Mit optogenetischer Manipulation bestimmter neuronaler Populationen oder Hirnregionen kann das Verhalten bei frei beweglichen Tieren mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung verändert werden. Durch den Einsatz verschiedener optogenetischer Werkzeuge in Kombination mit chronisch implantierten optischen Fasern kann eine Vielzahl neuronaler Modulationen und Verhaltenstests durchgeführt werden. Das ultimative Ziel der Optogenetik ist die Modulation neuronaler Schaltkreise mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung im verhaltenden Tier.
Im Gegensatz zu pharmakologischen oder elektrischen Manipulationen ermöglicht die Optogenetik die präzise Kontrolle bestimmter Zelltypen auf neuronalen Schaltkreisen. Optogenetik ist der perfekte Weg, um bestimmte Zelltypen in speziell definierten Regionen während des Verhaltens zu zielen und die direkten Auswirkungen von Veränderungen in solchen Mikrokreisläufen zu untersuchen. Wir werden nun einen Schritt zur Schrittführung vorstellen, wie man Optogenetik in einer frei beweglichen Maus vorbereitet und pflanzt und durchführt.
Zur Herstellung des optischen Implantats eine keramische Ferrule flach seite oben in eine Bank vise legen. Streifen Sie den Code einer 200 Mikrometer Durchmesser Glasfaser, mit einem Faser-Abisolierwerkzeug und schneiden Sie zwei bis drei Zentimeter non Stücke mit einem Keramikfaser-Schreiber. Legen Sie das Stück Glasfaser in die Keramikferrule dann legen Sie einen Tropfen einen Superkleber an der flachen Seite mit einem Injektionskanon.
Auf der runden Seite der Keramikferrule die Glasfaser so kurz wie möglich schneiden und das Vorimplantat an einem Ferrule-Polierpuck platzieren, um die runde Seite auf vier verschiedenen Veröffentlichungspapieren zu polieren. Danach schneiden Sie die Glasfaser auf der flachen Seite der Keramikferrule auf die für die Implantation benötigte Länge. Verwenden Sie einen Maus-Gehirnatlas, um die Länge des Implantats zu berechnen.
Das Implantat muss direkt über dem Interessengebiet enden. Vor der Implantation wird eine Anästhesie angewendet. Die präzise und ästhetische Technik wird im Manuskript beschrieben.
Wenn die Maus einen tiefen Zustand der Anästhesie erreicht, legen Sie sie auf eine Heizplatte und fixieren Sie den Kopf in einem stereotaktischen Rahmen. Fixieren Sie die Nase und die Zähne vorne und die Ohren auf beiden Seiten. Tragen Sie eine Algesie mit einem Cuprofen subcuntanely in den Rücken der Maus auf und tragen Sie undurchsichtige Augensalbe auf beide Augen auf, um sie vor dem Trocknen zu schützen.
Befeuchten Sie das Haar auf der Kopfhaut mit einem nassen Papiertuch und schneiden Sie es dann mit einer Schere ab. Achten Sie darauf, alle lockeren Haare mit einem nassen Papiertuch zu entfernen. Verwenden Sie einen Baumwollstab, um die Kopfhaut mit einer Jodtindose zu desinfizieren.
Heben Sie die Kopfhaut über die Region von Interesse mit einer Pinzette und schneiden Sie einen Zentimeter entlang der Mittellinie. Um den Schädel für die Implantation aufzurauen, tragen Sie eine kleine Menge Phosphorsäure auf die Narbe auf und lassen Sie sie 15 Sekunden lang wirken. Entfernen Sie alle Säure mit einem Baumwollstab und spülen Sie die Narbe zweimal mit Natriumchlorid.
Für eine ordnungsgemäße Injektion berechnen Sie den F-Faktor für einzelne Koordinaten. Legen Sie einen Glaskanonin in den stereoktatischen Rahmen und lokalisieren Sie ihn direkt über Bregma. Jetzt Null das Koordinatensystem und verschieben Sie die Glaskanüle nach Lambda.
