteten 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr mit 0,3 Millilitern 1%Casein in PBS, auf Eis. Um das Lungengewebe zu verarbeiten, übertragen Sie den gesamten Inhalt der Lungenprobe in einen sterilen 15 Milliliter Dounce Homogenisator und verwenden Sie einen Stößel, um das Gewebe zu homogenisieren. Dissoziieren Sie die Probe, bis keine großen Gewebepartikel übrig bleiben, und geben Sie die homogenisierte Suspension in das ursprüngliche 15-Milliliter-Rohr zurück.
Entfernen Sie einen 0,3 Milliliter Aliquot für die Beschichtung koloniebildender Einheiten, und sammeln Sie den Rest des Homogenats durch Zentrifugation. Aliquot 0,5 Milliliter Überstand in vorbeschrifteten Mikrozentrifugenröhren zur Lagerung bei 20 Grad Celsius bis zur Zytokinexpressionsanalyse durch Eliza. Dann, seriell verdünnen 0,1 Milliliter Aliquots der beiseite gelegten homogenisierten Lungensuspension in 0,9 Milliliter sterilen PBS pro Verdünnung, und verwenden Sie einen sterilen Dreieckstreuer auf Platte 0,1 Milliliter jeder empirisch gewählten Verdünnung auf vorbeschrifteten 10%Bordet-Gengou plus Streptomycinplatten.
Hier werden repräsentative optische Dichte 600 Messungen und Berechnungen gezeigt, um eine bakterielle Suspension mit einer optischen Dichte zu erreichen, um ein hundertfach verdünntes bakterielles Inokulum vorzubereiten, das Mäusen zugeführt werden soll. Nach sieben Tagen Impfantigenstimulation produzieren immunisierte Milzzellen aus der Kombinationsimpfstoffgruppe Interferon-Gamma und IL17, während sie IL5 deutlich nach unten regulieren und einen T-Helfer, einen T-Helfer 17 Polarisation der Immunantwort während einer B-Pertussis-Infektion, fördern. Die Aufzählung von Bakterien, die sich aus Atemwegsproblemen einer B-Pertussis-infizierten Maus erholt haben, kann verwendet werden, um die schützende Wirkung des Impfstoffs von Interesse zu bewerten.
Arbeiten Sie so schnell und effizient wie möglich, um Gewebenekrose zu vermeiden, und lagern Sie das isolierte Gewebe auf Eis, um die Lebensfähigkeit der zurückgewonnenen Bakterien zu erhalten. ELISpot-Flow-Zytometrie und DNA- und RNA-Isolation können durchgeführt werden, um Immunzellen zu bewerten, die Analytproduktion zu analysieren und epigenetische und transkriptomische Analysen zu ermöglichen. Bei der Arbeit mit Infektionserregern wie Bordetella pertussis ist es wichtig, daran zu denken, die entsprechende PSA zu tragen und in einem zertifizierten Biosicherheitsschrank zu arbeiten, um die Übertragung von Krankheitserregern zu verhindern.
Dieses Protokoll beschreibt die CFU-Aufzählung aus den Atemwegen, insbesondere dem Nasenrachnx. Um Fragen im Bereich der Impfstoffe und Infektionskrankheiten über die gezielte bakterielle Besiedlung in der Nase zu beantworten.