Berechnen Sie den F-Faktor mit der folgenden Formel. Bregma minus Lambda geteilt durch 4,2 entspricht dem F-Faktor. Genaue Koordinaten sind sehr wichtig für Injektion und Implantation, denn sonst, wenn die falsche Struktur stimuliert wird, dann sind die Verhaltenseffekte unspezifisch.
Alle Mäuse haben minimale Abweichungen in der Größe ihres Schädels, daher ist der Koeffizient absolut obligatorisch. Verwenden Sie die angepassten Koordinaten, um die Position auf der Narbe direkt über der Struktur des Interesses zu finden. Verwenden Sie eine Injektionskanüle, um ein Loch in den Schädel zu bohren, indem Sie die Kanüle an der Stelle drehen.
Um eine Viruslösung in die mit der Spritze verbundene Glaskanüle zu nehmen, legen Sie einen Tropfen Natriumchlorid auf den Schädel und ein Stück Pirophen auf die Oberseite. Legen Sie einen Tropfen von zwei Mikroliter-Viruslösung auf die Pirophen und senken Sie die Spitze der Glaskanüle in das Virus. Tragen Sie unterdruck und warten Sie, bis die Viruslösung von der Kanüle übernommen wird.
Null zu dieser Koordinate, wenn die Spitze des Virus mit Kanüle auf der Ebene des Schädels ist und langsam in das Bohrloch auf die niedrigste Position der Injektionsseite absenken. Tragen Sie eine kleine Menge an positivem Druck mit der Spritze auf, bis der Meniskus abgesenkt ist. Lassen Sie das Virus für zwei bis drei Minuten verbreiten, bevor Sie die Glaskanüle nach oben in die nächste Position bewegen.
Entfernen Sie die Glaskanüle sehr langsam und entsorgen Sie sie nach der endgültigen Injektion. Bereiten Sie nun den Schädel für die Implantation vor. Den Schädel mit Druckluft trocknen, die Grundierung mit dem entsprechenden Stick auftragen und 15 Sekunden trocknen lassen.
Tragen Sie die Bindung mit dem gleichen Stick auf und härten Sie sie 20 Sekunden lang mit UV-Licht aus. Das Implantat in den entsprechenden Halter legen und die Spitze der Glasfaser direkt über dem Bohrloch positionieren und vorsichtig absenken. Beenden Sie das Absenken des Implantats, wenn das verbleibende Ventil aus Superkleber den Schädel berührt.
Die Implantation von optischen Fasern kann auch für bilaterale Strukturen wie den Hippocampus erfolgen. Dies ermöglicht eine leichte Stimulation in beiden Hemisphären gleichzeitig oder ermöglicht die Stimulation zweier unterschiedlicher Strukturen. Es ist auch möglich, das Virus an einem anderen Ort als dem Glasfaserimplantat zu injizieren.
Wenn die Injektion und Implantation in verschiedenen Regionen durchgeführt werden, bohren Sie alle notwendigen Löcher nach dem Auftragen von Phosphorsäure, aber vor der Zweikomponenten-Haftung. Überprüfen Sie noch einmal, ob der Schädel noch vollständig trocken ist, dann geben Sie flüssigen Zahnzement um das Implantat und in der Umgebung dann für 20 Sekunden mit UV-Licht heilen Zwei mehr weniger Zement in völlig pelzfreien und getrockneten Schädelbereich. Härten Sie jede Schicht mit UV-Licht.
Um die Operation zu beenden, wenden Sie Jodsalon auf die gesamte Wunde an. Lassen Sie die Nasen- und Ohrfixierung los, bringen Sie die Maus in einen frischen Käfig und legen Sie sie unter eine Heizlampe, um den Verlust von Körperwärme zu vermeiden. Überprüfen Sie seinen Gesundheitszustand mindestens einmal am Tag und es wird operative und Algesie nach drei Tagen, wenn nötig.
Nach zwei Wochen der Genesung können Mäuse für Verhaltensexperimente verwendet werden. Öffnen Sie die Pulser-Software, und wählen Sie den USB-Kom-Anschluss aus, an den die Lichtquelle angeschlossen ist. Wählen Sie den Betriebsmodus 3, damit eine externe Software die Lichtquelle steuern kann.
Wählen Sie die richtige Einstellung für 20 Hertz Stimulation mit fünf Millisekunden Lichtimpuls. Um die Division zu suchen, um mit dem Pulser zu kommunizieren, drücken Sie auf die Startsequenz. Dieser Status bleibt bestehen, bis die Experimente abgeschlossen sind.
Erstellen Sie nun ein neues Experiment in EthoVision XT, gehen Sie zur Datei, wählen Sie neue Aus-Vorlage aus und wählen Sie eine vordefinierte Vorlage anwenden aus. Wählen Sie Live-Tracking und wählen Sie die Kamera mit Quelle und bestätigen Sie die angeschlossene Puslar Gen-Eye-Cam. Wählen Sie die Maus als das Tier, das aufgezeichnet werden soll.
Wählen Sie die Arena-Vorlage, das offene Feldquadrat und die Zonenvorlagenmitte, den Rahmen und die Ecken aus. Bestätigen Sie ein Motiv, das verfolgt werden soll, und wählen Sie Mittelpunkt, Nasenpunkt und Schwanzbasis aus. Bestätigen Sie, dass die Tierfarbe im Vergleich zum Hintergrund dunkler ist und die empfohlene Abtastrate zum Beenden des Schritts angezeigt wird.
Benennen Sie das entsprechende Experiment, und wählen Sie einen zu speichernden Speicherort aus. Bis Sie die Arena-Einstellungen gefunden haben, öffnet die Kamera automatisch ein Hintergrundbild. Passen Sie die vordefinierten Zonen an die reale Arena an, indem Sie den Pfeil und die beiden Symbole auf der rechten Seite verwenden.
Wenn einige Zonen nicht erforderlich sind, löschen Sie sie. Drücken Sie die Zeichnungsskala, um zu kalibrieren, und legen Sie eine Linie von einer Ecke des Labyrinths zur anderen. Geben Sie die Länge der realen Entfernung in Zentimetern ein.
Wiederholen Sie dies für die andere Achse. Um die Einstellungen für die Teststeuerung zu definieren, bereiten Sie die Hauptregel vor, indem Sie die Konditionszeit auf 20 Minuten anpassen. Die Bedingung für Star Trek sollte, wenn sich der Betreff zwei Sekunden lang in der Arena befindet, für einen automatischen Status der Verfolgung sein, wenn sich die Maus in der Arena befindet.
Um eine Unterregel für die Lichtstimulation zu erstellen, gehen Sie zu Strukturen, mehr und wählen Sie Unterregel. Platzieren Sie es unter der Hauptregel und verteilen Sie die beiden Boxen. Gehen Sie zu Bedingungen, Zeit und geben Sie ihm einen Namen wie Licht auf einem, anpassen Bedingung ist mit nach fünf Minuten erfüllt.
Platzieren Sie das Feld direkt hinter dem Regelstartfeld der Unterregel. Gehen Sie zu Aktion benutzerdefinierte Hardware und nennen Sie es mit Licht auf einem. Wählen Sie die Aktion aus, um als:Ich lege eine Hoch-Wert-Aktion.
Platzieren Sie das Feld direkt hinter dem Zustandsfeld. Wiederholen Sie die Schritte, um Licht aus zu programmieren. Gehen Sie nun zu Strukturen, Unterregelverweis und überprüfen Sie, ob der Verweis zur richtigen Unterregel gehört.
Wählen Sie Startbedingungen als ohne Verzögerung und Startbedingungen als einmal pro Startbedingung ausgeführt. Platzieren Sie das Referenzfeld zwischen den zusätzlichen Büchern eins und Bedingung Bücher zwei der Hauptregel. Definieren Sie nun die Erkennungseinstellungen, um dem System anzuzeigen, was es verfolgen soll.
Legen Sie eine Testmeilen in die Arena und wählen Sie automatisierte Einrichtung. Wählen Sie Nagetier als Tiertyp und verwenden Sie den Mauszeiger, um ein Kästchen um die Mäuse in der Arena zu zeichnen. Bestätigen Sie die Ergebnisse der Pflegefrage mit ja.
Für das Freifeldexperiment bringen Sie die experimentelle Maus direkt vor dem Experiment in den Verhaltensraum, um ein angemessenes Maß an Angst zu gewährleisten. Koppeln Sie die Maus ein Schlitz der Lichtquelle, indem Sie sie sanft auf das Gitter des Käfigs drücken. Legen Sie es in einen Wartekäfig mit frischem Wurf für 10 Minuten, um sich an das Lichtkabel zu gewöhnen.
Starten Sie die Erfassung, indem Sie die Stopp-Taste drücken und Sie XT sehen. Übertragen Sie die Maus aus dem wartenden Käfig in die obere linke Ecke des offenen Feldes. Lassen Sie das Gesichtsfeld der Maus während des Experiments und halten Sie Ruhe. Nach 20 Minuten, wenn das Experiment abgeschlossen ist, entfernen Sie die Maus aus dem Labyrinth, trennen Sie das Lichtkabel und legen Sie es wieder in seinen eigenen Käfig.
Durch eine Scheckvisualisierung können die Unterschiede in der Mittenzeit zwischen Licht aus und Licht auf Flächen direkt sichtbar werden. Die Maus verbringt weniger Zeit in der Mitte, wenn das Licht eingeschaltet ist. Für das Barnes-Labyrinthexperiment bringen Sie alle versuchsweise Mäuse etwa eine Stunde vor dem Experiment in den Verhaltensraum.
Bereiten Sie das Barnes-Labyrinth vor, indem Sie alle Löcher außer einem schließen, und jetzt, wo eine Escape-Box platziert wird. Verbinden Sie eine Maus in der Lichtquelle an beiden Implantaten und legen Sie sie direkt in die Mitte des Barnes-Labyrinths. Drücken Sie start und müssen Sie das nächste T besuchen und den Karton entfernen.
Seien Sie darauf vorbereitet, die Testversion manuell zu stoppen, nur für den Fall, dass die Software den gesamten Übergang nicht erkennt. Nehmen Sie die Maus aus dem Labyrinth und entfernen Sie die Verbindung zum Lichtkabel. Bei der Durchführung, Deminitäts- und Gedächtnisaufgabe wird nicht nur die unmittelbare Wirkung der Manipulation untersucht, sondern auch die langfristigen Auswirkungen von Manipulationen beim Erwerb, Konsolidierung oder Abrufen.
Für die Datenanalyse finden Sie den Behandlungszustand behandelt oder kontrolliert, gehen Sie zum Verschachteln und wählen Sie den Testkontrollstatus aus. Wählen Sie das Zustandsintervall von der Elementaktion Star Trek bis zur Elementaktionsleuchte auf eins aus. Platzieren Sie den Nistkasten zwischen der Filterkastenbehandlung und dem entsprechenden Ergebnisfeld.
Dieses definierte Intervall ist von einem. Wiederholen Sie die Schritte für Intervalle auf einem von zwei und auf zwei sowie für die Kontrollgruppe. Definieren Sie auch die zu analysierenden Parameter im Analyseprofil.
Wählen Sie die abhängige Variable in der Zone aus, und wählen Sie den Zonenmittelpunkt, den Körperpunkt, den Mittelpunkt aus, und gehen Sie mit der Teststatistik. Wählen Sie Häufigkeit, kumulative Dauer aus, und lassen Sie es die erste uhr anzeigen. Fügen Sie auch Entfernungsverschiebung als Variable hinzu.
Mit diesem Profil sind die Daten für die Zeit verfügbar, die in der Mitte, in den Mitteneinträgen und in der Entfernungsverschiebung verbracht wird. Um Daten aus jeder Division zu extrahieren, gehen Sie zu den Ergebnissen und wählen Sie Statistiken und Diagramme aus, drücken Sie die Berechnung, um die analysierten Daten anzuzeigen. Drücken Sie exportdaten, und wählen Sie die Teststatistiken und den zu speichernden Speicherort aus.
Die exportierten Daten werden als Excel-Datei und mit individuellen Werten für jede Maus gespeichert. Gehen Sie außerdem zur Heatmap-Visualisierung und drücken Sie Heatmaps, wählen Sie Versuche auf der rechten Seite aus, um individuelle Heatmaps für jede Maus und jeden Versuch anzuzeigen. Machen Sie einen Rechtsklick auf die Maus und exportieren Sie die Heatmaps als Bilder.
Später öffnen Sie die Excel-Datei den Computer und berechnen sie den Mittelwert und standard Euro SCM für alle vier Versuche und jede gemessene Konditionierungsgruppe. Um Diagramme und Sigma-Plots zu generieren, kopieren Sie die Mittelwerte und SCM in die richtige Reihenfolge von der zusätzlichen Datei in sigma-Plot. Die Zeilen müssen die Daten für eine, auf einem enthalten, und die Spalten enthalten Test,Mittelwert und SCM-Hertz.
Wählen Sie alle drei Spalten aus, und erstellen Sie Diagramme. Wählen Sie das Balkenfeld aus, und wählen Sie das nicht gruppierte Feld mit dem Pfeil aus. Beschriften Sie das gesamte Diagramm, gehen Sie nach Hause, wählen Sie das Diagrammfeld aus und drücken Sie den Export.
Wählen Sie den Zielordner aus, und wählen Sie die Metadatei als Format aus. Um Statistiken für erhaltene Daten zu berechnen, kopieren Sie rechte Daten von Xcel aus einem nach eins, et cetera und in einzelne Spalten des Sigma-Plots. Markieren Sie die Spalten, die Sie vergleichen möchten, und gehen Sie zur Analyse, wählen Sie T-Test und drücken Sie die Ausführung.
Schließlich können Verhaltensdaten in Loslassen und Aufprobe mit zusätzlicher Heatmap-Spezialisierung dargestellt werden. Im Offenen Feldexperiment wird bei der Lichtstimulation von Channelrhodopsin2 und pyramidenförmigen Neuronen die mittlere Dauer verringert, was auf erhöhte Angstniveaus hinweist. Durch die Immunhistochemie können die Injektionsstelle und die Expression des Virus bestimmt werden, auch an der Spezifität an der speziellen Cre-abhängigen Mauslinie kann validiert werden.
Man kann deutlich sehen, dass die Leichte Stimulation von Channelrhodopsin2 den Geist Neuronen dieser spezifischen Kortexregion erhöht Angstniveaus, im Vergleich zu Baseline Angst vor dieser Stimulation. Diese unmittelbare Wirkung der Manipulation auf das Verhalten ist der Grund, warum optogenetische heute für so viele Forschungsfragen zum Verhalten verwendet wird. Dieses Verfahren kann für die optogenetische Modulation jedes gewünschten Zelltyps oder neuronalen Schaltkreises im Mausgehirn verwendet werden.
Durch die Kombination dieses Verfahrens mit geeigneten Verhaltenstests für Ihre Forschung kann ein tieferer Einblick in neuronale Schaltkreise gewonnen werden, die an Verhaltensweisen und Krankheiten von Interesse beteiligt sind.
